Name: high-throughput identification of synergistic drug combinations by the overlap2 method
Uploaded: 2018-05-21T14:00:00
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Este trabalho foi apoiado por uma concessão de inicialização do departamento de patologia, Universidade de Utah para J.C.S.B.

1. identificar o Synergy mutantes de previsão do conjunto de dados químico-genética pelo método de2 sobreposição (O2M)
Nota: Este é o método para a identificação de mutantes de predição de sinergia usando o conjunto de dados publicado de Nichols et al. 17 em e. coli. No entanto, isso pode ser feito em qualquer produto químico-genética dataset e microorganismo. Estes conjuntos de dados contém uma biblioteca de mutant...

<ol>
	<li>Michael, C. A., Dominey-Howes, D., Labbate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Antimicrobial+Resistance+Crisis:+Causes,+Consequences,+and+Management.">The Antimicrobial Resistance Crisis: Causes, Consequences, and Management.</a> Front Public Health. 2, 145 (2014).</li><li>Butts, A., Krysan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+Drug+Discovery:+Something+Old+and+Something+New.">Antifungal Drug Discovery: Something Old and Something New.</a> PLOS Pathogens. 8 (9), e1002870 (2012).</li><li>Roemer, T., Krysan, D. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+biology+of+a+fungal+meningitis+pathogen+using+chemical+genetics.">Unraveling the biology of a fungal meningitis pathogen using chemical genetics.</a> Cell. 159 (5), 1168-1187 (2014).</li><li>Cokol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+exploration+of+synergistic+drug+pairs.">Systematic exploration of synergistic drug pairs.</a> Mol Syst Biol. 7, 544-544 (2011).</li><li>Borisy, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+discovery+of+multicomponent+therapeutics.">Systematic discovery of multicomponent therapeutics.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (13), 7977-7982 (2003).</li><li>Tang, J., Wennerberg, K., Aittokallio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+synergy?+The+Saariselk&#228;+agreement+revisited.">What is synergy? The Saariselk&#228; agreement revisited.</a> Front Pharmacol. 6, 181 (2015).</li><li>Hsieh, M. H., Yu, C. M., Yu, V. L., Chow, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+assessed+by+checkerboard.+A+critical+analysis.">Synergy assessed by checkerboard. 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S., Bader, G. D., Cowen, L. 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Pares sinérgicos pequena molécula podem ser uma ferramenta poderosa no tratamento de infecções microbianas, ainda não chegaram a seu potencial clínico completo porque pares sinérgicos são difíceis de identificar. Este artigo descreve um método para identificar pares sinérgicos muito mais rápidos do que a simples combinações emparelhadas. Usando conjuntos de dados químico-genética, O2M identifica mutantes com nocautes de gene que podem ser usados como uma leitura de grandes bibliotecas de tela de pequenas ...

Bactérias resistentes a antibióticos causam infecções mais de 2 milhões e 23.000 mortes anualmente nos Estados Unidos de acordo com o CDC1. Novos tratamentos são necessários para superar essas infecções. Estratégias para identificar esses novos tratamentos incluem o desenvolvimento de novas drogas antimicrobianas ou a redefinição de pequenas moléculas aprovadas para outras condições tratar infecções microbianas2,3,4. No entanto, a descoberta de novas drogas é muito dispendioso e demorado. Redefinição dos objetivos de drogas não pode identificar novos medicamentos ou drogas alvo5,6. Nosso laboratório centra-se em uma terceira estratégia conhecida como terapias de combinação sinérgica. Combinações sinérgicas ocorrem quando duas moléculas pequenas, juntos, têm uma eficácia maior do que o efeito aditivo de suas eficácias individuais7. Além disso, combinações sinérgicas podem ser eficazes contra um patógeno resistente a uma das pequenas moléculas do par, além de ter menos efeitos indesejados de fora do alvo, tornando-os grandes potenciais8,9, 10.
Pares sinérgicos são raras, ocorrendo em aproximadamente 4-10% das combinações de drogas11,12,13. Assim, técnicas tradicionais, tais como telas emparelhadas são desafiadores e demorado, com milhares de combinações possíveis de uma pequena biblioteca de 100 moléculas. Além disso, interações sinérgicas geralmente não podem ser previstas da atividade dos compostos14. No entanto, os autores desenvolveram uma abordagem de alto rendimento para triagem de pares sinérgicos, chamado a sobreposição2 método (O2M)12. Este método, descrito aqui, permite a identificação mais rápida e mais eficiente desses pares sinérgicos. O2M requer o uso de um par de sinérgico conhecido e um conjunto de dados de produto químico-genética. Química-genética conjuntos de dados são gerados quando uma biblioteca de mutantes nocaute é cultivada na presença de muitas moléculas pequenas diferentes. Se uma molécula em um par de sinérgica conhecido induz o mesmo fenótipo de um mutante de nocaute particular como a segunda molécula sinérgica, qualquer outra pequena molécula que provoca o fenótipo daquele mutante mesmo deve também sinergia com cada membro do conhecido par sinérgico. Esta lógica tem sido usada no laboratório marrom para identificar sinérgicas pares antibióticos ativos contra Escherichia coli (e. coli) e pares de drogas antifúngicas sinérgica ativos contra o fungo patogênico Cryptococcus neoformans (C. neoformans)11,12. O2M não só é adaptável para diversos patógenos, mas permite a seleção de grandes bibliotecas de moléculas para identificar pares sinérgicos facilmente e rapidamente. Triagem com o mutante genético identificado por O2M nos permite validar apenas essas pequenas moléculas previstas para a sinergia. Assim, uma biblioteca de 2.000-molécula de teste pairwise levaria meses, Considerando que se havia apenas 20 moléculas nessa biblioteca prevista a sinergia, testes de sinergia agora leva uma questão de dias. O2M não requer conhecimentos de programação, e o equipamento necessário está disponível na maioria dos laboratórios ou instalações do núcleo. Além de pesquisadores interessados em combinações de drogas, análise O2M é de interesse para alguém que concluiu um teste de drogas e quer expandir seus sucessos identificando interações medicamentosas importantes. Abaixo está o protocolo para identificação de moléculas pequenas sinérgicas em bactérias, bem como validando as interações sinérgicas previstas em conhecidos ensaios15,16.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="520">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:179px;">Bioscreen C</td>
			<td style="width:88px;">instrument</td>
			<td style="width:136px;">Growth Curves USA</td>
			<td style="width:117px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy H1</td>
			<td>instrument</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9 broth</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J863-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Casamino Acids</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1424-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-10KG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinic Acid</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12683</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiamine</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>148991000</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2 Dihydrate</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4 Heptahydrate</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chemical-genetics dataset</td>
			<td>dataset</td>
			<td>examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">trimethoprim (example input drug; any can be used)</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN19552701</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sulfamethoxazole (example test drug; any can be used)</td>
			<td>reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN15671125</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput identification of synergistic drug combinations by the overlap2 method

Embora antimicrobianos aumentaram drasticamente a expectativa de vida e qualidade de vida noséculo 20 , resistência aos antimicrobianos ameaça a capacidade da nossa sociedade inteira para tratar infecções sistêmicas. Nos Estados Unidos sozinho, infecções resistentes aos antibióticos matam cerca de 23.000 pessoas por ano e custo de cerca de USD 20 bilhões na área da saúde suplementar. Uma abordagem para combater a resistência antimicrobiana é a terapia de combinação, que é particularmente útil em fase crítica inicial da infecção, antes que o organismo infectante e seu perfil de resistência de droga foram identificados. Muitos tratamentos antimicrobianos usam terapias de combinação. No entanto, a maioria destas combinações são aditivo, significando que a eficácia combinada é igual a soma da eficácia individual aos antibióticos. Algumas terapias de combinação são sinérgicas: a eficácia combinada é muito maior do que o aditivo. Combinações sinérgicas são particularmente úteis porque eles podem inibir o crescimento de cepas resistentes aos medicamentos antimicrobianos. No entanto, estas combinações são raros e difíceis de identificar. Isto é devido o grande número de moléculas que precisava ser testado de forma emparelhada: uma biblioteca de 1.000 moléculas tem 1 milhão de combinações possível. Assim, os esforços foram feitos para prever as moléculas de sinergia. Este artigo descreve o nosso método de alta produtividade de previsão pares sinérgicos pequena molécula conhecidas como a sobreposição2 método (O2M). O2M usa padrões de conjuntos de dados químico-genética para identificar os mutantes que são hipersensíveis a cada molécula em um par sinérgica, mas não a outras moléculas. O laboratório marrom explora esta diferença de crescimento através da realização de uma tela de alta produtividade para moléculas que inibem o crescimento do mutante, mas não selvagem-tipo pilhas. O trabalho do laboratório anteriormente identificadas moléculas que sinergia com o antibiótico sulfametoxazol e o fluconazol antifúngico usando esta estratégia. Aqui, os autores apresentam um método para a tela para romance combinações sinérgicas, que pode ser alterada para vários microorganismos.

Ensaios de xadrez são um método semiquantitativo para medir interações sinérgicas. O placar final de saída, FICI, determina se uma combinação de drogas é considerada sinérgicos (FICI ≤ 0.5), não-interagindo (0.5 < FICI < 4), ou antagônicas (FICI ≥4.0). A Figura 1 ilustra como configurar os gradientes de drogas em um ensaio do tabuleiro de damas. A Figura 2 ilustra os resultados comuns. Considere o crescimento (po?...

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High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Combinações de drogas sinérgica são difíceis e demorados identificar empiricamente. Aqui, descrevemos um método para identificar e validar sinérgicas pequenas moléculas.

Identificação de alta produtividade de combinações de drogas sinérgica pelo método de sobreposição2

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

The overall goal of this methodology is to identify the synergistic molecules, which amplify each others activity, when combined through High-throughput screening. Synergistic drug pairs are a promising strategy, for combating drug resistant infections but they are difficult to identify. This method can identify molecules that interact with existing antimicrobial drugs used to treat infectious diseases.In the long term these combinations, can enter preclinical assessment and eventually improve patient care. The main advantage of this technique is that it can be done with any organism of interest and with any with any library of small molecules. The implications of this technique, extend towards therapy of multiple infectious diseases as it works with any organism of interest.Use a standard spreadsheet to calculate the mean growth score and standard deviation for all the mutants, in the presence of a particular concentration of the small molecule added. Then, calculate the Z scores for each of the small molecule concentration. Then, highlight the gene mutants with significant Z scores.First, grow an E.coli culture in M9 minimal medium, for overnight at 37 degrees Celsius. Then, dissolve the small molecules in dimethyl sulphoxide at a high concentration above 10 milligrams per milliliter. Next, add 100 microliters of M9 medium to each well in a 96 well plate.Pipette an additional 100 microliters of M9 medium in column one such that the volume in that column is 200 microliters. Then, add approximately 10 microliters of the concentrated small molecule solution, in the column one. After adding the small molecules, start diluting it across the X axis of the plate.Continue diluting till there is, 100 microliters in column 11. After mixing column 11, discard 100 microliters from that column. Let there be only medium in column 12 to normalize the data.Next, record the optical density value at 600 nanometers of the overnight culture grown in M9 minimal medium. Then, add two microliters of the culture into each well. Such that there are 1000 cells per well.Then, shake the plate gently. And note the optical density reading at 600 nanometers for zero hour time point. Once the reading is recorded, incubate the plate at 37 degrees Celsius for a day.Again, measure the optical density value at 600 nanometers for 24 hour time point. To perform the checkerboard assay, grow an E.coli culture in M9 minimal medium for overnight at 37 degrees Celsius. Then, add 100 microliters of M9 medium to each well and add an extra 100 microliters of the same medium in column one of a 96 well plate.Next, add the tests small molecules, in each well in column one. And add double the concentration in well A1.Then, create a dilution gradient along the X axis by transferring 100 microliters, from column one to column two. Continue the dilution process, until 100 microliters is added in column 11.After mixing column 11, discard 100 microliters from that column and leave column 12 with only medium without any drugs. Create another gradient for the second drug dilution. To do this, add 100 microliters of the medium containing two X, minimal inhibitory concentration of the input molecule in row A.Then, transfer 100 microliters from row A to B.Continue the dilution process, until 100 microliters is added in row G.After mixing row G, discard 100 microliters from the well.Then inoculate the plate with two microliters of the culture into each well. Such that there are 1000 cells per well. Then, measure the optical density reading at 600 nanometers for zero hour time point.Once the reading is recorded, incubate the plate at 37 degrees Celsius for 24 hours. And then, measure the optical density value at 600 nanometers for 24 hour time point. To conduct High-throughput screening, for synergistic drugs, culture both wild type and synergy prediction mutant cells in M9 minimal medium.Then, add the drugs from the library to the medium. Next, inoculate one plate of library drugs with the wild type and one other plate with synergy prediction mutant bacteria. This plate represents the checkerboard assay used to investigate synergistic drug combinations.In this plate, well F9 with the lowest FICI score of 0.07 indicates that the small molecule pair is synergistic. This plate represents the checkerboard assay to investigate non interacting drug combination. In this plate, the well C3 with the lowest FICI score of 1.0 indicates that the small molecule pair, does not interact with each other.This plate represent the checkerboard assay used to investigate antagonistic drug combinations. In this plate, well A1 with the lowest FICI score of 8.0 indicates that the interaction between, the drug molecules is antagonistic. Next Befeldin A, a small molecule drug in Fluconazole, is used to study the growth of C and U Formins.The plot shows that the growth of both the wild type and the synergy prediction mutant is inhibited slightly and to the same extent. This indicates that Befeldin A and Fluconazole are non-synergistic drug partners. On the contrary, the growth of synergy prediction mutant of C and U Formins is inhibited significantly, in the presence of Refromisyn and Fluconazole.Indicating that the drugs are synergistic partners. Interestingly, the wild type growth is not inhibited at all. Here, the greatest growth difference is observed, between 32 and 49 hours post inoculation.Once mastered, this technique can shorten the time to identify synergistic drug interactions. While carrying out this procedure, it's important to remember not to combine drugs in the last column in the last row of the checkerboard assay. Following this procedure, other methods of synergistic molecule identification, can be performed in order to identify additional synergistic drug interactions.After watching this video, you should have a good understanding of how to use the O2M methodology to identify putative synergy markers in order to find synergistic drug interactions with your organism of interest. Don't forget that while working with some small molecules can be hazardous and any precautions in the MSDS, should be followed while performing this protocol.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identificação de pegadas de RNA: complexos proteicos via imunoprecipitação de RNA em tandem seguido de sequenciamento (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...