Name: sampling strategies and processing of biobank tissue samples from porcine biomedical models
Uploaded: 2018-03-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models at JoVE.com

Die Autoren danken Lisa Pichl für ausgezeichnete technische Unterstützung.

Alle beschriebene Methoden verwenden hier Gewebeproben von toten Tieren stammen und uneingeschränkt mit den deutschen gesetzlichen Bestimmungen des Tierschutzes.
(1) Volumetrie
<ol><li>Untertauchen Technik zur Bestimmung der Dichte Gewebe/Organ (Abbildung 1 und Abbildung 2) 7 , 12 , 16<o...

<ol>
	<li>Aigner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+pigs+as+models+for+translational+biomedical+research.">Transgenic pigs as models for translational biomedical research.</a> J Mol. Med. 88, 653-664 (2010).</li><li>Blutke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Munich+MIDY+Pig+Biobank:+A+unique+resource+for+studying+organ+crosstalk+in+diabetes.">The Munich MIDY Pig Biobank: A unique resource for studying organ crosstalk in diabetes.</a> Mol Metab. 6, 931-940 (2017).</li><li>Klymiuk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-deficient+pigs+provide+new+insights+into+the+hierarchy+of+physiological+derangements+of+dystrophic+muscle.">Dystrophin-deficient pigs provide new insights into the hierarchy of physiological derangements of dystrophic muscle.</a> Hum Mol Genet. 22, 4368-4382 (2013).</li><li>Klymiuk, N., Seeliger, F., Bohlooly, Y. M., Blutke, A., Rudmann, D. G., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailored+pig+models+for+preclinical+efficacy+and+safety+testing+of+targeted+therapies.">Tailored pig models for preclinical efficacy and safety testing of targeted therapies.</a> Toxicol Pathol. 44, 346-357 (2016).</li><li>Renner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permanent+neonatal+diabetes+in+INSC94Y+transgenic+pigs.">Permanent neonatal diabetes in INSC94Y transgenic pigs.</a> Diabetes. 62, 1505-1511 (2013).</li><li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inside+the+first+pig+biobank.">Inside the first pig biobank.</a> Nature. 519, 397-398 (2015).</li><li>Albl, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+sampling+guides+for+porcine+biomedical+models.">Tissue sampling guides for porcine biomedical models.</a> Toxicol Pathol. 44, 414-420 (2016).</li><li>Gundersen, H. J. G., Mirabile, R., Brown, D., Boyce, R. W., Haschek, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+principles+and+sampling+procedures+for+toxicologic+pathologists.">Stereological principles and sampling procedures for toxicologic pathologists.</a> Haschek and Rousseaux's Handbook of Toxicologic Pathology. , 215-286 (2013).</li><li>Howard, C. V., Reed, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. , 1-277 (2005).</li><li>Mattfeldt, T., Mall, G., Gharehbaghi, H., Moller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+surface+area+and+length+with+the+orientator.">Estimation of surface area and length with the orientator.</a> J Microsc. 159, 301-317 (1990).</li><li>Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isector:+A+simple+and+direct+method+for+generating+isotropic,+uniform+random+sections+from+small+specimens.">The isector: A simple and direct method for generating isotropic, uniform random sections from small specimens.</a> J Microsc. 165, 427-431 (1992).</li><li>Tschanz, S., Schneider, J. P., Knudsen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereology:+Planning,+volumetry+and+sampling+are+crucial+steps+for+a+successful+study.">Design-based stereology: Planning, volumetry and sampling are crucial steps for a successful study.</a> Ann Anat. 196, 3-11 (2014).</li><li>Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+shrinkage+and+unbiased+stereological+estimation+of+particle+number+and+size.">Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size.</a> J Microsc. 204, 232-246 (2001).</li><li>Mattfeldt, T., Doerr, W., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereologische+Methoden+in+der+Pathologie+[Stereologic+methods+in+pathology].">Stereologische Methoden in der Pathologie [Stereologic methods in pathology].</a> Normale und pathologische Anatomie. , (1990).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology+and+its+prediction.">The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction.</a> J Microsc. 147, 229-263 (1987).</li><li>Scherle, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+volumetry+of+organs+in+quantitative+stereology.">A simple method for volumetry of organs in quantitative stereology.</a> Mikroskopie. 26, 57-60 (1970).</li><li>Nielsen, K. K., Andersen, C. B., Kromann-Andersen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+the+effects+of+paraffin+and+plastic+embedding+of+the+normal+and+obstructed+minipig+detrusor+muscle+using+the+optical+disector.">A comparison between the effects of paraffin and plastic embedding of the normal and obstructed minipig detrusor muscle using the optical disector.</a> J Urol. 154, 2170-2173 (1995).</li><li>Schneider, J. P., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+mouse+lung+tissue+dimensions+during+processing+for+morphometry:+a+comparison+of+methods.">Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L341-L350 (2014).</li><li>von Bartheld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+particles+in+the+z-axis+of+tissue+sections:+Relevance+for+counting+methods.">Distribution of particles in the z-axis of tissue sections: Relevance for counting methods.</a> NeuroQuantology. 10, 66-75 (2012).</li><li>Baddeley, A. J., Gundersen, H. J., Cruz-Orive, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+surface+area+from+vertical+sections.">Estimation of surface area from vertical sections.</a> J microsc. 142, 259-276 (1986).</li><li>Blutke, A., Schneider, M. R., Wolf, E., Wanke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+hormone+(GH)-transgenic+insulin-like+growth+factor+1+(IGF1)-deficient+mice+allow+dissociation+of+excess+GH+and+IGF1+effects+on+glomerular+and+tubular+growth.">Growth hormone (GH)-transgenic insulin-like growth factor 1 (IGF1)-deficient mice allow dissociation of excess GH and IGF1 effects on glomerular and tubular growth.</a> Physiol Rep. 4, e12709 (2016).</li><li>Hermanns, W., Liebig, K., Schulz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembedding+immunohistochemical+demonstration+of+antigen+in+experimental+polyarthritis+using+plastic+embedded+whole+joints.">Postembedding immunohistochemical demonstration of antigen in experimental polyarthritis using plastic embedded whole joints.</a> Histochemistry. 73, 439-446 (1981).</li><li>Böck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Romeis Mikroskopische Technik. , 1-697 (1989).</li><li>Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D., Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bancroft's theory and practice of histological techniques. , 1-654 (2013).</li><li>Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+estimates+of+alveolar+number+and+size+and+capillary+length+and+surface+area+in+mice+lungs.">Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs.</a> Anat Rec (Hoboken). 292, 113-122 (2009).</li><li>Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+for+stereology+in+lungs.">Sampling for stereology in lungs.</a> Eur Respir Rev. 15, 107-114 (2006).</li><li>Junatas, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+analysis+of+size+and+density+of+hepatocytes+in+the+porcine+liver.">Stereological analysis of size and density of hepatocytes in the porcine liver.</a> J Anat. 230, 575-588 (2017).</li></ol>

Generation der Biobank Musterkollektionen von porcinen Tiermodellen erfordert robuste Techniken und Protokolle zur Bestimmung von Organgewebe/Volumen, die reproduzierbare Generation des Vertreters, redundante Gewebeproben geeignet für ein breites Spektrum von verschiedenen Analysemethoden und Randomisierung der Ausrichtung der Probe Abschnitte für quantitative stereologischen Analysen. In diesem Artikel beschriebenen Methoden sind die Größen von porcinen Organen und Geweben angepasst und wurden entwickelt, um effekti...

In der translationalen Medizin, Schweine sind immer häufiger für den Einsatz als großes Tier1,2,3,4,5, wegen mehrere vorteilhafte Ähnlichkeiten zwischen den Schweinen Modelle und menschliche Anatomie und Physiologie und die Verfügbarkeit von etablierten molekularbiologischen Methoden ermöglichen Generation zugeschnitten, gentechnisch veränderte Schweine-Modelle für ein breites Spektrum von Krankheiten Bedingungen1,4.
Jedoch beschränkt sich im Vergleich zu Nager-Modelle, die Zahl der Tiere eines jeweiligen Schwein-Modells, das für Experimente jederzeit zur Verfügung gestellt werden können. Dies liegt an den Schweinen Generierungsintervall von ca. einem Jahr und den finanziellen und zeitintensiven Aufwand für die Erzeugung von porcinen Modelle und Tierhaltung. Daher sind einzelne Tiere von porcinen Modell sowie die Proben, die von diesen Schweinen generiert werden können sehr wertvoll, vor allem, wenn gentechnisch veränderte Schweine Modelle und/oder langfristige experimentelle Probleme (z.B., Spätfolgen der chronische Krankheiten) sind Personen im Alter von2,6,7untersucht.
Im Rahmen einer Studie Leistung weitere Analysen, die nicht in der ersten experimentellen Design der Studie geplant hatte vielleicht später erweisen sich als relevant, z.B.Adresse, verschiedene Fragen, die bisher entdeckt, unerwartete Ergebnisse. Wenn geeignete Beispiele für solche zusätzliche Experimente nicht verfügbar sind, möglicherweise unverhältnismäßig hohe Kosten und zeitintensive Ausgaben erzeugen zusätzliche Schweine und Gewebeproben erforderlich. Um für solche Eventualitäten vorbereitet zu sein, gilt Generation der Biobank Sammlungen von konservierten Back-up Proben von verschiedenen Organen, Geweben oder Bio-Flüssigkeiten, quantitativ und qualitativ geeignet für ein breites Spektrum der nachfolgenden Analysen, eine wichtige Ansatz2,6,7. Porcines Tiermodell optimale Vorteile ableiten, die Verfügbarkeit von angemessenen Biobank Proben auch bietet die einmalige Möglichkeit zum Ausführen eines breiten Spektrums an verschiedenen Analysemethoden für identische Probematerialien auf einer Multi-Organ-Ebene in der gleichen einzelne Tiere, z. B.durch Verteilung der Proben an Wissenschaftler der verschiedenen Arbeitsgruppen organisiert in einem Forschung Netzwerk2,6,7. Darüber hinaus trägt die '' vorausschauende '' Probenahmestrategie in Biobanking auch zu einer Verringerung der Anzahl der Tiere in einer Studie erforderlich. Die Vorteile von porcinen Modell Biobanking wurden vor kurzem in einem Multi-Organ, Multiomics Studie, Orgel nachgewiesen Übersprechen in einem genetisch veränderten porcinen Modell des langfristigen Diabetes Mellitus, mit Proben aus München MIDY Schwein Biobank 2.
Es gibt einige Anforderungen, die Biobank Proben in der Regel einhalten müssen, um die Zuverlässigkeit und die Interpretierbarkeit der Ergebnisse der anschließend durchgeführten Analysen zu etablieren. Die Proben reproduzierbar erzeugt werden müssen, und sie müssen repräsentativ, d.h.angemessen reflektiert interessierte morphologischen und molekularen Eigenschaften des Gewebes/Organs die Proben7 entnommen wurden. Geeignet für eine Vielzahl von nachgelagerten Analysetypen werden muss die Proben in ausreichenden Mengen genommen und entsprechend den Anforderungen (einschließlich Zeit und Temperatur) der verschiedenen analytischen Methoden, einschließlich beschreibende verarbeitet werden histopathologische Untersuchungen, wie Cryohistology, Paraffin und Kunststoff Histologie, Immunhistochemie, in Situ Hybridisierung, Ultrastrukturforschung Elektron mikroskopische Analysen und klinische diagnostische Laboranalysen, sowie molekulare Analyse von DNA, RNA, Proteinen und Metaboliten.
Um die Bewertung einer Vielzahl deutliche quantitative morphologische Parameter wie Zahlen, Mengen, Längen oder Flächen unterschiedliche Gewebestrukturen durch quantitative stereologischen Analysen ermöglichen, randomisierte Abschnitt Flugzeuge von der histologische Proben der jeweiligen Organe/Gewebe7,8,9,10,11vorbereitet werden müssen. In quantitativen morphologische Studien, die präzise Bestimmung des Gesamtvolumens der Gewebe, Organ oder Fach Orgel, die Proben entnommen wurden (d. h., die Referenz-Raum) ist von entscheidender Bedeutung7,9 , 12 die absoluten Mengen der interessierten Parameter innerhalb der jeweiligen Organ, Gewebe oder Organismus zu berechnen. Schließlich wirkt Einbettung bezogene Gewebe schrumpfen während der Vorbereitung der histologischen Abschnitte bestimmt und Konto13berücksichtigt werden. Daher sind quantitative stereologischen Analysen, vor allem der archivierten Proben (feste Gewebeproben, eingebettete Gewebe Blöcke, histologische Abschnitte, etc.) aus früheren Studien manchmal stark eingeschränkt oder sogar unmöglich12, besonders wenn Volumetrie der jeweiligen Organe/Gewebe nicht durchgeführt wurde, wenn keine angemessene Stichproben Designs angewendet wurden, um repräsentative Proben zu rechtfertigen, wenn die Zahlen und Mengen zur Verfügung einzelner Samples nicht ausreichen, oder wenn die Verarbeitung der Proben ist unvereinbar mit der Schätzung des quantitativen morphologische Parameter von Interesse. Aufgrund der vielfältigen möglichen Einflussfaktoren die Eignung der Archiv-Mustermaterialien für Analysen deutliche quantitative morphologische Parameter kann nicht eindeutig beantwortet werden, aber die sorgfältige Beurteilung des Einzelfalls abhängig.
So wie die Lage, Größe, Anzahl, Verarbeitung, trimmen Richtung und Ausrichtung der Proben die Ergebnisse der nachfolgenden Analysen betreffen werden, diese Faktoren sind von großer Bedeutung und müssen in den Versuchsplan Studie betrachtet werden. Im Hinblick auf diese Aspekte und Besonderheiten der porcinen Anatomie, umfassende, detaillierte und umfangreiche Sampling-Richtlinien angepasst porcinen Tiermodelle vor kurzem eingerichtet wurden, bieten einen robuste Verweis auf standardisierte, reproduzierbare , und effiziente Erzeugung von redundanten, adäquat verarbeitet, hochwertige Proben aus mehr als 50 verschiedene porcinen Organen und Geweben6,7.
Die methodischen Beschreibungen und das video-Tutorial gezeigt in diesem Artikel bieten detaillierte, anschauliche, verständliche, Schritt-für-Schritt-Anleitungen für praktische Leistung eine Vielzahl von Techniken für die Volumetrie, Beprobung von porcinen Gewebe und Organe und Verarbeitung von Gewebeproben nach verschiedenen nachgeschalteten Analysemethoden. Die vorgestellten Techniken gehören Methoden zur Bestimmung von Organgewebe/Volumen und Dichte basierend auf den Prinzipien von Archimedes und Cavalieri9, einschließlich der Bestimmung der Abmessungen der dreidimensionalen Schrumpfung des Gewebes im Zusammenhang mit der Einbettung in verschiedenen Einbetten von Medien14 während der Verarbeitung für histologische Untersuchung, Anwendung von praktikablen volumengewichteten systematische Stichproben nähert, Verarbeitung von gesampelten Gewebemustern für verschiedene spätere Analysen7,8,9,15und Generation entsprechend orientiert und Beispiele für mögliche quantitative stereologischen Analysen7,8verarbeitet, 9,10,11. Neben ihrer Anwendung in porcinen Biobank Projekte eignen sich die Methoden in der Regel für alle Studien, die quantitative Histo-morphologische Eigenschaften der Organe/Gewebe. Darüber hinaus sind systematische Stichproben Entwürfe besonders vorteilhaft für die Erzeugung von repräsentativen Proben bei Experimenten mit molekulare Analysemethoden Fülle Änderungen, z. B., RNAs, Proteine oder Metaboliten in erkennen verschiedenen Organen und Geweben.
Die nächsten Absätze geben eine kurze Einführung in diese Methoden während ihrer praktischen Leistung im Abschnitt Protokoll beschrieben wird.
Bestimmung der Organgewebe/Volumen Bestimmung der Orgel Gewichte und Volumina ist wichtig in mehrere experimentelle Einstellungen, wie diese Faktoren könnte darauf hindeuten Änderungen, die möglicherweise im Zusammenhang mit experimentell untersucht Faktoren von Interesse. Das Gesamtvolumen der ein Organ/Gewebe ist häufig auch erforderlich, um absolute quantitative Parameter (z.B., die gesamte Zellzahl), von stereologically geschätzten numerische Volumen Dichte (d. h., die Anzahl der Zellen pro Volumeneinheit zu berechnen des Gewebes)7,12. Neben Techniken mit komplexen technischen Ausstattung, wie die Computertomographie gibt es grundsätzlich drei praktische Methoden häufig verwendet, um das absolute Volumen eines Organs oder Gewebes bestimmen. Das Volumen eines Organs kann durch "direkte volumetrische Messung", nach dem Prinzip des Archimedes, d. h., Messung des Volumens von Wasser oder Kochsalzlösung verdrängt durch die Struktur als völlig untergetaucht ermittelt werden. Sind jedoch vergleichsweise große Schweine Organe, diese Ansätze unpraktisch und fehleranfällig Ungenauigkeit, da sie sehr große volumetrische/Messung Flaschen erfordern. Bequemer, kann die Lautstärke von einem Organ/Gewebe aus Gewicht und Dichte7,12,16, berechnet die effizient ermittelt werden können, mit dem "eintauchen-Methode"7,12 ,16 (Protokoll Schritt 1.1.). Organgewebe/Mengen können auch mit Volumetrie Konzepte basieren auf dem "Prinzip von Cavalieri" (1598 – 1647) geschätzt werden. In einfachen Worten das Prinzip von Cavalieri heißt es, wenn zwei Objekte in Ebenen parallel zu einer Grundebene geschnitten sind, und die Profile der Abschnitte durch die beiden Objekte an entsprechenden geschnitten Entfernungen von der Bodenebene haben die gleichen Bereiche, die zwei Objekte haben Sie das gleiche Volumen. So kann das Volumen der beliebig geformte Objekte als das Produkt der ihre Profilbereiche der Abschnitt in parallel, gleich weit entfernt Schnittebenen und der Abstand zwischen der Schnittebenen geschätzt werden. Dies ist verständlich mit die folgende Analogie: betrachten zwei Stapel, bestehend aus der gleichen Anzahl von identischen Münzen sind nebeneinander, einen Stapel mit den Münzen ordentlich übereinander nachgeben eine zylindrische Form des Stapels Münze, und die andere Stapel von Münzen mit außermittig positioniert Münzen (Abb. 3A). Die Formen der beiden Münze-Stacks sind, zwar unterschiedlich deren Volumen sind die gleichen, da die Bereiche der Münzen auf entsprechenden Ebenen der beiden Stapel (d.h., die Bereiche von Profilen von parallelen Abschnitten durchschneiden beide Münze-Stacks in gleichen Abständen von der den Boden) sind identisch. Schätzung der Mengen an Schweinen Organen und Geweben mit Cavalieri Prinzip7,12,15 ist in Schritt 1.2 beschrieben.
Bestimmung des Ausmaßes der Gewebe Schrumpfung im Zusammenhang mit histologische Einbettung In den Analysen über mehrere quantitative morphologischen Parametern gemessen in histologische Gewebeschnitte wirkt Einbettung bezogene Gewebe Schrumpfung während der Verarbeitung für Histologie Gewebe ermittelt und berücksichtigt werden. Das Ausmaß der Einbettung im Zusammenhang mit Gewebe schrumpfen kann variabel sein und richtet sich sowohl auf das Gewebe, dessen Verarbeitung und Einbetten von mittleren8,13,17,18,19. Im Allgemeinen auftreten Einbettung im Zusammenhang mit Änderungen des Volumens der eine Gewebeprobe (d. h.vor allem Schrumpfung) in allen drei Dimensionen von Raum und daher, wirkt sich auf alle Maßparameter durch quantitative stereologischen Analysen8 geschätzt . Grundsätzlich kann das Ausmaß der Einbettung im Zusammenhang mit Gewebe schrumpfen, ausgedrückt als die lineare Gewebe Schrumpfungsfaktor (fS), geschätzt werden, wie in Schritt 1.3 gezeigt. und für die Korrektur (Schrumpf-Sensitive) quantitative morphologische Parameter14verwendet.
Volumengewichteten systematische Stichproben der Organe/Gewebe Für die Einrichtung einer Biobank-Sammlung von porcinen Orgel/Gewebeproben erwiesen volumengewichteten systematische Stichproben Ansätze wie in Schritt 2 beschriebenen sich praktische, zeitsparende und effiziente Techniken für Generation des Vertreters, Mehrzweck-Gewebe Proben7,8,9,15.
Generation von isotropen einheitliche zufälligen Abschnitten und vertikale einheitliche zufällige für quantitative stereologischen Analysen Biobank Gewebeproben müssen für eine Vielzahl von verschiedenen stereologischen quantitative Analysemethoden für die Schätzung von maximal Parameter geeignet, die nicht ohne einen entsprechend vorbereiteten Probe ermittelt werden konnte. Fast alle quantitativen stereologischen Parameter können bestimmt werden, mit "isotrop (parteilos) einheitliche zufällige (IUR) Abschnitte"8,9. In IUR Abschnitten ist die dreidimensionale Ausrichtung der Schnittebene von der Gewebeprobe randomisiert. Kann dies durch Randomisierung der Position der Gewebeprobe relativ zur Position der Schnittebene, wie in der "Isector" Methode11 (Protokoll Schritt 3.1) oder durch Randomisierung der Ausrichtung der Schnittebene bezogen auf die Gewebeprobe, wie in der "Orientator" Methode10 (Protokoll Schritt 3.2). In Gewebeproben, wie Haut oder Schleimhaut Exemplar zeigt eine natürlicherweise, oder definierte und einwandfrei identifizierbare vertikale Achse, Vorbereitung der "einheitlichen zufällige (VUR) Vertikalschnitten" (Protokoll Schritt 3.3.) streng geschnittene innerhalb der Ebene von ihren vertikale Achse ist vorteilhaft8,20. Für eine vollständige Diskurs der die theoretischen Grundlagen der IUR/VUR Probenahme und eine umfassende Diskussion über nachgeschaltete quantitative stereologischen Potenzialanalysen wird der interessierte Leser zu den Lehrbüchern der quantitativen Stereologie im Leben bezeichnet. Wissenschaften8,9.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Carl Roth GmbH, Germany</td>
			<td>Agar (powder), Cat.: 5210.3</td>
			<td>Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany</td>
			<td>Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902</td>
			<td>Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casting molds (metal)</td>
			<td>Engelbrecht Medizin &#38; Labortechnik, Ederm&#252;nde, Germany</td>
			<td>Einbettsch&#228;lchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b</td>
			<td>Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm)</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.&#160; Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard &#38; Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux&#180;s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)</td>
			<td>Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China</td>
			<td>Y10006 and Y10005</td>
			<td>Any other type of standard office foldback clamps will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (anatomical)</td>
			<td>NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811</td>
			<td>Any type of anatomical forceps will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde-solution 4%</td>
			<td>SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany</td>
			<td>Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005</td>
			<td>Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph paper (for calibration)</td>
			<td>B&#252;romarkt B&#246;ttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de</td>
			<td>Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514</td>
			<td>Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)</td>
			<td>NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Becherglas SIMAX&#174; , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036</td>
			<td>Any kind of glass- or plastic beakers of 5 &#8211; 100 ml volume will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory scale(s)</td>
			<td>Mettler Toledo GmbH, Gie&#223;en, Germany</td>
			<td>PM6000</td>
			<td rowspan="2">Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Sartorius AG, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>BP61S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Engelbrecht Medizin &#38; Labortechnik, Ederm&#252;nde, Germany</td>
			<td>FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700</td>
			<td>Any kind of single-use microtome blades will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Morphometry/planimetry software/system</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss-Kontron, Eching, Germany</td>
			<td>VideoplanTM image analysis system</td>
			<td>Out of stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D40</td>
			<td>Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod&#160; will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transparencies</td>
			<td>Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany</td>
			<td>Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:&#160; 3562</td>
			<td>Any (laser)-printable plastic transparency will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random number tables</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Plano GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td>T5016</td>
			<td>Any kind of razor blades will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler</td>
			<td>B&#252;romarkt B&#246;ttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de</td>
			<td>Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30</td>
			<td>Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline (0.9%)</td>
			<td>Carl Roth GmbH, Germany</td>
			<td>Natriumchlorid, &#62;99% Cat.: 0601.1</td>
			<td>To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Aesculap AG &#38; Co KG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>BRAUN Surgical blades N&#176;22</td>
			<td>Any kind of scalpel blades will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanner</td>
			<td>Hewlett-Packard</td>
			<td>hp scanjet 7400c</td>
			<td>Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicing devices</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.&#160; Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)</td>
			<td>Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany</td>
			<td>Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm</td>
			<td>Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin wire</td>
			<td>Basteln &#38; Hobby Schobes, Stra&#223;furth, Germany. www,bastel-welt.de</td>
			<td>Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742</td>
			<td>Any other kind of thin wire will also do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue paper</td>
			<td>NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305</td>
			<td>Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof pen</td>
			<td>Staedler Mars GmbH &#38; Co KG, N&#252;rnberg, Grmany</td>
			<td>Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2</td>
			<td>Any other kind of waterproof pen will do as well.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sampling strategies and processing of biobank tissue samples from porcine biomedical models

In der translationalen medizinischen Forschung haben Schweine Modelle stetig populärer geworden. In Anbetracht des hohen Wertes der einzelnen Tiere, besonders der gentechnisch veränderten Schwein, Modelle und oft zeitlich begrenzte Anzahl der verfügbaren Tiere dieser Modelle, Einrichtung (Biobank) Sammlungen von adäquat verarbeiteten Gewebeproben eignet sich für eine breites Spektrum an nachfolgende Analysemethoden, einschließlich nicht angegebene zum Zeitpunkt der Probenahme, Analysen stellen sinnvolle Ansätze für die translationale Wert des Modells voll nutzen. Im Hinblick auf die Besonderheiten des porcinen Anatomie wurden umfassende Richtlinien für standardisierte Generation Vertreter, qualitativ hochwertige Proben aus verschiedenen porcinen Organen und Geweben vor kurzem eingerichtet. Diese Richtlinien sind wesentliche Voraussetzungen für die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und ihre Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Studien und Ermittler. Die Aufzeichnung der Grunddaten wie Orgel Gewichte und Volumina, die Bestimmung der Probenahme Standorte und der Anzahl der Gewebeproben erzeugt werden, sowie Ausrichtung, Größe, Verarbeitung und trimmen Richtungen sind relevante Faktoren Bestimmung der Generalizability und Nutzbarkeit der Probe zur molekularen, qualitative und quantitative morphologische Analysen. Hier ist eine anschauliche, praktische, schrittweise Demonstration der wichtigsten Techniken zur Erzeugung von Vertreter, Mehrzweck-Biobank Exemplar von porcinen Gewebe präsentiert. Die hier beschriebenen Methoden umfassen Bestimmung der Organgewebe/Volumen und Dichte, die Anwendung eines volumengewichteten systematische Stichproben für parenchymatösen Organen durch Punkt zählen, Bestimmung des Ausmaßes der Schrumpfung des Gewebes im Zusammenhang mit histologische Einbettung der Proben und Generierung von zufällig orientierte Proben für quantitative stereologischen Analysen, z. B. isotrop einheitliche zufällige (IUR) Abschnitte erzeugt durch die "Orientator" und "Isector" Methoden und vertikale uniform zufällige (VUR) Abschnitte.

Eintauchen-Technik zur Bestimmung der Dichte Gewebe/organ
Abbildung 12A -B zeigt die repräsentative Bestimmung der Dichte und Volumen einer porcinen Niere mit der Überflutung Technik im Schritt 1.1 (Abbildung 1, Abbildung 2) beschrieben. Repräsentative Ergebnisse der Dichtemessungen zusätzliche porcinen Organe und Gewebe s...

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Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

Probenahmestrategien und Verarbeitung der Biobank Gewebeproben von porcinen biomedizinische Modelle

Die praktische Anwendung und Leistung der Methoden für die Generation von repräsentativen Gewebeproben von porcinen Tiermodellen für ein breites Spektrum an nachgeschalteten Analysen in Biobank Projekte gezeigt, darunter Volumetrie, systematische Stichproben und differenzierte Aufbereitung von Gewebeproben für qualitative und quantitative morphologische und molekulare Analysen Arten.

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

This video demonstrates two key techniques for sampling and processing biobank porcine tissue specimens. The submersion technique reliably estimates total organ and tissue volume and the orientator technique generates random isotropic tissue sections for unbiased estimation of quantitative morphological parameters. The main advantage of the submersion technique for tissue density determination is that it can be applied to any kind of tissue and that it produces reliable results for small as well as for large samples.The advantages of the orientator technique are that it is highly efficient and also works with large tissue samples. To begin volumetry for a large organ excise an appropriately sized piece of tissue from the organ. Carefully swab the sample with a paper towel to remove excess blood and tissue fluid.Then weigh the sample on a precision scale and record the weight of the sample. Add 0.9%saline to a beaker of suitable size. Do not completely fill the beaker to prevent overflow during tissue emersion.Place the beaker on the scale then submerge a forceps or a self-constructed sample holder in the saline until the mark on the forceps or sample holder reaches the liquid. Next, reset the display of the scale to zero. Carefully attach the tissue sample to the forceps or sample holder and completely submerge the sample in the saline until the marked position is reached.To record reliable density measurements it is important to ensure that the sample is completely submerged and to avoid any contact of the submerged sample to the inner walls or the bottom of the beaker. While holding the sample in position, record the weight displayed on the scale. Use this measurement and the density of saline at room temperature to calculate the volume of the sample.Then calculate the density of the tissue sample from the weight of the sample and its volume. For large organs and tissues, such as this kidney, perform repeated measurements with multiple samples and calculate the average density from the single measurements. For small samples and small organs measured in total such as the pituitary gland, repeat the measurement three times before calculating the average organ density from the single measurement values.Finally, calculate the total volume of the organ, tissue or organ compartment from its weight and density. Place a fixed tissue specimen on a print of an equiangular circle with one edge parallel to the zero to 180 degree direction. Then use a random number table to determine a random angle.Find the corresponding marks on the scale of the equiangular circle. Using these marks, cut a section through the sample with the section plane oriented parallel to the direction of the random angle indicated on the scale of the equiangular circle and a vertical to the resting surface of the sample. Place the tissue block with the section surface facing down on a cosine weighted circle.With the edge of the resting surface placed parallel to the one-to-one direction. Now cut a new section through the sample at a random angle determined using the random number table. The resulting section plane is an isotropic uniform random section.This table shows the representative densities of several porcine tissues and organs determined using the submersion technique. Most porcine tissues display density values slightly higher than one referring to the density of water. Whereas tissues swimming in saline, such as adipose tissue for example, display densities lower than one.This figure shows four representative IUR sections of porcine left ventricular myocardium prepared with the orientator technique. Note the changed cutting angles in the different IUR sections. Once mastered, the submersion technique for tissue density determination can be done in a few minutes.If it is performed properly. Isotropic uniform random tissue sections generated with the orientator technique are suitable for estimation of any quantitative morphological parameters using appropriate stereological analysis methods. digital music.

Research

JoVE Journal

Medicine

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Erzeugung von Alginat-Mikrokugeln für biomedizinische Anwendungen

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

Forschung

Medizin

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Wie kortikale Faltung von MR-Bildern messen: eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Local Gyrification Index Compute

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Verarbeitung von primären Hirntumoren Tissue für Stem Cell Assays und Flow Sortierung

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

Die Bovine Lung in der biomedizinischen Forschung: Optisch Geführte Bronchoskopie, intrabronchial Inokulation und<em&gt; In Vivo</em&gt; Sampling-Techniken

There is an ongoing search for alternative animal models in research of respiratory medicine. Depending on the goal of the research, large animals as ...

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Aufnahme von nasalen und bronchialen Flüssigkeiten: Precision Sampling der menschlichen Atemwege Schleimhaut und Labor Verarbeitung von Proben

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

Verbesserung der einen geschlossenen Kasten porcinen Myokardinfarkt Modell durch Standardisierung der Gewebe und Blut Stichprobenverfahren

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved ...

Human Subcutaneous Adipose Tissue Sampling Using a Mini-Liposuction Technique

Probenahme von subkutanem Fettgewebe beim Menschen mit einer Mini-Fettabsaugungstechnik

Studies on adipose tissue are useful in understanding metabolic and other conditions. Human subcutaneous adipose tissue is accessible. With appropriate ...

Repetitive Blood Sampling from the Subclavian Vein of Conscious Rat

Wiederholte Blutentnahme aus der Vena subclavia einer bewussten Ratte

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to ...

Dissection Techniques and Histological Sampling of the Heart in Large Animal Models for Cardiovascular Diseases

Dissektionstechniken und histologische Probenahme des Herzens in Großtiermodellen für Herz-Kreislauf-Erkrankungen

The standard gross examination and sampling are key elements in the reproducibility and success of experimental studies of cardiovascular diseases carried ...

Wirtschaftliche Extraktion von Kieselalgen-DNA mit einem modifizierten Kit

Extraction of Diatom DNA from Water Samples and Tissues

Autor im Rampenlicht: Kieselalgen-Tests für forensische Ertrinkungsuntersuchungen 

Extraktion von Diatomeen-DNA aus Wasserproben und Geweben

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. ...