Name: high-throughput identification of synergistic drug combinations by the overlap2 method
Uploaded: 2018-05-21T14:00:00
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Ce travail a été soutenu par une subvention de démarrage du département de pathologie, Université de l’Utah à J.C.S.B.

1. identifier la synergie des Mutants de prédiction du Dataset génétique chimique par la méthode2 de chevauchement (O2M)
NOTE : Ceci est la méthode d’identification des mutants de prédiction de synergie à l’aide de l’ensemble de données publiée de Nichols et al.. 17 chez e. coli. Toutefois, cela peut être fait sur n’importe quel dataset chimique-génétique et de microorganismes. Ces ensembles de données contie...

<ol>
	<li>Michael, C. A., Dominey-Howes, D., Labbate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Antimicrobial+Resistance+Crisis:+Causes,+Consequences,+and+Management.">The Antimicrobial Resistance Crisis: Causes, Consequences, and Management.</a> Front Public Health. 2, 145 (2014).</li><li>Butts, A., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+Drug+Discovery:+Something+Old+and+Something+New.">Antifungal Drug Discovery: Something Old and Something New.</a> PLOS Pathogens. 8 (9), e1002870 (2012).</li><li>Roemer, T., Krysan, D. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+Antibacterial+and+Antibiotic+Effects+of+Bisbenzylisoquinoline+Alkaloids+on+Clinical+Isolates+of+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+Aureus+(MRSA).">Synergistic Antibacterial and Antibiotic Effects of Bisbenzylisoquinoline Alkaloids on Clinical Isolates of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA).</a> Molecules. 16 (12), 9819 (2011).</li><li>Jia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+drug+combinations:+interaction+and+network+perspectives.">Mechanisms of drug combinations: interaction and network perspectives.</a> Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 111-128 (2009).</li><li>Wambaugh, M. A., Shakya, V. P. S., Lewis, A. J., Mulvey, M. A., Brown, J. C. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+biology+of+a+fungal+meningitis+pathogen+using+chemical+genetics.">Unraveling the biology of a fungal meningitis pathogen using chemical genetics.</a> Cell. 159 (5), 1168-1187 (2014).</li><li>Cokol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+exploration+of+synergistic+drug+pairs.">Systematic exploration of synergistic drug pairs.</a> Mol Syst Biol. 7, 544-544 (2011).</li><li>Borisy, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+discovery+of+multicomponent+therapeutics.">Systematic discovery of multicomponent therapeutics.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (13), 7977-7982 (2003).</li><li>Tang, J., Wennerberg, K., Aittokallio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+synergy?+The+Saariselk&#228;+agreement+revisited.">What is synergy? The Saariselk&#228; agreement revisited.</a> Front Pharmacol. 6, 181 (2015).</li><li>Hsieh, M. H., Yu, C. M., Yu, V. L., Chow, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+assessed+by+checkerboard.+A+critical+analysis.">Synergy assessed by checkerboard. A critical analysis.</a> Diagn Microbiol Infect Dis. 16 (4), 343-349 (1993).</li><li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+Landscape+of+a+Bacterial+Cell.">Phenotypic Landscape of a Bacterial Cell.</a> Cell. 144 (1), 143-156 (2011).</li><li>Chandrasekaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomics+and+orthology-based+design+of+antibiotic+combination+therapies.">Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies.</a> Mol Syst Biol. 12 (5), (2016).</li><li>Pradhan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomic+profiling+of+Plasmodium+falciparum+as+a+tool+to+aid+antimalarial+drug+discovery.">Chemogenomic profiling of Plasmodium falciparum as a tool to aid antimalarial drug discovery.</a> Sci Rep. 5, 15930 (2015).</li><li>Pethe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+screen+in+Mycobacterium+tuberculosis+identifies+carbon-source-dependent+growth+inhibitors+devoid+of+in+vivo+efficacy.">A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy.</a> Nat Commun. 1 (5), 1-8 (2010).</li><li>Diezmann, S., Michaut, M., Shapiro, R. S., Bader, G. D., Cowen, L. 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Synergique petite molécule paires peuvent être un outil puissant dans le traitement des infections microbiennes, et pourtant ils n’ont pas atteint leur potentiel clinique complète car synergiques paires sont difficiles à identifier. Cet article décrit une méthode pour identifier les paires synergiques beaucoup plus rapides que des combinaisons simples par paires. En utilisant des ensembles de données de produits chimiques-génétique, O2M identifie des mutants avec débouchures de gène qui peuvent alors servir ...

Bactéries résistantes aux antibiotiques causent plus de 2 millions d’infections et de 23 000 décès chaque année aux États-Unis selon la CDC1. Nouveaux traitements sont nécessaires pour surmonter ces infections. Stratégies pour identifier ces nouveaux traitements comprennent le développement de nouveaux médicaments antimicrobiens ou la réutilisation des petites molécules approuvés pour d’autres conditions traiter les infections microbiennes2,3,4. Toutefois, la découverte de nouveaux médicaments est très coûteux et long. Réaffectation des médicaments peut ne pas identifier de nouveaux médicaments ou drogues vise5,6. Notre laboratoire se concentre sur une troisième stratégie dite de thérapies de combinaison synergique. Combinaison synergique se produire lorsque deux petites molécules ensemble, ont une efficacité supérieure à l’effet additif de leur efficacité individuelle7. En outre, les combinaisons synergétiques peuvent être efficaces contre un pathogène résistant à l’une des petites molécules dans la paire en plus d’avoir moins d’indésirables effets hors cible, rendant le grand potentiel de8,9, 10.
Synergiques paires sont rares, survenant chez environ 4 à 10 % des drogues combinaisons11,12,13. Ainsi, des techniques traditionnelles telles que les écrans sont difficiles et longues, avec des milliers de combinaisons possibles d’une petite bibliothèque d’une centaine de molécules. De plus, des interactions synergiques généralement est imprévisible de l’activité des composés14. Cependant, les auteurs ont développé une approche de haut débit pour dépister les paires synergiques, appelé le chevauchement2 méthode (O2M)12. Cette méthode, décrite ici, permet l’identification plus rapide et plus efficace de ces paires synergiques. O2M nécessite l’utilisation d’une paire de synergique connue et un ensemble de données de produits chimiques-génétique. Produit chimique-génétique des ensembles de données sont générées lorsqu’une bibliothèque de mutants de knock-out est cultivée en présence de nombreuses petites molécules différentes. Si une molécule dans une paire synergique connue induit le même phénotype d’un mutant de knockout particulière que la deuxième molécule synergique, toute autre petite molécule qui provoque le phénotype de ce même mutant doit aussi agir en synergie avec chaque membre de la dite paire de synergique. Ce raisonnement a été utilisé dans le laboratoire de brun pour identifier synergique antibiotique actif contre Escherichia coli (e. coli) et antifongique synergique en paires actives contre le champignon pathogène Cryptococcus neoformans (C. neoformans)11,12. O2M est non seulement adaptable pour différents agents pathogènes, mais permet le dépistage des grandes bibliothèques de molécules pour identifier des paires synergiques facilement et rapidement. Projection avec le mutant génétique identifié par O2M permet de ne valider que ces petites molécules prévues de synergie. Ainsi, tester une bibliothèque 2 000 molécules pairwise prendrait mois, considérant que s’il y avait seulement 20 molécules dans cette bibliothèque prévue à agir en synergie, maintenant l’essai de synergie a été une question de jours. O2M ne nécessite pas de compétences en programmation, et l’équipement nécessaire est disponible dans la plupart des laboratoires ou des installations de base. En plus de chercheurs qui s’intéressent à des combinaisons de médicaments, analyse O2M est d’intérêt pour toute personne qui a complété un dépistage de drogues et veut étendre leurs succès en identifiant des interactions médicamenteuses importantes. Voici le protocole d’identification synergiques petites molécules chez les bactéries, mais aussi de valider les interactions synergiques prédites dans les dosages connus15,16.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="520">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:179px;">Bioscreen C</td>
			<td style="width:88px;">instrument</td>
			<td style="width:136px;">Growth Curves USA</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy H1</td>
			<td>instrument</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9 broth</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J863-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Casamino Acids</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1424-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-10KG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinic Acid</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12683</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiamine</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>148991000</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2 Dihydrate</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4 Heptahydrate</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chemical-genetics dataset</td>
			<td>dataset</td>
			<td>examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trimethoprim (example input drug; any can be used)</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19552701</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sulfamethoxazole (example test drug; any can be used)</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN15671125</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput identification of synergistic drug combinations by the overlap2 method

Bien que les médicaments antimicrobiens ont considérablement augmenté la durée de vie et de la qualité de vie au 20ème siècle, la résistance aux antimicrobien menace capacité de notre société tout entière pour traiter les infections systémiques. Dans les seuls États-Unis, les infections résistantes aux antibiotiques tuent environ 23 000 personnes par an et le coût environ 20 milliards USD en soins de santé supplémentaires. Une approche pour lutter contre la résistance aux antimicrobien est la thérapie de combinaison, qui est particulièrement utile dans la phase critique au début de l’infection, avant que le micro-organisme infectieux et son profil de résistance de drogue ont été identifiés. De nombreux traitements antimicrobiens recours à des thérapies de combinaison. Cependant, la plupart de ces combinaisons sont additifs, ce qui signifie que l’efficacité combinée est identique à la somme de l’efficacité des antibiotiques. Certaines thérapies de combinaison sont synergiques : l’efficacité combinée est beaucoup plus grande que l’additif. Combinaisons synergiques sont particulièrement utiles car ils peuvent inhiber la croissance des souches résistantes aux médicaments antimicrobiens. Cependant, ces combinaisons sont rares et difficiles à identifier. C’est en raison du nombre considérable de molécules nécessaires pour être analysées d’une manière par paires : une bibliothèque de 1 000 molécules a 1 million de combinaisons possibles. Ainsi, s’est efforcé de prédire des molécules de synergie. Cet article décrit notre méthode de haut-débit pour la prévision des paires synergique petite molécule appelées le chevauchement2 méthode (O2M). O2M utilise des modèles d’ensembles de données chimiques et génétiques pour identifier les mutants qui sont hypersensibles à chaque molécule dans une paire synergique mais pas à d’autres molécules. Le laboratoire brun exploite cette différence de croissance en effectuant un écran haut débit de molécules qui inhibent la croissance du mutant mais pas sauvage-type cellules. Travaux du laboratoire a déjà identifié des molécules qui agir en synergie avec l’antibiotique triméthoprime et le médicament antifongique fluconazole à l’aide de cette stratégie. Ici, les auteurs présentent une méthode à l’écran pour des combinaisons nouvelles synergiques, qui peut être modifié pour les micro-organismes multiples.

Les dosages de damier sont une méthode semi-quantitative pour mesurer les interactions synergiques. Le score final de sortie, FICI, détermine si une combinaison de médicaments est considérée comme synergique (FICI ≤0, 5), sans interaction (0,5 < FICI < 4), ou antagonistes (FICI ≥4.0). La figure 1 illustre comment configurer les gradients de drogue lors d’un essai de damier. La figure 2 illustre les résultats communs. ...

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High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Combinaisons de drogues synergiques sont difficile et fastidieux d’identifier empiriquement. Nous décrivons ici une méthode pour identifier et valider synergiques petites molécules.

Identification de haut débit synergique des associations de médicaments par la méthode2 de chevauchement

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

The overall goal of this methodology is to identify the synergistic molecules, which amplify each others activity, when combined through High-throughput screening. Synergistic drug pairs are a promising strategy, for combating drug resistant infections but they are difficult to identify. This method can identify molecules that interact with existing antimicrobial drugs used to treat infectious diseases.In the long term these combinations, can enter preclinical assessment and eventually improve patient care. The main advantage of this technique is that it can be done with any organism of interest and with any with any library of small molecules. The implications of this technique, extend towards therapy of multiple infectious diseases as it works with any organism of interest.Use a standard spreadsheet to calculate the mean growth score and standard deviation for all the mutants, in the presence of a particular concentration of the small molecule added. Then, calculate the Z scores for each of the small molecule concentration. Then, highlight the gene mutants with significant Z scores.First, grow an E.coli culture in M9 minimal medium, for overnight at 37 degrees Celsius. Then, dissolve the small molecules in dimethyl sulphoxide at a high concentration above 10 milligrams per milliliter. Next, add 100 microliters of M9 medium to each well in a 96 well plate.Pipette an additional 100 microliters of M9 medium in column one such that the volume in that column is 200 microliters. Then, add approximately 10 microliters of the concentrated small molecule solution, in the column one. After adding the small molecules, start diluting it across the X axis of the plate.Continue diluting till there is, 100 microliters in column 11. After mixing column 11, discard 100 microliters from that column. Let there be only medium in column 12 to normalize the data.Next, record the optical density value at 600 nanometers of the overnight culture grown in M9 minimal medium. Then, add two microliters of the culture into each well. Such that there are 1000 cells per well.Then, shake the plate gently. And note the optical density reading at 600 nanometers for zero hour time point. Once the reading is recorded, incubate the plate at 37 degrees Celsius for a day.Again, measure the optical density value at 600 nanometers for 24 hour time point. To perform the checkerboard assay, grow an E.coli culture in M9 minimal medium for overnight at 37 degrees Celsius. Then, add 100 microliters of M9 medium to each well and add an extra 100 microliters of the same medium in column one of a 96 well plate.Next, add the tests small molecules, in each well in column one. And add double the concentration in well A1.Then, create a dilution gradient along the X axis by transferring 100 microliters, from column one to column two. Continue the dilution process, until 100 microliters is added in column 11.After mixing column 11, discard 100 microliters from that column and leave column 12 with only medium without any drugs. Create another gradient for the second drug dilution. To do this, add 100 microliters of the medium containing two X, minimal inhibitory concentration of the input molecule in row A.Then, transfer 100 microliters from row A to B.Continue the dilution process, until 100 microliters is added in row G.After mixing row G, discard 100 microliters from the well.Then inoculate the plate with two microliters of the culture into each well. Such that there are 1000 cells per well. Then, measure the optical density reading at 600 nanometers for zero hour time point.Once the reading is recorded, incubate the plate at 37 degrees Celsius for 24 hours. And then, measure the optical density value at 600 nanometers for 24 hour time point. To conduct High-throughput screening, for synergistic drugs, culture both wild type and synergy prediction mutant cells in M9 minimal medium.Then, add the drugs from the library to the medium. Next, inoculate one plate of library drugs with the wild type and one other plate with synergy prediction mutant bacteria. This plate represents the checkerboard assay used to investigate synergistic drug combinations.In this plate, well F9 with the lowest FICI score of 0.07 indicates that the small molecule pair is synergistic. This plate represents the checkerboard assay to investigate non interacting drug combination. In this plate, the well C3 with the lowest FICI score of 1.0 indicates that the small molecule pair, does not interact with each other.This plate represent the checkerboard assay used to investigate antagonistic drug combinations. In this plate, well A1 with the lowest FICI score of 8.0 indicates that the interaction between, the drug molecules is antagonistic. Next Befeldin A, a small molecule drug in Fluconazole, is used to study the growth of C and U Formins.The plot shows that the growth of both the wild type and the synergy prediction mutant is inhibited slightly and to the same extent. This indicates that Befeldin A and Fluconazole are non-synergistic drug partners. On the contrary, the growth of synergy prediction mutant of C and U Formins is inhibited significantly, in the presence of Refromisyn and Fluconazole.Indicating that the drugs are synergistic partners. Interestingly, the wild type growth is not inhibited at all. Here, the greatest growth difference is observed, between 32 and 49 hours post inoculation.Once mastered, this technique can shorten the time to identify synergistic drug interactions. While carrying out this procedure, it's important to remember not to combine drugs in the last column in the last row of the checkerboard assay. Following this procedure, other methods of synergistic molecule identification, can be performed in order to identify additional synergistic drug interactions.After watching this video, you should have a good understanding of how to use the O2M methodology to identify putative synergy markers in order to find synergistic drug interactions with your organism of interest. Don't forget that while working with some small molecules can be hazardous and any precautions in the MSDS, should be followed while performing this protocol.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Génétique

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High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Extraction d’ADN de haut débit et le génotypage des larves de poisson zèbre 3dpf de découpage Fin

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

High-throughput Identification des séquences régulatrices du gène à l’aide de prochaine génération séquençage du Chromosome circulaire Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identification des empreintes de pas de l'ARN: Complexes protéiques par l'intermédiaire de l'immunoprécipitation d'ARN dans Tandem suivi du séquençage (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...