Name: sampling strategies and processing of biobank tissue samples from porcine biomedical models
Uploaded: 2018-03-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models at JoVE.com

Forfatterne tak Lisa Pichl for fremragende teknisk bistand.

Alle metoder, der beskrives bruge her vævsprøver fra døde dyr og fuldt ud overholde de tyske retsforskrifter om dyrevelfærd.
1. Volumetry
<ol><li>Submersion teknik til bestemmelse af væv/Organ tætheder (figur 1 og figur 2) 7 , 12 , 16<ol>
<li>Forberede materialer: skalpel vinger, pa...

<ol>
	<li>Aigner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+pigs+as+models+for+translational+biomedical+research.">Transgenic pigs as models for translational biomedical research.</a> J Mol. Med. 88, 653-664 (2010).</li><li>Blutke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Munich+MIDY+Pig+Biobank:+A+unique+resource+for+studying+organ+crosstalk+in+diabetes.">The Munich MIDY Pig Biobank: A unique resource for studying organ crosstalk in diabetes.</a> Mol Metab. 6, 931-940 (2017).</li><li>Klymiuk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-deficient+pigs+provide+new+insights+into+the+hierarchy+of+physiological+derangements+of+dystrophic+muscle.">Dystrophin-deficient pigs provide new insights into the hierarchy of physiological derangements of dystrophic muscle.</a> Hum Mol Genet. 22, 4368-4382 (2013).</li><li>Klymiuk, N., Seeliger, F., Bohlooly, Y. M., Blutke, A., Rudmann, D. G., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailored+pig+models+for+preclinical+efficacy+and+safety+testing+of+targeted+therapies.">Tailored pig models for preclinical efficacy and safety testing of targeted therapies.</a> Toxicol Pathol. 44, 346-357 (2016).</li><li>Renner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permanent+neonatal+diabetes+in+INSC94Y+transgenic+pigs.">Permanent neonatal diabetes in INSC94Y transgenic pigs.</a> Diabetes. 62, 1505-1511 (2013).</li><li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inside+the+first+pig+biobank.">Inside the first pig biobank.</a> Nature. 519, 397-398 (2015).</li><li>Albl, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+sampling+guides+for+porcine+biomedical+models.">Tissue sampling guides for porcine biomedical models.</a> Toxicol Pathol. 44, 414-420 (2016).</li><li>Gundersen, H. J. G., Mirabile, R., Brown, D., Boyce, R. W., Haschek, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+principles+and+sampling+procedures+for+toxicologic+pathologists.">Stereological principles and sampling procedures for toxicologic pathologists.</a> Haschek and Rousseaux's Handbook of Toxicologic Pathology. , 215-286 (2013).</li><li>Howard, C. V., Reed, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. , 1-277 (2005).</li><li>Mattfeldt, T., Mall, G., Gharehbaghi, H., Moller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+surface+area+and+length+with+the+orientator.">Estimation of surface area and length with the orientator.</a> J Microsc. 159, 301-317 (1990).</li><li>Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isector:+A+simple+and+direct+method+for+generating+isotropic,+uniform+random+sections+from+small+specimens.">The isector: A simple and direct method for generating isotropic, uniform random sections from small specimens.</a> J Microsc. 165, 427-431 (1992).</li><li>Tschanz, S., Schneider, J. P., Knudsen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereology:+Planning,+volumetry+and+sampling+are+crucial+steps+for+a+successful+study.">Design-based stereology: Planning, volumetry and sampling are crucial steps for a successful study.</a> Ann Anat. 196, 3-11 (2014).</li><li>Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+shrinkage+and+unbiased+stereological+estimation+of+particle+number+and+size.">Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size.</a> J Microsc. 204, 232-246 (2001).</li><li>Mattfeldt, T., Doerr, W., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereologische+Methoden+in+der+Pathologie+[Stereologic+methods+in+pathology].">Stereologische Methoden in der Pathologie [Stereologic methods in pathology].</a> Normale und pathologische Anatomie. , (1990).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology+and+its+prediction.">The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction.</a> J Microsc. 147, 229-263 (1987).</li><li>Scherle, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+volumetry+of+organs+in+quantitative+stereology.">A simple method for volumetry of organs in quantitative stereology.</a> Mikroskopie. 26, 57-60 (1970).</li><li>Nielsen, K. K., Andersen, C. B., Kromann-Andersen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+the+effects+of+paraffin+and+plastic+embedding+of+the+normal+and+obstructed+minipig+detrusor+muscle+using+the+optical+disector.">A comparison between the effects of paraffin and plastic embedding of the normal and obstructed minipig detrusor muscle using the optical disector.</a> J Urol. 154, 2170-2173 (1995).</li><li>Schneider, J. P., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+mouse+lung+tissue+dimensions+during+processing+for+morphometry:+a+comparison+of+methods.">Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L341-L350 (2014).</li><li>von Bartheld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+particles+in+the+z-axis+of+tissue+sections:+Relevance+for+counting+methods.">Distribution of particles in the z-axis of tissue sections: Relevance for counting methods.</a> NeuroQuantology. 10, 66-75 (2012).</li><li>Baddeley, A. J., Gundersen, H. J., Cruz-Orive, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+surface+area+from+vertical+sections.">Estimation of surface area from vertical sections.</a> J microsc. 142, 259-276 (1986).</li><li>Blutke, A., Schneider, M. R., Wolf, E., Wanke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+hormone+(GH)-transgenic+insulin-like+growth+factor+1+(IGF1)-deficient+mice+allow+dissociation+of+excess+GH+and+IGF1+effects+on+glomerular+and+tubular+growth.">Growth hormone (GH)-transgenic insulin-like growth factor 1 (IGF1)-deficient mice allow dissociation of excess GH and IGF1 effects on glomerular and tubular growth.</a> Physiol Rep. 4, e12709 (2016).</li><li>Hermanns, W., Liebig, K., Schulz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembedding+immunohistochemical+demonstration+of+antigen+in+experimental+polyarthritis+using+plastic+embedded+whole+joints.">Postembedding immunohistochemical demonstration of antigen in experimental polyarthritis using plastic embedded whole joints.</a> Histochemistry. 73, 439-446 (1981).</li><li>Böck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Romeis Mikroskopische Technik. , 1-697 (1989).</li><li>Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D., Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bancroft's theory and practice of histological techniques. , 1-654 (2013).</li><li>Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+estimates+of+alveolar+number+and+size+and+capillary+length+and+surface+area+in+mice+lungs.">Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs.</a> Anat Rec (Hoboken). 292, 113-122 (2009).</li><li>Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+for+stereology+in+lungs.">Sampling for stereology in lungs.</a> Eur Respir Rev. 15, 107-114 (2006).</li><li>Junatas, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+analysis+of+size+and+density+of+hepatocytes+in+the+porcine+liver.">Stereological analysis of size and density of hepatocytes in the porcine liver.</a> J Anat. 230, 575-588 (2017).</li></ol>

Generation af biobank prøve samlinger fra svin dyremodeller kræver robust teknikker og protokoller til bestemmelse af organ/væv diskenheder, den reproducerbare generation af repræsentant, redundant vævsprøver egnet til en bred vifte af forskellige analysemetoder og randomisering af orientering af prøven sektioner for kvantitative stereological analyser. De metoder, der beskrives i denne artikel er tilpasset størrelsen på svin organer og væv, og er blevet udviklet for at effektivt opfylder disse krav<sup class="...

I translationel medicin, svin er i stigende grad fælles til brug som store dyre modeller1,2,3,4,5, på grund af flere fordelagtige ligheder mellem de svin og Human Anatomi og fysiologi og tilgængeligheden af etablerede Molekylær biologiske metoder giver mulighed for generation af skræddersyet, genetisk modificerede gris modeller for en bred vifte af sygdom betingelser1,4.
Men i forhold til gnavere modeller, antallet af dyr af et respektive gris model, der kan være fastsat eksperimenter til enhver tid er begrænset. Dette er på grund af svin generation interval på ca. et år, og de finansielle og tidskrævende indsats kræves for generation af svin modeller og husdyrhold. Enkelte dyr af et svin model, samt de prøver, der kan genereres fra disse svin, er derfor meget værdifulde, især hvis genmanipulerede svin modeller og/eller langsigtede eksperimentelle emner (f.eks., sene komplikationer af kroniske sygdomme) er undersøgt i alderen enkeltpersoner2,6,7.
I forbindelse med enhver undersøgelse, udførelsen af yderligere analyser, som ikke havde været planlagt i den oprindelige eksperimenterende design af undersøgelsen kunne senere vise sig for at være relevante, f.eks., at adresse særskilte spørgsmål som følge af tidligere opdaget uventede resultater. Hvis der ikke findes egnede prøver for sådanne yderligere forsøg, kan uforholdsmæssigt høje omkostninger og tidskrævende udgifter være nødvendigt at generere yderligere svin og vævsprøver. For at være forberedt på sådanne eventualiteter, betragtes generation af biobank samlinger af velbevarede back-up prøver af forskellige organer, væv eller bio-væsker, kvantitativt og kvalitativt egnet til en bred vifte af efterfølgende analyser, som en vigtig tilgang2,6,7. Der følger optimale fordele fra et svin dyremodel, tilgængeligheden af tilstrækkelige biobank prøver også tilbyder den unikke mulighed for at udføre et bredt spektrum af forskellige analysemetoder på identiske prøvematerialer på en multi orgel niveau i den selvsamme individuelle dyr, f.eks.ved uddeling af vareprøver til forskere af forskellige arbejdsgrupper organiseret i en forskning netværk2,6,7. Derudover bidrager de '' fremadskuende '' prøvetagningsmetode i biobanking også til en reduktion af antallet af dyr i en undersøgelse. Fordelene ved svin model biobanking har for nylig påvist i en multi orgel, multiomics undersøgelse, undersøge orgel krydstale i en genetisk modificerede svin model af langsigtede diabetes mellitus, ved hjælp af prøver fra München MIDY gris Biobank 2.
Der er nogle ufravigelige krav biobank prøver skal generelt opfylde for pålidelighed og interpretability af resultaterne af de efterfølgende udført analyser. Prøverne skal genereres reproducerbar, og de skal være repræsentant, dvs, tilstrækkeligt afspejler de interesserede morfologiske og molekylære funktioner i væv/organ prøverne blev taget fra7. For at være egnet til en bred vifte af downstream analysetyper, skal prøverne indtages i tilstrækkelige mængder og forarbejdet i henhold til krav (herunder tid og temperaturforhold) af de forskellige analytiske metoder, herunder beskrivende histopatologisk analyser, såsom cryohistology, paraffin og plast histologi, immunhistokemi, i situ hybridisering, ultrastrukturelle elektron mikroskopisk analyser og klinisk diagnostisk laboratorieanalyser, såvel som Molekylær analyser af DNA, RNA, proteiner og metabolitter.
For at muliggøre vurdering af en bred vifte af forskellige kvantitative morfologiske parametre som tal, mængder, længder eller overfladen områder af forskellige væv strukturer af kvantitative stereological analyser, randomiseret afsnit fly af den histologiske prøver af de respektive organer/væv skal være forberedt7,8,9,10,11. I kvantitative morfologiske undersøgelser, præcis bestemmelse af den samlede mængde af væv, orgel eller orgel rum, prøverne blev taget fra (dvs.reference pladsen) er afgørende betydning7,9 , 12 for at beregne de absolutte mængder af de interesserede parametre inden for de respektive orglet, væv eller organisme. Til sidst, har effekten af embedding-relateret væv krympning under forberedelse af histologiske sektioner til bestemmes og tages i betragtning13. Kvantitative analyser, stereological, navnlig af arkiveret prøver (fast vævsprøver, indlejrede væv blokke, histologiske sektioner, osv.) fra tidligere undersøgelser er derfor undertiden stærkt begrænsede eller endda umuligt12, især hvis volumetry af de respektive organer/væv ikke blev udført, hvis ingen passende stikprøver design blev anvendt for at berettige repræsentative prøver, hvis tal og mængder af tilgængelige enkelte prøver er utilstrækkelige, eller hvis behandlingen af den prøverne er uforenelig med vurdering af den kvantitative morfologiske parametre af interesse. På grund af de mangfoldige mulige påvirke faktorer, egnetheden af arkiv-prøven materialer til analyser af forskellige kvantitative morfologiske parametre kan ikke besvares entydigt, men afhænger af omhyggelig vurdering af hvert enkelt tilfælde.
Således som beliggenhed, størrelse, antal, forarbejdning, trimning retning og orientering af prøver vil potentielt påvirke resultaterne af de efterfølgende analyser, disse faktorer er af stor betydning og skal tages i betragtning i den eksperimentelle design af enhver undersøgelse. Med hensyn til disse aspekter og de særlige træk ved de svin anatomi, omfattende, detaljeret og omfattende prøvetagning retningslinjer tilpasses svin dyremodeller har for nylig blevet etableret, leverer en robust henvisning til standardiserede, reproducerbare , og effektiv generation af redundante, tilstrækkeligt forarbejdede, høj kvalitet prøver fra mere end 50 forskellige svin organer og væv6,7.
De metodologiske beskrivelser og den video tutorial i denne artikel giver detaljerede, illustrative, forståelige, trin for trin instruktioner for praktiske udførelsen af forskellige teknikker til volumetry, prøvetagning af svin væv og organer, og behandlingen af vævsprøver for forskellige downstream analysemetoder. De fremhævede teknikker omfatter metoder til bestemmelse af organ/væv diskenheder og tætheder baseret på principperne om Archimedes og Cavalieri9, herunder bestemmelse af dimensioner af tre-dimensionelle svind af væv i forbindelse med den indlejring i forskellige indlejring medier14 under forarbejdningen til histologisk undersøgelse, anvendelse af praktisk volumen-vægtede systematisk tilfældige stikprøver tilgange, behandling af stikprøven væv prøver for forskellige efterfølgende analyser7,8,9,15, og generation af behørigt orienteret og forarbejdede prøver for potentielle kvantitative stereological analyser7,8, 9,10,11. Ved siden af deres anvendelse i svin biobank projekter er de påviste metoder generelt egnede for alle studier undersøger kvantitative Histò-morfologiske egenskaber af organer/væv. Desuden er systematisk stikprøveudtagning designs især gavnligt for generation af repræsentative prøver i eksperimenter af molekylære analysemetoder til påvisning af overflod, ændringer, fx, RNA'er, proteiner eller metabolitter i forskellige organer og væv.
De næste afsnit giver en kort introduktion til disse metoder, mens deres praktiske resultater er beskrevet i afsnittet protokol.
Bestemmelse af organ/væv diskenheder Bestemmelse af orgel vægte og diskenheder er vigtige i flere eksperimentelle indstillinger, da disse faktorer kan indikere ændringer, potentielt relateret til eksperimentelt undersøgt faktorer af interesse. Det samlede volumen af et organ/væv er også almindeligt kræves for at beregne absolutte kvantitative parametre, (fx, samlede celle nummer), fra stereologically anslåede numeriske volumen tætheder (dvs., at antallet af celler pr. volumen enhed af væv)7,12. Ud over teknikker, der anvender komplekse teknisk udstyr, herunder computertomografi, der er grundlæggende tre praktiske metoder almindeligvis anvendes til at bestemme den absolutte volumen af et organ eller væv. Volumen af et organ kan bestemmes ved "direkte volumetrisk måling" i henhold til princippet om Archimedes, dvs., måle mængden af vand eller saltvand fordrevet af strukturen, når helt neddykket. Men for forholdsvis store svin organer, disse tilgange er upraktisk og udsat for upræcise, da de kræver meget store volumetriske/måling kolber. Mere bekvemt, volumen af et organ/væv kan beregnes ud fra sin vægt og massefylde7,12,16, som effektivt kan bestemmes ved hjælp af "submersion metode"7,12 ,16 (protokol trin 1.1.). Organ/væv diskenheder kan også estimeres ved hjælp af volumetry tilgange baseret på "princippet om Cavalieri" (1598-1647). I enkle vendinger, Cavalieri princippet fastslår, at hvis to objekter er opdelt i planer parallelt med en stelplade, og profiler af sektionerne skære igennem de to objekter på tilsvarende afstande fra stelpladens har de samme områder, de to objekter har den samme mængde. Således kan omfanget af vilkårligt formede objekter estimeres som produktet af deres afsnit profil områder i parallel, lige så Fjern sektion fly og afstanden mellem afsnit planer. Dette er forståeligt med de følgende analogi: overveje to stakke består af det samme antal identiske mønter er placeret side om side, en stak med mønter ordnet stablet oven på hinanden giver en cylindrisk form af mønt stack, og den anden stakken af mønter med off-center placeret mønter (figur 3A). Selv om figurer af begge mønt stakke er forskellige, deres diskenheder er de samme, siden områderne af mønter på et tilsvarende niveau af både stakke (dvs.områder af profiler for parallelle strækninger skære igennem begge mønt stakke i samme afstand fra den jorden) er identiske. Skøn over mængden af svin organer og væv ved hjælp af Cavalieri princip7,12,15 er beskrevet i trin 1.2.
Bestemmelse af omfanget af væv svind relateret til histologisk indlejring I analyser af flere kvantitative morfologiske parametre måles i histologiske væv sektioner, har effekt af embedding-relateret væv svind opstår under væv behandling for histologi at bestemmes og tages i betragtning. Udstrækningen af integrering-relateret væv svind kan være variabel og afhænger af både på vævet, forarbejdningen og den indlejring medium8,13,17,18,19. Generelt, embedding-relaterede ændringer af mængden af en vævsprøve (dvs., for det meste svind) forekomme i alle tre dimensioner af rummet, og derfor påvirker alle dimensionelle parametre anslået af kvantitative stereological analyser8 . Dybest set, udstrækningen af integrering-relateret væv svind, udtrykt som den lineære væv svind faktor (fS), kan estimeres som vist i trin 1.3. og anvendes til korrektion af (svind-følsomme) kvantitative morfologiske parametre14.
Volumen-vægtede systematisk stikprøvekontrol af organer/væv For etablering af en biobank samling af svin orgel/vævsprøver, volumen-vægtede systematisk stikprøveudtagning tilgange som beskrevet i trin 2 har vist sig for at være praktisk tidsbesparende og effektiv teknikker for generation af repræsentant, multi-purpose væv prøver7,8,9,15.
Generation af Isotropic ensartede tilfældige sektioner og lodret ensartede tilfældige sektioner for kvantitative stereological analyser Biobank vævsprøver skal være egnet til en lang række forskellige kvantitative stereological analysemetoder for estimation af parametre, kunne ikke bestemmes uden et tilstrækkeligt forberedt modellen maksimalt. Næsten alle kvantitative stereological parametre kan bestemmes, ved hjælp af "isotropic (uafhængige) ensartede tilfældige (IUR) afsnit"8,9. I IUR sektioner, er den tredimensionale orientering af sektionsplan af vævsprøve randomiseret. Dette kan opnås ved randomisering af vævsprøve i forhold til placeringen af sektionsplan, stilling, som anvendes i "Isector" metode11 (protokol trin 3.1) eller ved randomisering af orientering af sektionsplan forhold til den vævsprøve, som i "Orientering" metode10 (protokol trin 3.2). I vævsprøver, såsom hud- eller slimhinde modellen viser et naturligt er til stede, eller definerede og korrekt identificerbare lodrette akse, forberedelse af "lodret ensartede tilfældige (VUR) afsnit" (protokol trin 3.3.) strengt sectioned i flyet for deres lodrette akse er fordelagtige8,20. For en komplet diskurs af det teoretiske grundlag for IUR/VUR prøveudtagning og en omfattende diskussion af potentielle downstream kvantitative stereological analyser omtales den interesserede læser lærebøger af kvantitative Stereologi i livet Sciences8,9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Carl Roth GmbH, Germany</td>
			<td>Agar (powder), Cat.: 5210.3</td>
			<td>Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany</td>
			<td>Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902</td>
			<td>Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casting molds (metal)</td>
			<td>Engelbrecht Medizin &#38; Labortechnik, Ederm&#252;nde, Germany</td>
			<td>Einbettsch&#228;lchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b</td>
			<td>Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm)</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.&#160; Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard &#38; Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux&#180;s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)</td>
			<td>Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China</td>
			<td>Y10006 and Y10005</td>
			<td>Any other type of standard office foldback clamps will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (anatomical)</td>
			<td>NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811</td>
			<td>Any type of anatomical forceps will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde-solution 4%</td>
			<td>SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany</td>
			<td>Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005</td>
			<td>Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph paper (for calibration)</td>
			<td>B&#252;romarkt B&#246;ttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de</td>
			<td>Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514</td>
			<td>Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)</td>
			<td>NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Becherglas SIMAX&#174; , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036</td>
			<td>Any kind of glass- or plastic beakers of 5 &#8211; 100 ml volume will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory scale(s)</td>
			<td>Mettler Toledo GmbH, Gie&#223;en, Germany</td>
			<td>PM6000</td>
			<td rowspan="2">Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Sartorius AG, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>BP61S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Engelbrecht Medizin &#38; Labortechnik, Ederm&#252;nde, Germany</td>
			<td>FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700</td>
			<td>Any kind of single-use microtome blades will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Morphometry/planimetry software/system</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss-Kontron, Eching, Germany</td>
			<td>VideoplanTM image analysis system</td>
			<td>Out of stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D40</td>
			<td>Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod&#160; will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transparencies</td>
			<td>Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany</td>
			<td>Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:&#160; 3562</td>
			<td>Any (laser)-printable plastic transparency will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random number tables</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Plano GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td>T5016</td>
			<td>Any kind of razor blades will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler</td>
			<td>B&#252;romarkt B&#246;ttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de</td>
			<td>Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30</td>
			<td>Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline (0.9%)</td>
			<td>Carl Roth GmbH, Germany</td>
			<td>Natriumchlorid, &#62;99% Cat.: 0601.1</td>
			<td>To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Aesculap AG &#38; Co KG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>BRAUN Surgical blades N&#176;22</td>
			<td>Any kind of scalpel blades will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanner</td>
			<td>Hewlett-Packard</td>
			<td>hp scanjet 7400c</td>
			<td>Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicing devices</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.&#160; Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)</td>
			<td>Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany</td>
			<td>Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm</td>
			<td>Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin wire</td>
			<td>Basteln &#38; Hobby Schobes, Stra&#223;furth, Germany. www,bastel-welt.de</td>
			<td>Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742</td>
			<td>Any other kind of thin wire will also do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue paper</td>
			<td>NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305</td>
			<td>Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof pen</td>
			<td>Staedler Mars GmbH &#38; Co KG, N&#252;rnberg, Grmany</td>
			<td>Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2</td>
			<td>Any other kind of waterproof pen will do as well.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sampling strategies and processing of biobank tissue samples from porcine biomedical models

I translationel medicinsk forskning blevet svin modeller stadigt mere populære. Overvejer den høje værdi af individuelle dyr, især af genmanipulerede svin, modeller, og det ofte begrænset antal tilgængelige dyr af disse modeller, etablering af (biobank) samlinger af tilstrækkeligt forarbejdede vævsprøver egner sig til en bredt spektrum af efterfølgende analyser metoder, herunder analyser ikke angivet på tidspunkt for prøvetagning, repræsenterer meningsfuld tilgange til at drage fuld fordel af translationel værdien af modellen. Om særlige forhold for svin anatomi oprettet omfattende retningslinjer for nylig for standardiseret generation af repræsentant, høj kvalitet prøver fra forskellige svin organer og væv. Disse retningslinjer er afgørende forudsætninger for reproducerbarhed af resultaterne og deres sammenlignelighed mellem forskellige undersøgelser og efterforskere. Registrering af grundlæggende data, såsom orgel vægte og diskenheder, bestemmelse af prøveudtagning placeringer og antal af vævsprøver skal genereres, samt deres orientering, størrelse, forarbejdning og trimning retninger, er relevante faktorer bestemmelse af generalizability og anvendeligheden af modellen for Molekylær, kvalitative og kvantitative morfologiske analyser. Her, en illustrativ, praktiske, trin for trin demonstration af de vigtigste teknikker for generation af repræsentant, multi-purpose biobank modellen fra svin væv er præsenteret. De metoder, der beskrives her omfatter bestemmelse af organ/væv diskenheder og tætheder, anvendelsen af en bind-vægtede systematisk stikprøveudtagning procedure for parenkymalt organer ved punkt-tælling, bestemmelse af omfanget af væv svind relateret til histologisk indlejring af prøver og generering af tilfældigt orienterede prøver for kvantitative analyser, stereological, såsom isotropic ensartede tilfældige (IUR) sektioner genereret af "Orientering" og "Isector" metoder og lodret uniform tilfældig (VUR) sektioner.

Neddykning teknik til bestemmelse af væv/organ densitet
Fig. 12A -B viser den repræsentative bestemmelse af tætheden og volumen af et svin nyre ved hjælp af submersion teknik beskrevet taktfast 1.1 (figur 1, figur 2). Mere repræsentative resultater af tæthed målinger af yderligere svin organer og væv er præsenteret i ...

Watch this Scientific Journal Video about Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models at JoVE.com

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

Prøvetagningsmetoder og forarbejdning af Biobank vævsprøver fra svin biomedicinsk modeller

Den praktiske anvendelse og ydeevne metoder til generering af repræsentative vævsprøver af svin dyremodeller for et bredt spektrum af downstream analyser i biobank projekter er demonstreret, herunder volumetry, systematisk stikprøveudtagning, og differentieret behandling af vævsprøver af kvalitative og kvantitative morfologiske og molekylære analyser former.

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

This video demonstrates two key techniques for sampling and processing biobank porcine tissue specimens. The submersion technique reliably estimates total organ and tissue volume and the orientator technique generates random isotropic tissue sections for unbiased estimation of quantitative morphological parameters. The main advantage of the submersion technique for tissue density determination is that it can be applied to any kind of tissue and that it produces reliable results for small as well as for large samples.The advantages of the orientator technique are that it is highly efficient and also works with large tissue samples. To begin volumetry for a large organ excise an appropriately sized piece of tissue from the organ. Carefully swab the sample with a paper towel to remove excess blood and tissue fluid.Then weigh the sample on a precision scale and record the weight of the sample. Add 0.9%saline to a beaker of suitable size. Do not completely fill the beaker to prevent overflow during tissue emersion.Place the beaker on the scale then submerge a forceps or a self-constructed sample holder in the saline until the mark on the forceps or sample holder reaches the liquid. Next, reset the display of the scale to zero. Carefully attach the tissue sample to the forceps or sample holder and completely submerge the sample in the saline until the marked position is reached.To record reliable density measurements it is important to ensure that the sample is completely submerged and to avoid any contact of the submerged sample to the inner walls or the bottom of the beaker. While holding the sample in position, record the weight displayed on the scale. Use this measurement and the density of saline at room temperature to calculate the volume of the sample.Then calculate the density of the tissue sample from the weight of the sample and its volume. For large organs and tissues, such as this kidney, perform repeated measurements with multiple samples and calculate the average density from the single measurements. For small samples and small organs measured in total such as the pituitary gland, repeat the measurement three times before calculating the average organ density from the single measurement values.Finally, calculate the total volume of the organ, tissue or organ compartment from its weight and density. Place a fixed tissue specimen on a print of an equiangular circle with one edge parallel to the zero to 180 degree direction. Then use a random number table to determine a random angle.Find the corresponding marks on the scale of the equiangular circle. Using these marks, cut a section through the sample with the section plane oriented parallel to the direction of the random angle indicated on the scale of the equiangular circle and a vertical to the resting surface of the sample. Place the tissue block with the section surface facing down on a cosine weighted circle.With the edge of the resting surface placed parallel to the one-to-one direction. Now cut a new section through the sample at a random angle determined using the random number table. The resulting section plane is an isotropic uniform random section.This table shows the representative densities of several porcine tissues and organs determined using the submersion technique. Most porcine tissues display density values slightly higher than one referring to the density of water. Whereas tissues swimming in saline, such as adipose tissue for example, display densities lower than one.This figure shows four representative IUR sections of porcine left ventricular myocardium prepared with the orientator technique. Note the changed cutting angles in the different IUR sections. Once mastered, the submersion technique for tissue density determination can be done in a few minutes.If it is performed properly. Isotropic uniform random tissue sections generated with the orientator technique are suitable for estimation of any quantitative morphological parameters using appropriate stereological analysis methods. digital music.

Research

JoVE Journal

Medicine

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Generering af alginat mikrosfærer til biomedicinske anvendelser

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Sådan måler du Kortikal Folding fra MR-billeder: en trin-for-trin introduktion til at beregne Lokal Gyrification Index

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Behandling af primær hjernetumor Tissue for stamcelle Analyser og Flow Sortering

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

Den Bovine Lung i biomedicinsk forskning: Visuelt Guided bronkoskopi, intrabronchial Podning og<em&gt; In Vivo</em&gt; stikprøveteknikker

There is an ongoing search for alternative animal models in research of respiratory medicine. Depending on the goal of the research, large animals as ...

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Absorption af Nasal og bronchiale væsker: Precision prøveudtagning af menneskelige respiratoriske slimhinden og laboratorium behandling af prøver

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

Forbedring af en lukket brystet svin myokardieinfarkt Model af standardisering af væv og blod prøveudtagningsprocedurer

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved ...

Human Subcutaneous Adipose Tissue Sampling Using a Mini-Liposuction Technique

Prøveudtagning af humant subkutant fedtvæv ved hjælp af en mini-fedtsugningsteknik

Studies on adipose tissue are useful in understanding metabolic and other conditions. Human subcutaneous adipose tissue is accessible. With appropriate ...

Repetitive Blood Sampling from the Subclavian Vein of Conscious Rat

Gentagen blodprøvetagning fra den subklaviske vene hos bevidst rotte

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to ...

Dissection Techniques and Histological Sampling of the Heart in Large Animal Models for Cardiovascular Diseases

Dissektionsteknikker og histologisk prøveudtagning af hjertet i store dyremodeller for hjerte-kar-sygdomme

The standard gross examination and sampling are key elements in the reproducibility and success of experimental studies of cardiovascular diseases carried ...

Økonomisk kiselalger DNA-ekstraktion ved hjælp af et modificeret sæt

Extraction of Diatom DNA from Water Samples and Tissues

Forfatter Spotlight: Kiselalger Test til retsmedicinsk drukningsundersøgelse 

Ekstraktion af diatome-DNA fra vandprøver og væv

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. ...