Name: sampling strategies and processing of biobank tissue samples from porcine biomedical models
Uploaded: 2018-03-06T14:00:00
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Les auteurs remercient Lisa Pichl excellente assistance technique.

Toutes les méthodes décrites ici utilisent des échantillons de tissus provenant d’animaux morts et respectez les réglementations allemandes du bien-être animal.
1. volumétrie
<ol><li>Technique d’immersion pour la détermination de la densité de tissu ou d’organe (Figure 1 et Figure 2) 7 , 12 , <sup ...

<ol>
	<li>Aigner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+pigs+as+models+for+translational+biomedical+research.">Transgenic pigs as models for translational biomedical research.</a> J Mol. Med. 88, 653-664 (2010).</li><li>Blutke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Munich+MIDY+Pig+Biobank:+A+unique+resource+for+studying+organ+crosstalk+in+diabetes.">The Munich MIDY Pig Biobank: A unique resource for studying organ crosstalk in diabetes.</a> Mol Metab. 6, 931-940 (2017).</li><li>Klymiuk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-deficient+pigs+provide+new+insights+into+the+hierarchy+of+physiological+derangements+of+dystrophic+muscle.">Dystrophin-deficient pigs provide new insights into the hierarchy of physiological derangements of dystrophic muscle.</a> Hum Mol Genet. 22, 4368-4382 (2013).</li><li>Klymiuk, N., Seeliger, F., Bohlooly, Y. M., Blutke, A., Rudmann, D. G., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailored+pig+models+for+preclinical+efficacy+and+safety+testing+of+targeted+therapies.">Tailored pig models for preclinical efficacy and safety testing of targeted therapies.</a> Toxicol Pathol. 44, 346-357 (2016).</li><li>Renner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permanent+neonatal+diabetes+in+INSC94Y+transgenic+pigs.">Permanent neonatal diabetes in INSC94Y transgenic pigs.</a> Diabetes. 62, 1505-1511 (2013).</li><li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inside+the+first+pig+biobank.">Inside the first pig biobank.</a> Nature. 519, 397-398 (2015).</li><li>Albl, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+sampling+guides+for+porcine+biomedical+models.">Tissue sampling guides for porcine biomedical models.</a> Toxicol Pathol. 44, 414-420 (2016).</li><li>Gundersen, H. J. G., Mirabile, R., Brown, D., Boyce, R. W., Haschek, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+principles+and+sampling+procedures+for+toxicologic+pathologists.">Stereological principles and sampling procedures for toxicologic pathologists.</a> Haschek and Rousseaux's Handbook of Toxicologic Pathology. , 215-286 (2013).</li><li>Howard, C. V., Reed, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. , 1-277 (2005).</li><li>Mattfeldt, T., Mall, G., Gharehbaghi, H., Moller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+surface+area+and+length+with+the+orientator.">Estimation of surface area and length with the orientator.</a> J Microsc. 159, 301-317 (1990).</li><li>Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isector:+A+simple+and+direct+method+for+generating+isotropic,+uniform+random+sections+from+small+specimens.">The isector: A simple and direct method for generating isotropic, uniform random sections from small specimens.</a> J Microsc. 165, 427-431 (1992).</li><li>Tschanz, S., Schneider, J. P., Knudsen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereology:+Planning,+volumetry+and+sampling+are+crucial+steps+for+a+successful+study.">Design-based stereology: Planning, volumetry and sampling are crucial steps for a successful study.</a> Ann Anat. 196, 3-11 (2014).</li><li>Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+shrinkage+and+unbiased+stereological+estimation+of+particle+number+and+size.">Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size.</a> J Microsc. 204, 232-246 (2001).</li><li>Mattfeldt, T., Doerr, W., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereologische+Methoden+in+der+Pathologie+[Stereologic+methods+in+pathology].">Stereologische Methoden in der Pathologie [Stereologic methods in pathology].</a> Normale und pathologische Anatomie. , (1990).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology+and+its+prediction.">The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction.</a> J Microsc. 147, 229-263 (1987).</li><li>Scherle, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+volumetry+of+organs+in+quantitative+stereology.">A simple method for volumetry of organs in quantitative stereology.</a> Mikroskopie. 26, 57-60 (1970).</li><li>Nielsen, K. K., Andersen, C. B., Kromann-Andersen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+the+effects+of+paraffin+and+plastic+embedding+of+the+normal+and+obstructed+minipig+detrusor+muscle+using+the+optical+disector.">A comparison between the effects of paraffin and plastic embedding of the normal and obstructed minipig detrusor muscle using the optical disector.</a> J Urol. 154, 2170-2173 (1995).</li><li>Schneider, J. P., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+mouse+lung+tissue+dimensions+during+processing+for+morphometry:+a+comparison+of+methods.">Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L341-L350 (2014).</li><li>von Bartheld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+particles+in+the+z-axis+of+tissue+sections:+Relevance+for+counting+methods.">Distribution of particles in the z-axis of tissue sections: Relevance for counting methods.</a> NeuroQuantology. 10, 66-75 (2012).</li><li>Baddeley, A. J., Gundersen, H. J., Cruz-Orive, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+surface+area+from+vertical+sections.">Estimation of surface area from vertical sections.</a> J microsc. 142, 259-276 (1986).</li><li>Blutke, A., Schneider, M. R., Wolf, E., Wanke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+hormone+(GH)-transgenic+insulin-like+growth+factor+1+(IGF1)-deficient+mice+allow+dissociation+of+excess+GH+and+IGF1+effects+on+glomerular+and+tubular+growth.">Growth hormone (GH)-transgenic insulin-like growth factor 1 (IGF1)-deficient mice allow dissociation of excess GH and IGF1 effects on glomerular and tubular growth.</a> Physiol Rep. 4, e12709 (2016).</li><li>Hermanns, W., Liebig, K., Schulz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembedding+immunohistochemical+demonstration+of+antigen+in+experimental+polyarthritis+using+plastic+embedded+whole+joints.">Postembedding immunohistochemical demonstration of antigen in experimental polyarthritis using plastic embedded whole joints.</a> Histochemistry. 73, 439-446 (1981).</li><li>Böck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Romeis Mikroskopische Technik. , 1-697 (1989).</li><li>Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D., Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+analysis+of+size+and+density+of+hepatocytes+in+the+porcine+liver.">Stereological analysis of size and density of hepatocytes in the porcine liver.</a> J Anat. 230, 575-588 (2017).</li></ol>

Génération des collections échantillon biobanque de modèles animaux porcins nécessite des techniques robustes et protocoles pour la détermination des volumes d’organes et de tissus, la génération reproductible de représentant, des échantillons de tissu redondant convenant à un large éventail de Méthodes d’analyse différentes et pour la randomisation de l’orientation des sections d’échantillon pour des analyses quantitatives stéréologiques. Les méthodes décrites dans le présent article sont ada...

Dans la médecine translationnelle, les porcs sont plus en plus courants pour une utilisation comme modèles de grand animaux1,2,3,4,5, en raison de nombreuses similitudes avantageux entre le porc et anatomie et physiologie et la disponibilité de méthodes biologiques moléculaires établies permettant la génération d’adapté, modifié génétiquement des modèles de porc pour un large éventail de maladies conditions1,4.
Toutefois, par rapport aux modèles de rongeurs, le nombre d’animaux d’un modèle de cochon respectifs qui peuvent être fournis pour expériences en tout temps est limité. Cela est dû à l’intervalle de génération porcin d’environ un an et les efforts financiers et beaucoup de temps requis pour la génération de modèles de porcins et de l’élevage. Par conséquent, les animaux individuels d’un modèle porcin, ainsi que les échantillons qui peuvent être générés de ces porcs, sont très précieux, en particulier si génétiquement modifiée modèles porcines et/ou des problèmes expérimentaux à long terme (p. ex., complications tardives de maladies chroniques) sont examinées dans les individus âgés de6,2,7.
Dans le cadre de toute étude, exécution d’analyses supplémentaires, qui ne était pas prévue dans le protocole expérimental de l’étude initial pourrait plus tard se pour révéler pertinentes, par exemple, à l’adresse des questions distinctes découlant précédemment découvert résultats inattendus. Si les échantillons appropriés pour de telles expériences supplémentaires ne sont pas disponibles, coût disproportionnellement plus élevé et les dépenses de beaucoup de temps peuvent être nécessaires de produire des porcs supplémentaires et des échantillons de tissus. Pour être préparé à ces éventualités, génération de biobanque collections d’échantillons de sauvegarde conservées des différents organes, de tissus ou liquides bio, quantitativement et qualitativement adaptées pour un large éventail d’analyses ultérieures, est considéré comme un important approche2,6,7. Découlant des prestations optimales un modèle animal porcin, la disponibilité des échantillons adéquats biobanque offre également la possibilité unique pour effectuer un large éventail de méthodes d’analyse différentes sur les matériaux des échantillons identiques sur un niveau de plusieurs organes dans la même chaque animal, par exemple, par la distribution d’échantillons à des scientifiques de différents groupes de travail organisés en un réseau de recherche sur2,6,7. En outre, la stratégie d’échantillonnage '' tourné vers l’avenir '' dans les biobanques contribue également à une réduction du nombre d’animaux nécessaires dans une étude. Les avantages du modèle porcin biobanques ont récemment été démontrés dans un multi-organes, étude multiomics, orgue la diaphonie dans un modèle porcin génétiquement modifié du diabète à long terme, sur des échantillons de la biobanque de porc Munich MIDY 2.
Il y a certaines exigences obligatoires biobanque échantillons doivent généralement respecter pour établir la fiabilité et la facilité d’interprétation des résultats des analyses effectuées par la suite. Les échantillons doivent être générés de façon reproductible, et ils doivent être représentatifs, c'est-à-diresuffisamment reflétant les caractéristiques morphologiques et moléculaires intéressées des tissus ou d’organes les échantillons ont été prélevés à7. Pour convenir à un large éventail de types d’analyses en aval, les échantillons doivent être pris en quantité suffisante et traitées selon les demandes (y compris les conditions de temps et température) différentes méthodes d’analyse, y compris les descriptifs analyses histopathologiques, tels que cryohistology, paraffine et plastique histologie, immunohistochimie, hybridation in situ , analyses microscopiques électron ultrastructurales et bilans diagnostiques de laboratoire clinique, aussi bien que moléculaires analyses d’ADN, d’ARN, de protéines et de métabolites.
Pour permettre l’évaluation d’un large éventail de distinctes paramètres morphologiques quantitatifs tels que des nombres, des volumes, longueurs ou des surfaces de structures tissulaires distinctes par des analyses quantitatives stéréologiques, section randomisée des avions de la des échantillons histologiques des tissus/organes respectifs doivent être préparés à7,8,9,10,11. Dans des études morphologiques quantitatifs, la détermination précise du volume total des tissus, organes ou compartiment de l’orgue, les échantillons ont été prélevés de (c.-à-d., l’espace de référence) est d’une importance cruciale7,9 , 12 pour calculer les quantités absolues des paramètres au sein de l’organe respectif, des tissus ou organisme intéressés. Finalement, l’effet du retrait de tissu incorporation liées au cours de la préparation des coupes histologiques doit être déterminé et pris en compte13. Par conséquent, des analyses quantitatives stéréologiques, notamment des échantillons archivés (corrigé d’échantillons de tissus, tissus incorporé blocs, coupes histologiques, etc.) dans les études précédentes sont parfois12sévèrement limité, voire même impossible, surtout si la volumétrie des tissus/organes respectifs ne faisait pas, si aucun de ses designs d’échantillonnage adéquates ont été appliqués pour justifier des échantillons représentatifs, si les nombres et les quantités d’échantillons individuels disponibles ne suffisent pas, ou si le traitement de la échantillons est incompatible avec l’estimation du ou les paramètres morphologique quantitatif d’intérêt. En raison des multiples facteurs d’influence possibles, l’aptitude des matériaux archive-échantillon pour des analyses des paramètres morphologiques quantitatifs distincts impossible de répondre sans équivoque, mais dépend de l’évaluation minutieuse de chaque cas individuel.
Ainsi, comme l’emplacement, taille, nombre, traitement, direction de coupe et l’orientation des échantillons potentiellement affecte les résultats des analyses ultérieures, ces facteurs sont d’une grande importance et doivent être envisagées dans le protocole expérimental d’aucune étude. En ce qui concerne ces aspects et les particularités de l’anatomie porcin, directives d’échantillonnage complet, détaillé et à grande échelle des modèles animaux adaptés aux porcins ont récemment été créées, offrant une solide référence à standardisées et reproductibles et la production efficace de redondants, suffisamment transformés, qualité des échantillons de plus de 50 différents porcine organes et tissus6,7.
Les descriptions méthodologiques et le didacticiel vidéo montré dans le présent article prévoient détaillées, exemples, compréhensible, instructions étape par étape pour une performance pratique d’une variété de techniques de volumétrie, prélèvement d’échantillons de tissus porcins et organes et traitement des échantillons de tissus pour analyse en aval différentes méthodes. Les techniques recommandés incluent des méthodes pour la détermination des volumes d’organes et de tissus et de densités fondées sur les principes d’Archimède et Cavalieri9, y compris la détermination des dimensions de rétrécissement en trois dimensions des tissus associés à la intégration dans différents encastrement médias14 pendant le traitement pour examen histologique, application d’échantillonnage aléatoire systématique possible pondérée en fonction du volume s’approche, traitement des échantillons de tissus prélevés pour différents ultérieures analyses7,8,9,15et génération de convenablement orienté et traitement échantillons pour potentiel des analyses quantitatives stéréologique7,8, 9,10,11. À côté de leur application dans des projets porcins biobanque, les méthodes démontrées sont généralement appropriées pour toutes les études examinant les propriétés histo-morphologiques quantitatifs des organes/tissus. En outre, conceptions de l’échantillonnage aléatoire systématique sont particulièrement bénéfiques pour la génération d’échantillons représentatifs dans les expériences à l’aide de méthodes d’analyse moléculaire pour détecter les altérations de l’abondance de, par exemple, ARN, protéines ou métabolites dans différents organes et tissus.
Les sections suivantes fournissent une brève introduction à ces méthodes, tandis que leur performance pratique est décrite dans la section protocole.
Détermination des volumes d’organes et de tissus Détermination du poids des organes et des volumes est importante dans plusieurs paramètres expérimentaux, que ces facteurs pourraient indiquer des changements, potentiellement liées à expérimentalement examiné les facteurs d’intérêt. Le volume total d’un organe ou le tissu est aussi communément requis pour calculer les paramètres quantitatifs absolues, (par exemple, le nombre total de cellules), des densités de volume numérique stereologically estimé (c.-à-d., le nombre de cellules par unité de volume du tissu)7,12. En dehors des techniques utilisant des équipements techniques complexes, comme la tomographie par ordinateur, il existe essentiellement trois méthodes pratiques habituellement utilisées pour déterminer le volume absolu d’un organe ou tissu. Le volume d’un organe peut être déterminé par « mesure volumétrique directe » selon le principe d’Archimède, c'est-à-dire, en mesurant le volume d’eau ou une solution saline déplacés par la structure lorsqu’il est complètement submergé. Toutefois, pour relativement grandes orgues porcins, ces approches sont impraticable et enclin à l’imprécision, car ils nécessitent des flacons volumétrique/de mesure très large. Plus commodément, le volume d’un organe/tissu peut être calculé à partir de son poids et la densité7,12,16, qui peut efficacement être déterminé à l’aide de la « méthode de submersion »7,12 ,16 (étape de protocole 1.1.). Volumes d’organes et de tissus peuvent également être estimés à l’aide de la volumétrie des approches basées sur le « principe de Cavalieri » (1598-1647). En termes simples, le principe de Cavalieri stipule, que si deux objets sont sectionnées dans des plans parallèles à un plan de masse, et les profils des sections coupent par le biais de deux objets au correspondant distance depuis le plan de masse ont les mêmes zones, les deux objets ont le même volume. Ainsi, on peut estimer le volume d’objets façonnés arbitrairement comme le produit de leurs zones de profil de section dans les plans de coupe parallèle, tout aussi lointain et la distance entre les plans de coupe. C’est compréhensible avec l’analogie suivante : considérons deux cheminées comprenant le même nombre de pièces identiques sont placées côte à côte, une pile avec la pièces de monnaie ordonnée empilée les uns sur les autres ce qui donne une forme cylindrique de la pile de la pièce et l’autre empilement de pièces de monnaie avec décentré placé pièces (Figure 3 a). Bien que les formes des deux cheminées de la pièce sont différents, leurs volumes sont identiques, depuis les zones des pièces à des niveaux correspondants de deux piles (c'est-à-direles zones des profils de sections parallèles coupent par les deux cheminées de la pièce à égale distance de la au sol) sont identiques. Estimation des volumes d’organes porcins et de tissus en utilisant le principe de Cavalieri7,12,15 est décrit à l’étape 1.2.
Détermination de l’étendue du retrait des tissus associé à enrobage histologique Dans les analyses de plusieurs paramètres morphologiques quantitatifs mesurés dans des coupes de tissus histologiques, l’effet de rétraction tissulaire liées à enrobage survenant pendant le traitement pour l’histologie des tissus doit être déterminé et pris en compte. L’ampleur du retrait de tissu liées à enrobage peut être variable et dépend à la fois sur le tissu, son traitement et l’incorporation moyenne8,13,17,18,19. Généralement, les changements liés à enrobage du volume d’un échantillon de tissu (c'est-à-dire, pour la plupart de rétrécissement) se produisent dans les trois dimensions de l’espace et, par conséquent, affecte tous les paramètres dimensionnels estimées par des analyses quantitatives stéréologiques8 . Fondamentalement, l’ampleur du retrait de tissu incorporation liées, exprimé comme le facteur de rétrécissement des tissus linéairefS, peut être estimée comme indiqué dans l’étape 1.3. et utilisés pour la correction des paramètres morphologiques quantitatifs (rétrécissement sensible)14.
Échantillonnage aléatoire systématique pondérée en fonction du volume des organes/tissus Création d’une biobanque de collection des échantillons d’organes et de tissus porcins, approches d’échantillonnage aléatoire systématique pondérée en fonction du volume tel que décrits à l’étape 2 se sont avérés pour être pratiques, rapide et efficaces des techniques de génération de représentant, tissu multi-usage échantillons7,8,9,15.
Génération d’isotrope uniforme aléatoire et des sections verticales uniforme aléatoire pour les analyses quantitatives stéréologiques Biobank échantillons de tissus doivent être adapté pour un large éventail de méthodes différentes analyse stéréologique quantitative pour l’estimation d’un maximum de paramètres qui ne peut être déterminée sans un spécimen bien préparé. Presque tous les paramètres stéréologiques quantitatives peuvent être déterminés, en utilisant « isotrope (indépendant) uniforme aléatoire (IUR) sections »8,9. Dans les sections IUR, l’orientation tridimensionnelle du plan de la section de l’échantillon de tissu est aléatoire. Ceci peut être réalisé par randomisation de la position de l’échantillon de tissu par rapport à la position de l’avion de la section, tel qu’appliqué dans le « Isector » méthode11 (étape 3.1 du protocole), ou par randomisation de l’orientation du plan de la section relative à la échantillon de tissu, comme dans la méthode « Orienteur »10 (étape 3.2 du protocole). Dans les échantillons de tissus, comme la peau ou la muqueuse spécimen affichant un axe vertical naturellement présent, ou défini et correctement identifiable, préparation des « vertical uniforme aléatoire (RVU) sections » (pas de protocole 3.3.) sectionné strictement dans le plan de leur axe vertical est avantageuse8,20. Pour un discours complet des fondements théoriques de l’échantillonnage IUR/VUR et un examen approfondi des potentiels en aval analyses stéréologiques quantitatives, le lecteur intéressé est dénommé les manuels de stéréologie quantitative dans la vie Sciences8,9.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Carl Roth GmbH, Germany</td>
			<td>Agar (powder), Cat.: 5210.3</td>
			<td>Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany</td>
			<td>Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902</td>
			<td>Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casting molds (metal)</td>
			<td>Engelbrecht Medizin &#38; Labortechnik, Ederm&#252;nde, Germany</td>
			<td>Einbettsch&#228;lchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b</td>
			<td>Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm)</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.&#160; Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard &#38; Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux&#180;s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)</td>
			<td>Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China</td>
			<td>Y10006 and Y10005</td>
			<td>Any other type of standard office foldback clamps will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (anatomical)</td>
			<td>NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811</td>
			<td>Any type of anatomical forceps will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde-solution 4%</td>
			<td>SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany</td>
			<td>Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005</td>
			<td>Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph paper (for calibration)</td>
			<td>B&#252;romarkt B&#246;ttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de</td>
			<td>Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514</td>
			<td>Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)</td>
			<td>NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Becherglas SIMAX&#174; , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036</td>
			<td>Any kind of glass- or plastic beakers of 5 &#8211; 100 ml volume will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory scale(s)</td>
			<td>Mettler Toledo GmbH, Gie&#223;en, Germany</td>
			<td>PM6000</td>
			<td rowspan="2">Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Sartorius AG, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>BP61S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Engelbrecht Medizin &#38; Labortechnik, Ederm&#252;nde, Germany</td>
			<td>FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700</td>
			<td>Any kind of single-use microtome blades will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Morphometry/planimetry software/system</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss-Kontron, Eching, Germany</td>
			<td>VideoplanTM image analysis system</td>
			<td>Out of stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D40</td>
			<td>Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod&#160; will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transparencies</td>
			<td>Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany</td>
			<td>Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:&#160; 3562</td>
			<td>Any (laser)-printable plastic transparency will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random number tables</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Plano GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td>T5016</td>
			<td>Any kind of razor blades will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler</td>
			<td>B&#252;romarkt B&#246;ttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de</td>
			<td>Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30</td>
			<td>Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline (0.9%)</td>
			<td>Carl Roth GmbH, Germany</td>
			<td>Natriumchlorid, &#62;99% Cat.: 0601.1</td>
			<td>To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Aesculap AG &#38; Co KG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>BRAUN Surgical blades N&#176;22</td>
			<td>Any kind of scalpel blades will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanner</td>
			<td>Hewlett-Packard</td>
			<td>hp scanjet 7400c</td>
			<td>Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicing devices</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.&#160; Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)</td>
			<td>Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany</td>
			<td>Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm</td>
			<td>Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin wire</td>
			<td>Basteln &#38; Hobby Schobes, Stra&#223;furth, Germany. www,bastel-welt.de</td>
			<td>Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742</td>
			<td>Any other kind of thin wire will also do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue paper</td>
			<td>NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305</td>
			<td>Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof pen</td>
			<td>Staedler Mars GmbH &#38; Co KG, N&#252;rnberg, Grmany</td>
			<td>Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2</td>
			<td>Any other kind of waterproof pen will do as well.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sampling strategies and processing of biobank tissue samples from porcine biomedical models

Pour la recherche translationnelle, modèles porcines sont progressivement devenus plus populaires. Étant donné la valeur élevée de chaque animal, en particulier des porcs génétiquement modifiés, modèles et le nombre souvent limité d’animaux disponibles de ces modèles, création de collections (biobanque) des échantillons de tissu suffisamment transformés adapté pour un large spectre des méthodes d’analyses subséquentes, y compris les analyses non précisés à l’instant d’échantillonnage, représentent des approches utiles pour profiter pleinement de la valeur translationnelle du modèle. En ce qui concerne les particularités de l’espèce porcine anatomie, des lignes directrices exhaustives ont récemment été établies pour génération normalisée de représentant, échantillons de haute qualité provenant de différents organes porcins et tissus. Ces lignes directrices sont des conditions essentielles pour la reproductibilité des résultats et la comparaison entre différentes études et les enquêteurs. L’enregistrement des données de base, tels que le poids des organes et volumes, la détermination des sites d’échantillonnage et du nombre d’échantillons de tissus à générer, ainsi que leur orientation, taille, traitement et directions de coupe, est des facteurs pertinents détermination de la généralisation et la convivialité de l’échantillon pour des analyses morphologiques moléculaires, qualitatives et quantitatives. Ici, une démonstration illustrative, pratique, étape par étape des techniques plus importantes pour la production de représentant, biobanque multi-usages spécimen provenant de tissus porcins est présenté. Les méthodes décrites ici incluent la détermination de volumes d’organes et de tissus et de la densité, l’application d’une procédure d’échantillonnage aléatoire systématique pondérée en fonction du volume pour les organes parenchymateux par comptage point, détermination de l’étendue du retrait de tissu associés à enrobage histologique des échantillons et génération d’échantillons orientés au hasard pour des analyses quantitatives stéréologiques, comme isotrope uniforme aléatoire (IUR) sections générées par les méthodes « Orientation » et « Isector » et vertical uniforme sections (RVU) aléatoires.

Technique d’immersion pour détermination de la masse de tissus ou d’organes
Figure 12 a -B montre la détermination représentative de la densité et le volume d’un rein de porc en utilisant la technique d’immersion décrite à l’étape 1.1 (Figure 1, Figure 2). Des résultats plus représentatifs des mesures de la ...

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Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

Stratégies d’échantillonnage et traitement des échantillons de tissu de la biobanque de modèles biomédicaux porcins

L’application pratique et les performances des méthodes pour la génération d’échantillons de tissus représentant des modèles animaux porcins pour un large éventail d’analyses en aval dans les projets de la biobanque sont démontrées, y compris la volumétrie, l’échantillonnage aléatoire systématique, et le traitement différencié des échantillons de tissus pour les types d’analyses qualitatives et quantitatives, morphologiques et moléculaires.

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

This video demonstrates two key techniques for sampling and processing biobank porcine tissue specimens. The submersion technique reliably estimates total organ and tissue volume and the orientator technique generates random isotropic tissue sections for unbiased estimation of quantitative morphological parameters. The main advantage of the submersion technique for tissue density determination is that it can be applied to any kind of tissue and that it produces reliable results for small as well as for large samples.The advantages of the orientator technique are that it is highly efficient and also works with large tissue samples. To begin volumetry for a large organ excise an appropriately sized piece of tissue from the organ. Carefully swab the sample with a paper towel to remove excess blood and tissue fluid.Then weigh the sample on a precision scale and record the weight of the sample. Add 0.9%saline to a beaker of suitable size. Do not completely fill the beaker to prevent overflow during tissue emersion.Place the beaker on the scale then submerge a forceps or a self-constructed sample holder in the saline until the mark on the forceps or sample holder reaches the liquid. Next, reset the display of the scale to zero. Carefully attach the tissue sample to the forceps or sample holder and completely submerge the sample in the saline until the marked position is reached.To record reliable density measurements it is important to ensure that the sample is completely submerged and to avoid any contact of the submerged sample to the inner walls or the bottom of the beaker. While holding the sample in position, record the weight displayed on the scale. Use this measurement and the density of saline at room temperature to calculate the volume of the sample.Then calculate the density of the tissue sample from the weight of the sample and its volume. For large organs and tissues, such as this kidney, perform repeated measurements with multiple samples and calculate the average density from the single measurements. For small samples and small organs measured in total such as the pituitary gland, repeat the measurement three times before calculating the average organ density from the single measurement values.Finally, calculate the total volume of the organ, tissue or organ compartment from its weight and density. Place a fixed tissue specimen on a print of an equiangular circle with one edge parallel to the zero to 180 degree direction. Then use a random number table to determine a random angle.Find the corresponding marks on the scale of the equiangular circle. Using these marks, cut a section through the sample with the section plane oriented parallel to the direction of the random angle indicated on the scale of the equiangular circle and a vertical to the resting surface of the sample. Place the tissue block with the section surface facing down on a cosine weighted circle.With the edge of the resting surface placed parallel to the one-to-one direction. Now cut a new section through the sample at a random angle determined using the random number table. The resulting section plane is an isotropic uniform random section.This table shows the representative densities of several porcine tissues and organs determined using the submersion technique. Most porcine tissues display density values slightly higher than one referring to the density of water. Whereas tissues swimming in saline, such as adipose tissue for example, display densities lower than one.This figure shows four representative IUR sections of porcine left ventricular myocardium prepared with the orientator technique. Note the changed cutting angles in the different IUR sections. Once mastered, the submersion technique for tissue density determination can be done in a few minutes.If it is performed properly. Isotropic uniform random tissue sections generated with the orientator technique are suitable for estimation of any quantitative morphological parameters using appropriate stereological analysis methods. digital music.

Research

JoVE Journal

Medicine

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Génération d&#39;alginate de microsphères pour des applications biomédicales

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

Recherche

Médecine

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Comment mesurer pliant corticale à partir d&#39;images IRM: un tutoriel pas-à-pas à calculer l&#39;indice gyrification locale

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Traitement des tissus de tumeur cérébrale primaire pour les essais sur les cellules souches et les flux de tri

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

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Le bovine poumon dans la recherche biomédicale: visuellement guidée bronchoscopie, intrabronchique vaccination et<em&gt; In Vivo</em&gt; Techniques d&#39;échantillonnage

There is an ongoing search for alternative animal models in research of respiratory medicine. Depending on the goal of the research, large animals as ...

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Absorption de liquides nasales et bronchiques : échantillonnage Precision de la muqueuse respiratoire humaine et traitement des échantillons en laboratoire

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

Amélioration d’un modèle de porcins infarctus du myocarde de thorax fermé par normalisation des tissus et des procédures d’échantillonnage de sang

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Human Subcutaneous Adipose Tissue Sampling Using a Mini-Liposuction Technique

Prélèvement de tissu adipeux sous-cutané humain à l’aide d’une technique de mini-liposuccion

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Extraction of Diatom DNA from Water Samples and Tissues

Pleins feux sur l’auteur : Test de diatomées pour l’examen médico-légal de la noyade 

Extraction de l’ADN des diatomées à partir d’échantillons d’eau et de tissus

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. ...