Name: sampling strategies and processing of biobank tissue samples from porcine biomedical models
Uploaded: 2018-03-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models at JoVE.com

De auteurs bedanken Lisa Pichl voor uitstekende technische bijstand.

Alle methoden die worden beschreven hier gebruik van weefselmonsters afgeleid van dode dieren en volledig in overeenstemming zijn met de Duitse wettelijke voorschriften voor het welzijn van dieren.
1. volumetrie
<ol><li>Onderdompeling techniek voor de bepaling van de dichtheid van het weefsel/orgel (Figuur 1 en Figuur 2) 7 , 12<...

<ol>
	<li>Aigner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+pigs+as+models+for+translational+biomedical+research.">Transgenic pigs as models for translational biomedical research.</a> J Mol. Med. 88, 653-664 (2010).</li><li>Blutke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Munich+MIDY+Pig+Biobank:+A+unique+resource+for+studying+organ+crosstalk+in+diabetes.">The Munich MIDY Pig Biobank: A unique resource for studying organ crosstalk in diabetes.</a> Mol Metab. 6, 931-940 (2017).</li><li>Klymiuk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-deficient+pigs+provide+new+insights+into+the+hierarchy+of+physiological+derangements+of+dystrophic+muscle.">Dystrophin-deficient pigs provide new insights into the hierarchy of physiological derangements of dystrophic muscle.</a> Hum Mol Genet. 22, 4368-4382 (2013).</li><li>Klymiuk, N., Seeliger, F., Bohlooly, Y. M., Blutke, A., Rudmann, D. G., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailored+pig+models+for+preclinical+efficacy+and+safety+testing+of+targeted+therapies.">Tailored pig models for preclinical efficacy and safety testing of targeted therapies.</a> Toxicol Pathol. 44, 346-357 (2016).</li><li>Renner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permanent+neonatal+diabetes+in+INSC94Y+transgenic+pigs.">Permanent neonatal diabetes in INSC94Y transgenic pigs.</a> Diabetes. 62, 1505-1511 (2013).</li><li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inside+the+first+pig+biobank.">Inside the first pig biobank.</a> Nature. 519, 397-398 (2015).</li><li>Albl, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+sampling+guides+for+porcine+biomedical+models.">Tissue sampling guides for porcine biomedical models.</a> Toxicol Pathol. 44, 414-420 (2016).</li><li>Gundersen, H. J. G., Mirabile, R., Brown, D., Boyce, R. W., Haschek, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+principles+and+sampling+procedures+for+toxicologic+pathologists.">Stereological principles and sampling procedures for toxicologic pathologists.</a> Haschek and Rousseaux's Handbook of Toxicologic Pathology. , 215-286 (2013).</li><li>Howard, C. V., Reed, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. , 1-277 (2005).</li><li>Mattfeldt, T., Mall, G., Gharehbaghi, H., Moller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+surface+area+and+length+with+the+orientator.">Estimation of surface area and length with the orientator.</a> J Microsc. 159, 301-317 (1990).</li><li>Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isector:+A+simple+and+direct+method+for+generating+isotropic,+uniform+random+sections+from+small+specimens.">The isector: A simple and direct method for generating isotropic, uniform random sections from small specimens.</a> J Microsc. 165, 427-431 (1992).</li><li>Tschanz, S., Schneider, J. P., Knudsen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereology:+Planning,+volumetry+and+sampling+are+crucial+steps+for+a+successful+study.">Design-based stereology: Planning, volumetry and sampling are crucial steps for a successful study.</a> Ann Anat. 196, 3-11 (2014).</li><li>Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+shrinkage+and+unbiased+stereological+estimation+of+particle+number+and+size.">Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size.</a> J Microsc. 204, 232-246 (2001).</li><li>Mattfeldt, T., Doerr, W., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereologische+Methoden+in+der+Pathologie+[Stereologic+methods+in+pathology].">Stereologische Methoden in der Pathologie [Stereologic methods in pathology].</a> Normale und pathologische Anatomie. , (1990).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology+and+its+prediction.">The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction.</a> J Microsc. 147, 229-263 (1987).</li><li>Scherle, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+volumetry+of+organs+in+quantitative+stereology.">A simple method for volumetry of organs in quantitative stereology.</a> Mikroskopie. 26, 57-60 (1970).</li><li>Nielsen, K. K., Andersen, C. B., Kromann-Andersen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+the+effects+of+paraffin+and+plastic+embedding+of+the+normal+and+obstructed+minipig+detrusor+muscle+using+the+optical+disector.">A comparison between the effects of paraffin and plastic embedding of the normal and obstructed minipig detrusor muscle using the optical disector.</a> J Urol. 154, 2170-2173 (1995).</li><li>Schneider, J. P., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+mouse+lung+tissue+dimensions+during+processing+for+morphometry:+a+comparison+of+methods.">Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L341-L350 (2014).</li><li>von Bartheld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+particles+in+the+z-axis+of+tissue+sections:+Relevance+for+counting+methods.">Distribution of particles in the z-axis of tissue sections: Relevance for counting methods.</a> NeuroQuantology. 10, 66-75 (2012).</li><li>Baddeley, A. J., Gundersen, H. J., Cruz-Orive, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+surface+area+from+vertical+sections.">Estimation of surface area from vertical sections.</a> J microsc. 142, 259-276 (1986).</li><li>Blutke, A., Schneider, M. R., Wolf, E., Wanke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+hormone+(GH)-transgenic+insulin-like+growth+factor+1+(IGF1)-deficient+mice+allow+dissociation+of+excess+GH+and+IGF1+effects+on+glomerular+and+tubular+growth.">Growth hormone (GH)-transgenic insulin-like growth factor 1 (IGF1)-deficient mice allow dissociation of excess GH and IGF1 effects on glomerular and tubular growth.</a> Physiol Rep. 4, e12709 (2016).</li><li>Hermanns, W., Liebig, K., Schulz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembedding+immunohistochemical+demonstration+of+antigen+in+experimental+polyarthritis+using+plastic+embedded+whole+joints.">Postembedding immunohistochemical demonstration of antigen in experimental polyarthritis using plastic embedded whole joints.</a> Histochemistry. 73, 439-446 (1981).</li><li>Böck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Romeis Mikroskopische Technik. , 1-697 (1989).</li><li>Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D., Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bancroft's theory and practice of histological techniques. , 1-654 (2013).</li><li>Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+estimates+of+alveolar+number+and+size+and+capillary+length+and+surface+area+in+mice+lungs.">Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs.</a> Anat Rec (Hoboken). 292, 113-122 (2009).</li><li>Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+for+stereology+in+lungs.">Sampling for stereology in lungs.</a> Eur Respir Rev. 15, 107-114 (2006).</li><li>Junatas, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+analysis+of+size+and+density+of+hepatocytes+in+the+porcine+liver.">Stereological analysis of size and density of hepatocytes in the porcine liver.</a> J Anat. 230, 575-588 (2017).</li></ol>

Generatie van biobank monstercollecties van varkens diermodellen vereist robuuste technieken en protocollen voor de bepaling van orgaan/weefsel volumes, de reproduceerbare generatie van vertegenwoordiger, redundante weefselsteekproeven geschikt voor een breed scala aan verschillende analysemethoden, en voor randomisatie van de oriëntatie van monster secties voor kwantitatieve stereological analyses. De in dit artikel beschreven methoden zijn aangepast aan de grootte van varkens organen en weefsels, en hebben ontwikkeld ...

Translationeel geneeskunde, varkens zijn steeds vaker voorkomende voor gebruik als groot dier1,2,3,4,5, als gevolg van verschillende voordelige overeenkomsten tussen de varkens modellen en menselijke anatomie en fysiologie, en de beschikbaarheid van gevestigde moleculaire biologische methoden toestaan voor generatie op maat, genetisch gemodificeerde varken modellen voor een breed scala van1,4van de voorwaarden van de ziekte.
Ten opzichte van knaagdier modellen, is het aantal dieren van een respectieve varken model dat kan worden voorzien voor experimenten op elk gewenst moment echter beperkt. Dit is te wijten aan de varkens generatie interval van ongeveer een jaar, en de financiële en tijdrovende inspanningen die nodig zijn voor de generatie van varkens modellen en de veehouderij. Daarom, individuele dieren van een varkens model, evenals de voorbeelden die kunnen worden gegenereerd op basis van deze varkens, zijn zeer waardevol, vooral als genetisch gemanipuleerde varkens modellen en/of lange termijn experimentele problemen (bijvoorbeeld, late complicaties van chronische ziekten) worden in leeftijd individuen2,6,7onderzocht.
In de loop van een studie, prestaties van aanvullende analyses die had niet gepland in de eerste opzet van de studie kan later blijken te worden betrokken, bijvoorbeeldnaar adres verschillende vragen die voortvloeien uit eerder ontdekt onverwachte bevindingen. Als geschikt monsters voor dergelijke aanvullende experimenten niet beschikbaar zijn, mogelijk onevenredig hoge kosten en tijdrovende uitgaven noodzakelijk voor het genereren van extra varkens en weefselmonsters worden. Als u wilt worden voorbereid dergelijke, generatie van biobank collecties van geconserveerde reservekopie monsters van de verschillende organen, weefsels of bio-vloeistoffen, kwantitatief als in kwalitatief opzicht geschikt zijn voor een breed scala van latere analyses, wordt beschouwd als een belangrijk 2,6,7te benaderen. Optimale voordelen uit een varkens diermodel voortvloeiende, de beschikbaarheid van voldoende biobank monsters biedt ook de unieke mogelijkheid voor het uitvoeren van een breed spectrum van verschillende analysemethoden op identieke monster materialen op het niveau van een multi-orgel in de precies dezelfde individuele dieren, bijvoorbeelddoor verdeling van de monsters aan wetenschappers van verschillende werkgroepen georganiseerd in een onderzoek netwerk2,6,7. De '' toekomstgerichte '' bemonsteringsstrategie in biobanking draagt bovendien ook bij aan een vermindering van het aantal dieren in een studie nodig. De voordelen van varkens model biobanking zijn onlangs aangetoond in een multi orgel, multiomics onderzoek, onderzoek van orgel cross talk in een genetisch gemanipuleerde varkens model van lange termijn diabetes mellitus, met behulp van specimens van de München MIDY varken Biobank 2.
Er zijn een aantal verplichte eisen biobank monsters in het algemeen voldoen moeten om de betrouwbaarheid en interpretability van de resultatenvan de later uitgevoerde analyses. De monsters moeten reproducibly worden gegenereerd, en ze moet voldoende representatief, dat wil zeggen, als gevolg van de interesse morfologische en moleculaire kenmerken van het weefsel/orgel de monsters werden genomen uit7. Om zijn geschikt voor een breed scala van soorten downstream analyse, moeten de monsters worden genomen in voldoende hoeveelheden en verwerkt volgens de eisen (met inbegrip van tijd- en temperatuurdisplays voorwaarden) van de verschillende analysemethoden, met inbegrip van beschrijvende histopathologische analyses, zoals cryohistology, paraffine en kunststof histologie, immunohistochemistry, in situ hybridisatie, ultrastructurele elektronen microscopische analyses en klinisch laboratorium diagnostische analyses, evenals als moleculaire analyses van DNA, RNA, eiwitten en metabolieten.
Als u wilt toestaan voor de beoordeling van een breed scala aan verschillende kwantitatieve morfologische parameters zoals cijfers, volumes, lengtes, of oppervlakten van verschillende weefsel structuren door kwantitatieve stereological analyses, gerandomiseerde sectie vliegtuigen van de histologische monsters van de respectieve organen/weefsels moeten worden voorbereid7,8,9,10,11. In kwantitatieve morfologische studies, de nauwkeurige bepaling van het totale volume van het weefsel, orgel of orgel compartiment, de monsters werden genomen uit (dat wil zeggen, de verwijzing ruimte) is van cruciaal belang7,9 , 12 om de absolute hoeveelheden van de betrokken parameters binnen de respectieve orgaan, weefsel of organisme te berekenen. Uiteindelijk heeft het effect van insluiten-gerelateerde weefsel krimp tijdens de voorbereiding van de histologische secties te worden bepaald en in rekening13genomen. Daarom, kwantitatieve stereological analyses, met name van gearchiveerde monsters (vaste weefselsteekproeven ingesloten weefsel blokken, histologisch secties, etc.) uit eerdere studies zijn soms ernstig beperkt of zelfs onmogelijk12, met name indien volumetrie van de respectieve organen/weefsels is niet uitgevoerd, als geen passende bemonstering ontwerpen werden toegepast om te rechtvaardigen representatieve monsters, wanneer de aantallen en bedragen van de beschikbare afzonderlijke monsters ontoereikend zijn, of als de verwerking van de monsters is incompatibel met de raming van de kwantitatieve morfologische parameter (s) van belang. Vanwege de vele mogelijke factoren, de geschiktheid van archief-monster materialen voor analyses van afzonderlijke kwantitatieve morfologische parameters ondubbelzinnig kan niet worden beantwoord, maar hangt af van de zorgvuldige beoordeling van ieder individueel geval.
Dus, zoals de locatie, grootte, aantal, verwerking, trimmen richting en afdrukstand van monsters zullen mogelijk van invloed zijn op de resultaten van de latere analyses, deze factoren zijn van groot belang en moeten worden beschouwd in het experimentele ontwerp van een onderzoek. Met betrekking tot deze aspecten en de specificiteit van de varkens anatomie, uitgebreide, gedetailleerde, grootschalige bemonstering richtsnoeren aangepast aan varkens dierlijke modellen zijn onlangs vastgesteld, bieden een robuuste verwijzing naar gestandaardiseerde, reproduceerbare , en efficiënt genereren van redundante, adequaat verwerkt, kwalitatief hoogwaardige monsters van meer dan 50 verschillende varkens organen en weefsels6,7.
De methodologische beschrijvingen en de video-tutorial weergegeven in dit artikel bieden gedetailleerde, illustratieve, begrijpelijk, stap-by stap-instructies voor de praktische uitvoering van een verscheidenheid van technieken voor volumetrie, bemonstering van varkens weefsels en organen, en verwerking van weefselmonsters voor verschillende downstream analysemethoden. De aanbevolen technieken omvatten methoden voor bepaling van orgaan/weefsel volumes en dichtheden gebaseerd op de beginselen van Archimedes en Cavalieri9, met inbegrip van de bepaling van de afmetingen van driedimensionale krimp van weefsel gerelateerde aan de insluiten in verschillende insluiten media14 tijdens de verwerking voor histopathologisch onderzoek, toepassing van uitvoerbaar volume-gewogen systematische steekproeven nadert, verwerking van gesamplede weefsel specimens voor verschillende latere analyses7,,8,,9,15, generatie op passende wijze georiënteerd en verwerkt monsters voor potentiële kwantitatieve stereological analyses7,8, 9,10,11. Naast hun toepassing in varkens biobank projecten zijn de bewezen methoden over het algemeen geschikt voor alle studies kwantitatieve histo-morfologische eigenschappen van organen/weefsels te onderzoeken. Bovendien, systematische steekproeven ontwerpen zijn vooral gunstig voor generatie van representatieve monsters in experimenten moleculaire analysemethoden gebruiken voor het detecteren van overvloed wijzigingen van, bijvoorbeeld, RNAs, eiwitten of metabolieten in verschillende organen en weefsels.
De volgende paragrafen bieden een korte inleiding op deze methoden, terwijl hun praktische prestaties wordt beschreven in de sectie protocol.
Bepaling van orgaan/weefsel volumes Bepaling van orgel gewichten en volumes is belangrijk in verschillende experimentele instellingen, zoals deze factoren kunnen wijzen op veranderingen, potentieel aan experimenteel gerelateerde onderzocht factoren van belang. Het totale volume van een orgaan/weefsel is ook vaak nodig voor het berekenen van de absolute kwantitatieve parameters (bijvoorbeeld, het nummer van de cel totaal), van stereologically geschatte numerieke volume dichtheden (dat wil zeggen, het aantal cellen per volume-eenheid van weefsel)7,12. Afgezien van technieken met behulp van complexe technische apparatuur, zoals computer tomografie, zijn er in principe drie praktische methoden die gewoonlijk worden gebruikt om te bepalen van het absolute volume van een orgaan of weefsel. Het volume van een orgaan kan worden bepaald door de "directe volumetrische meting" volgens het beginsel van Archimedes, dat wil zeggen, het meten van de hoeveelheid water of zoutoplossing dakloos geraakt door de structuur als volledig ondergedompeld. Voor relatief grote varkens organen zijn deze benaderingen echter onpraktisch en gevoelig voor onnauwkeurigheid, aangezien ze zeer grote volumetrische/meten kolven vereist. Meer gemakshalve, het volume van een orgaan/weefsel kan worden berekend op basis van haar gewicht en dichtheid7,12,16, die efficiënt kan worden bepaald met behulp van de "methode van de onderdompeling"7,12 ,16 (protocol stap 1.1.). Orgaan/weefsel volumes kunnen ook worden geschat met behulp van volumetrie benaderingen gebaseerd op het "principe van Cavalieri" (1598-1647). In eenvoudige termen, het principe van Cavalieri stelt, als twee objecten zijn gesegmenteerd in vlakken evenwijdig aan een massaplaat, en de profielen van de secties door de twee objecten op overeenkomt gesneden afstanden van de massaplaat zijn dezelfde regio's, de twee objecten hetzelfde volume hebben. Dus, het volume van willekeurig gevormde objecten kan worden ingeschat als het product van hun sectie profiel gebieden in parallelle, even verre sectie vliegtuigen en de afstand tussen de vlakken van de sectie. Dit is begrijpelijk met de volgende analogie: overwegen twee stapels bestaande uit hetzelfde aantal identieke munten staan naast elkaar, een stapel met de munten ordelijke gestapeld bovenop elkaar opbrengst van een cilindrische vorm van de munt-stack, en de andere stapel van munten met uit het midden geplaatst munten (figuur 3A). Hoewel de vormen van zowel munt-stapels anders zijn, hun volumes zijn hetzelfde, sinds de gebieden van de munten op overeenkomstige niveaus van beide stapels (dat wil zeggen, het gebied van profielen van parallelle secties snijden door beide stapels van de munt in op gelijke afstand van de gemalen) identiek zijn. Schatting van de volumes van varkens organen en weefsels met behulp van de12,voor Cavalieri principe7,15 wordt beschreven in stap 1,2.
Bepaling van de omvang van weefsel krimp aan histologische insluiten gerelateerde In analyses van verschillende kwantitatieve morfologische parameters gemeten in histologische weefselsecties, heeft het effect van insluiten-gerelateerde weefsel krimp tijdens verwerking voor histologie weefsel te worden bepaald en in aanmerking genomen. De omvang van insluiten-gerelateerde weefsel krimp variabele kan worden, en is afhankelijk van zowel op het weefsel, de verwerking en het insluiten middellange8,13,17,18,19. In het algemeen, insluiten-gerelateerde veranderingen van het volume van een sample van het weefsel (dat wil zeggen, meestal krimp) optreden in alle drie de dimensies van ruimte, en dus, is van invloed op alle dimensionale parameters geschat door kwantitatieve stereological analyses8 . Kortom, de omvang van insluiten-gerelateerde weefsel krimp, uitgedrukt als de lineaire weefsel krimp factor (fS), kan worden geraamd zoals aangegeven in stap 1.3. en gebruikt voor correctie van de kwantitatieve morfologische parameters (krimp-gevoelig)14.
Volume-gewogen systematische aselecte steekproef van organen/weefsels Voor vestiging van een biobank collectie van varkens orgel/weefselsteekproeven, hebben systematische steekproeven volume-gewogen benaderingen zoals beschreven in stap 2 bewezen praktische tijdbesparende en efficiënte technieken voor generatie van vertegenwoordiger, multi purpose weefsel monsters7,8,9,15.
Generatie van isotroop uniforme Random secties en verticale uniforme Random secties voor kwantitatieve stereological analyses Biobank weefselsteekproeven moeten geschikt zijn voor een breed scala van verschillende kwantitatieve stereological analysemethoden voor schatting van een maximum van parameters die kon niet worden vastgesteld zonder een adequaat bereid exemplaar. Bijna alle kwantitatieve stereological parameters kunnen worden bepaald, met behulp van "isotrope (onafhankelijke) uniforme willekeurige (IUR) secties"8,9. In IUR secties, is de driedimensionale oriëntatie van het sectievlak van het weefsel monster gerandomiseerde. Dit kan worden bereikt door randomisatie van de positie van het weefsel monster ten opzichte van de positie van het sectievlak, zoals toegepast in de "Isector" methode11 (protocol stap 3.1), of door randomisatie van de oriëntatie van het sectievlak ten opzichte de weefsel monster, zoals in de "Oriënteringsapparaten" methode10 (protocol stap 3.2). In weefselmonsters, zoals huid of mucosa specimen weergeven een nature aanwezig, of gedefinieerde en goed herkenbaar verticale as, voorbereiding van de "verticale uniforme willekeurige (VUR) secties" (protocol stap 3.3.) gesegmenteerd strikt binnen het vlak van hun verticale as is de voordeligste8,20. Voor een volledige discours van de theoretische grondslagen van IUR/VUR bemonstering en een uitgebreide bespreking van potentiële downstream kwantitatieve stereological analyses, wordt de geïnteresseerde lezer verwezen naar de schoolboeken van kwantitatieve stereology in het leven Wetenschappen8,9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Carl Roth GmbH, Germany</td>
			<td>Agar (powder), Cat.: 5210.3</td>
			<td>Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany</td>
			<td>Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902</td>
			<td>Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casting molds (metal)</td>
			<td>Engelbrecht Medizin &#38; Labortechnik, Ederm&#252;nde, Germany</td>
			<td>Einbettsch&#228;lchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b</td>
			<td>Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm)</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.&#160; Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard &#38; Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux&#180;s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)</td>
			<td>Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China</td>
			<td>Y10006 and Y10005</td>
			<td>Any other type of standard office foldback clamps will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (anatomical)</td>
			<td>NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811</td>
			<td>Any type of anatomical forceps will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde-solution 4%</td>
			<td>SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany</td>
			<td>Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005</td>
			<td>Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph paper (for calibration)</td>
			<td>B&#252;romarkt B&#246;ttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de</td>
			<td>Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514</td>
			<td>Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)</td>
			<td>NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Becherglas SIMAX&#174; , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036</td>
			<td>Any kind of glass- or plastic beakers of 5 &#8211; 100 ml volume will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory scale(s)</td>
			<td>Mettler Toledo GmbH, Gie&#223;en, Germany</td>
			<td>PM6000</td>
			<td rowspan="2">Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Sartorius AG, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>BP61S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Engelbrecht Medizin &#38; Labortechnik, Ederm&#252;nde, Germany</td>
			<td>FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700</td>
			<td>Any kind of single-use microtome blades will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Morphometry/planimetry software/system</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss-Kontron, Eching, Germany</td>
			<td>VideoplanTM image analysis system</td>
			<td>Out of stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D40</td>
			<td>Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod&#160; will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transparencies</td>
			<td>Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany</td>
			<td>Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:&#160; 3562</td>
			<td>Any (laser)-printable plastic transparency will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random number tables</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Plano GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td>T5016</td>
			<td>Any kind of razor blades will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler</td>
			<td>B&#252;romarkt B&#246;ttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de</td>
			<td>Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30</td>
			<td>Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline (0.9%)</td>
			<td>Carl Roth GmbH, Germany</td>
			<td>Natriumchlorid, &#62;99% Cat.: 0601.1</td>
			<td>To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Aesculap AG &#38; Co KG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>BRAUN Surgical blades N&#176;22</td>
			<td>Any kind of scalpel blades will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanner</td>
			<td>Hewlett-Packard</td>
			<td>hp scanjet 7400c</td>
			<td>Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicing devices</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.&#160; Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)</td>
			<td>Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany</td>
			<td>Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm</td>
			<td>Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin wire</td>
			<td>Basteln &#38; Hobby Schobes, Stra&#223;furth, Germany. www,bastel-welt.de</td>
			<td>Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742</td>
			<td>Any other kind of thin wire will also do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue paper</td>
			<td>NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305</td>
			<td>Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof pen</td>
			<td>Staedler Mars GmbH &#38; Co KG, N&#252;rnberg, Grmany</td>
			<td>Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2</td>
			<td>Any other kind of waterproof pen will do as well.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sampling strategies and processing of biobank tissue samples from porcine biomedical models

Translationeel medisch onderzoek, varkens modellen steeds populairder geworden. Gezien de hoge waarde van individuele dieren, met name van genetisch gemodificeerde varken modellen, en de vaak beperkte aantal beschikbare dieren van deze modellen, oprichting van (biobank) collecties van voldoende verwerkte weefselsteekproeven geschikt voor een breed spectrum van latere analyses methodes, inclusief analyses niet opgegeven op de tijdstip van monsterneming, vertegenwoordigen zinvolle benaderingen ten volle te profiteren van de translationeel waarde van het model. Met betrekking tot de eigenaardigheden van varkens anatomie, zijn onlangs uitgebreide richtsnoeren opgesteld voor gestandaardiseerde generatie representatief, kwalitatief hoogwaardige monsters van andere varkens organen en weefsels. Deze richtsnoeren zijn essentiële voorwaarden voor de reproduceerbaarheid van de resultaten en hun vergelijkbaarheid tussen de verschillende studies en onderzoekers. De opname van basisgegevens, zoals orgel gewichten en volumes, de bepaling van de locaties van de bemonstering en de nummers van weefselmonsters moeten worden gegenereerd, evenals hun geaardheid, grootte, verwerking en trimmen richtingen, zijn relevante factoren het bepalen van de dan en de bruikbaarheid van het model voor moleculaire, kwalitatieve en kwantitatieve morfologische analyses. Hier, een illustratieve, praktische, stapsgewijze demonstratie van de belangrijkste technieken voor generatie van vertegenwoordiger, multifunctionele biobank specimen van varkens weefsels wordt gepresenteerd. De hier beschreven methoden bepaling te omvatten van orgaan/weefsel volumes en dichtheden, de toepassing van een systematische steekproeven volume-gewogen procedure voor parenchymal organen door punt-tellen, bepaling van de omvang van weefsel krimp aan de histologische inbedding van monsters en generatie van willekeurig georiënteerde monsters voor kwantitatieve stereological analyses, zoals isotrope uniforme willekeurige (IUR) secties die zijn gegenereerd door de "Oriënteringsapparaten" en "Isector" methoden en verticale uniform gerelateerde willekeurige (VUR) secties.

Onderdompeling techniek voor de bepaling van de dichtheid van het weefsel/orgel
Figuur 12A -B toont de representatieve bepaling van de dichtheid en het volume van een varkens nier met behulp van de onderdompeling techniek beschreven in stap 1.1 (Figuur 1, Figuur 2). Meer representatieve resultaten van metingen van de dichtheid...

Watch this Scientific Journal Video about Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models at JoVE.com

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

Bemonsteringsstrategie en verwerking van Biobank weefselmonsters van varkens biomedische modellen

De praktische toepassing en de prestaties van methoden voor generatie van representatieve weefselmonsters van varkens diermodellen voor een breed spectrum van downstream analyses in biobank projecten worden gedemonstreerd, waaronder volumetrie, systematische steekproefsgewijze bemonstering, en differentiële verwerking van weefselmonsters voor kwalitatieve en kwantitatieve analyses van morfologische en moleculair typen.

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

This video demonstrates two key techniques for sampling and processing biobank porcine tissue specimens. The submersion technique reliably estimates total organ and tissue volume and the orientator technique generates random isotropic tissue sections for unbiased estimation of quantitative morphological parameters. The main advantage of the submersion technique for tissue density determination is that it can be applied to any kind of tissue and that it produces reliable results for small as well as for large samples.The advantages of the orientator technique are that it is highly efficient and also works with large tissue samples. To begin volumetry for a large organ excise an appropriately sized piece of tissue from the organ. Carefully swab the sample with a paper towel to remove excess blood and tissue fluid.Then weigh the sample on a precision scale and record the weight of the sample. Add 0.9%saline to a beaker of suitable size. Do not completely fill the beaker to prevent overflow during tissue emersion.Place the beaker on the scale then submerge a forceps or a self-constructed sample holder in the saline until the mark on the forceps or sample holder reaches the liquid. Next, reset the display of the scale to zero. Carefully attach the tissue sample to the forceps or sample holder and completely submerge the sample in the saline until the marked position is reached.To record reliable density measurements it is important to ensure that the sample is completely submerged and to avoid any contact of the submerged sample to the inner walls or the bottom of the beaker. While holding the sample in position, record the weight displayed on the scale. Use this measurement and the density of saline at room temperature to calculate the volume of the sample.Then calculate the density of the tissue sample from the weight of the sample and its volume. For large organs and tissues, such as this kidney, perform repeated measurements with multiple samples and calculate the average density from the single measurements. For small samples and small organs measured in total such as the pituitary gland, repeat the measurement three times before calculating the average organ density from the single measurement values.Finally, calculate the total volume of the organ, tissue or organ compartment from its weight and density. Place a fixed tissue specimen on a print of an equiangular circle with one edge parallel to the zero to 180 degree direction. Then use a random number table to determine a random angle.Find the corresponding marks on the scale of the equiangular circle. Using these marks, cut a section through the sample with the section plane oriented parallel to the direction of the random angle indicated on the scale of the equiangular circle and a vertical to the resting surface of the sample. Place the tissue block with the section surface facing down on a cosine weighted circle.With the edge of the resting surface placed parallel to the one-to-one direction. Now cut a new section through the sample at a random angle determined using the random number table. The resulting section plane is an isotropic uniform random section.This table shows the representative densities of several porcine tissues and organs determined using the submersion technique. Most porcine tissues display density values slightly higher than one referring to the density of water. Whereas tissues swimming in saline, such as adipose tissue for example, display densities lower than one.This figure shows four representative IUR sections of porcine left ventricular myocardium prepared with the orientator technique. Note the changed cutting angles in the different IUR sections. Once mastered, the submersion technique for tissue density determination can be done in a few minutes.If it is performed properly. Isotropic uniform random tissue sections generated with the orientator technique are suitable for estimation of any quantitative morphological parameters using appropriate stereological analysis methods. digital music.

Research

JoVE Journal

Medicine

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Genereren van alginaat Microspheres voor biomedische toepassingen

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Hoe kan ik Corticale Folding Meet vanaf MR Foto&#39;s: een stap-voor-stap handleiding voor lokale Gyrification Index Compute

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Verwerking van primaire hersentumor Weefsel voor Stem Cell Testen en Flow sorteren

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

De Bovine Lung in het biomedisch onderzoek: visueel geleide Bronchoscopie, intrabronchiale Enten en<em&gt; In Vivo</em&gt; Sampling Technieken

There is an ongoing search for alternative animal models in research of respiratory medicine. Depending on the goal of the research, large animals as ...

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Absorptie van vloeistoffen nasale en bronchiale: Precision bemonstering van de menselijke respiratoire Mucosa en laboratorium verwerking van de monsters

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

Verbetering van een gesloten borst varkens myocardiaal infarct Model door standaardisatie van weefsel en bloed bemonsteringsprocedures

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved ...

Human Subcutaneous Adipose Tissue Sampling Using a Mini-Liposuction Technique

Humane subcutane vetweefselbemonstering met behulp van een mini-liposuctietechniek

Studies on adipose tissue are useful in understanding metabolic and other conditions. Human subcutaneous adipose tissue is accessible. With appropriate ...

Repetitive Blood Sampling from the Subclavian Vein of Conscious Rat

Repetitieve bloedafname uit de subclavia-ader van bewuste rat

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to ...

Dissection Techniques and Histological Sampling of the Heart in Large Animal Models for Cardiovascular Diseases

Dissectietechnieken en histologische bemonstering van het hart in grote diermodellen voor hart- en vaatziekten

The standard gross examination and sampling are key elements in the reproducibility and success of experimental studies of cardiovascular diseases carried ...

Voordelige diatomeeën-DNA-extractie met behulp van een aangepaste kit

Extraction of Diatom DNA from Water Samples and Tissues

Auteur in de schijnwerpers: diatomeeëntesten voor forensisch verdrinkingsonderzoek 

Extractie van diatomeeën-DNA uit watermonsters en weefsels

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. ...