Name: sampling strategies and processing of biobank tissue samples from porcine biomedical models
Uploaded: 2018-03-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models at JoVE.com

Forfatterne takker Lisa Pichl for utmerket kundestøtte.

Alle metodene som er beskrevet bruker her vevsprøver avledet fra døde dyr og overholde tyske forskrifter av dyr velferd.
1. Volumetry
<ol><li>Neddykking teknikk for fastsettelse av vev/orgel tettheter (figur 1 og figur 2) 7 , 12 , 16<ol>
<li>Forberede materialer: skalpell blader, papirh...

<ol>
	<li>Aigner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+pigs+as+models+for+translational+biomedical+research.">Transgenic pigs as models for translational biomedical research.</a> J Mol. Med. 88, 653-664 (2010).</li><li>Blutke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Munich+MIDY+Pig+Biobank:+A+unique+resource+for+studying+organ+crosstalk+in+diabetes.">The Munich MIDY Pig Biobank: A unique resource for studying organ crosstalk in diabetes.</a> Mol Metab. 6, 931-940 (2017).</li><li>Klymiuk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-deficient+pigs+provide+new+insights+into+the+hierarchy+of+physiological+derangements+of+dystrophic+muscle.">Dystrophin-deficient pigs provide new insights into the hierarchy of physiological derangements of dystrophic muscle.</a> Hum Mol Genet. 22, 4368-4382 (2013).</li><li>Klymiuk, N., Seeliger, F., Bohlooly, Y. M., Blutke, A., Rudmann, D. G., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailored+pig+models+for+preclinical+efficacy+and+safety+testing+of+targeted+therapies.">Tailored pig models for preclinical efficacy and safety testing of targeted therapies.</a> Toxicol Pathol. 44, 346-357 (2016).</li><li>Renner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permanent+neonatal+diabetes+in+INSC94Y+transgenic+pigs.">Permanent neonatal diabetes in INSC94Y transgenic pigs.</a> Diabetes. 62, 1505-1511 (2013).</li><li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inside+the+first+pig+biobank.">Inside the first pig biobank.</a> Nature. 519, 397-398 (2015).</li><li>Albl, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+sampling+guides+for+porcine+biomedical+models.">Tissue sampling guides for porcine biomedical models.</a> Toxicol Pathol. 44, 414-420 (2016).</li><li>Gundersen, H. J. G., Mirabile, R., Brown, D., Boyce, R. W., Haschek, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+principles+and+sampling+procedures+for+toxicologic+pathologists.">Stereological principles and sampling procedures for toxicologic pathologists.</a> Haschek and Rousseaux's Handbook of Toxicologic Pathology. , 215-286 (2013).</li><li>Howard, C. V., Reed, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. , 1-277 (2005).</li><li>Mattfeldt, T., Mall, G., Gharehbaghi, H., Moller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+surface+area+and+length+with+the+orientator.">Estimation of surface area and length with the orientator.</a> J Microsc. 159, 301-317 (1990).</li><li>Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isector:+A+simple+and+direct+method+for+generating+isotropic,+uniform+random+sections+from+small+specimens.">The isector: A simple and direct method for generating isotropic, uniform random sections from small specimens.</a> J Microsc. 165, 427-431 (1992).</li><li>Tschanz, S., Schneider, J. P., Knudsen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereology:+Planning,+volumetry+and+sampling+are+crucial+steps+for+a+successful+study.">Design-based stereology: Planning, volumetry and sampling are crucial steps for a successful study.</a> Ann Anat. 196, 3-11 (2014).</li><li>Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+shrinkage+and+unbiased+stereological+estimation+of+particle+number+and+size.">Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size.</a> J Microsc. 204, 232-246 (2001).</li><li>Mattfeldt, T., Doerr, W., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereologische+Methoden+in+der+Pathologie+[Stereologic+methods+in+pathology].">Stereologische Methoden in der Pathologie [Stereologic methods in pathology].</a> Normale und pathologische Anatomie. , (1990).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology+and+its+prediction.">The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction.</a> J Microsc. 147, 229-263 (1987).</li><li>Scherle, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+volumetry+of+organs+in+quantitative+stereology.">A simple method for volumetry of organs in quantitative stereology.</a> Mikroskopie. 26, 57-60 (1970).</li><li>Nielsen, K. K., Andersen, C. B., Kromann-Andersen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+the+effects+of+paraffin+and+plastic+embedding+of+the+normal+and+obstructed+minipig+detrusor+muscle+using+the+optical+disector.">A comparison between the effects of paraffin and plastic embedding of the normal and obstructed minipig detrusor muscle using the optical disector.</a> J Urol. 154, 2170-2173 (1995).</li><li>Schneider, J. P., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+mouse+lung+tissue+dimensions+during+processing+for+morphometry:+a+comparison+of+methods.">Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L341-L350 (2014).</li><li>von Bartheld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+particles+in+the+z-axis+of+tissue+sections:+Relevance+for+counting+methods.">Distribution of particles in the z-axis of tissue sections: Relevance for counting methods.</a> NeuroQuantology. 10, 66-75 (2012).</li><li>Baddeley, A. J., Gundersen, H. J., Cruz-Orive, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+surface+area+from+vertical+sections.">Estimation of surface area from vertical sections.</a> J microsc. 142, 259-276 (1986).</li><li>Blutke, A., Schneider, M. R., Wolf, E., Wanke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+hormone+(GH)-transgenic+insulin-like+growth+factor+1+(IGF1)-deficient+mice+allow+dissociation+of+excess+GH+and+IGF1+effects+on+glomerular+and+tubular+growth.">Growth hormone (GH)-transgenic insulin-like growth factor 1 (IGF1)-deficient mice allow dissociation of excess GH and IGF1 effects on glomerular and tubular growth.</a> Physiol Rep. 4, e12709 (2016).</li><li>Hermanns, W., Liebig, K., Schulz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembedding+immunohistochemical+demonstration+of+antigen+in+experimental+polyarthritis+using+plastic+embedded+whole+joints.">Postembedding immunohistochemical demonstration of antigen in experimental polyarthritis using plastic embedded whole joints.</a> Histochemistry. 73, 439-446 (1981).</li><li>Böck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Romeis Mikroskopische Technik. , 1-697 (1989).</li><li>Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D., Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bancroft's theory and practice of histological techniques. , 1-654 (2013).</li><li>Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+estimates+of+alveolar+number+and+size+and+capillary+length+and+surface+area+in+mice+lungs.">Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs.</a> Anat Rec (Hoboken). 292, 113-122 (2009).</li><li>Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+for+stereology+in+lungs.">Sampling for stereology in lungs.</a> Eur Respir Rev. 15, 107-114 (2006).</li><li>Junatas, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+analysis+of+size+and+density+of+hepatocytes+in+the+porcine+liver.">Stereological analysis of size and density of hepatocytes in the porcine liver.</a> J Anat. 230, 575-588 (2017).</li></ol>

Generasjon av biobank prøvekolleksjoner fra svin dyremodeller krever robust teknikker og protokoller for fastsettelse av orgel/vev volumer, reproduserbare generering av representant, redundant vevsprøver egnet for en rekke analyse metoder, og for tilfeldiggjøring av retningen for eksempel deler for kvantitative stereological analyser. Metodene som er beskrevet i denne artikkel er tilpasset størrelsen på svin organer og vev, og er utviklet for å effektivt møte disse kravene2,<sup ...

I translasjonsforskning medisin, griser er stadig mer vanlig for bruk som stor dyr modeller1,2,3,4,5, på grunn av flere fordelaktig likheter mellom den svin og Human anatomi og fysiologi, og tilgjengeligheten av etablerte molekylærbiologiske metoder tillater generering av skreddersydd, genmodifiserte gris modeller for en rekke sykdom forhold1,4.
Men er sammenlignet med gnager modeller, antall dyr av respektive gris modell som kan brukes i eksperimenter helst begrenset. Dette skyldes svin generasjon intervallet av ca ett år, og de finansielle og tidkrevende arbeid kreves for generasjonen av svin modeller og husdyrhold. Derfor er enkelte dyr porcine modell, i tillegg til prøvene som kan genereres fra disse griser, svært verdifulle, særlig hvis genmodifiserte svin modeller og/eller langsiktig eksperimentelle spørsmål (f.eks, sent komplikasjoner av kroniske sykdommer) undersøkt i alderen enkeltpersoner2,6,7.
I en studie, ytelse av flere analyser som ikke hadde planlagt i første eksperimentell design av studien kan senere viser seg for å være relevant, f.eksadresse forskjellige spørsmål som oppstår fra tidligere oppdaget uventede funn. Hvis egnet prøver for slike ekstra eksperimenter ikke er tilgjengelig, kan det hende uforholdsmessig høy pris og tidkrevende utgifter nødvendig å generere flere griser og vevsprøver. For å være forberedt for Slike eventualiteter, generasjon av biobank bevarte sikkerhetskopiere prøver av ulike organer og vev bio-væsker, kvalitativt og kvantitativt egnet for en rekke etterfølgende analyser, er ansett som en viktig nærme2,6,7. Avledet optimal fordeler fra en svin dyremodell, anvendeligheten av adekvat biobank prøver tilbyr også unike muligheten til å utføre et bredt spekter av forskjellige analyseteknologi på identiske utvalg materialer på flere organ nivå i den samme enkelte dyr, f.eksav distribusjon å forskere av ulike arbeidsgrupper organisert i en forskning nettverk2,6,7. I tillegg bidrar '' fremtidsrettede '' prøvetaking strategien i biobanking også til en reduksjon i antall dyr nødvendig i en studie. Fordelene med porcine modell biobanking er nylig blitt demonstrert i en multi organ, multiomics Studien undersøker orgel cross-talk i genmodifiserte porcine modell for langsiktige diabetes mellitus, med prøver fra München MIDY gris Biobank 2.
Det er noen obligatorisk krav biobank prøver må vanligvis overholde for å etablere pålitelighet og interpretability av resultatene av de senere utføres analysene. Prøvene må genereres reproduserbar, og de må representant, dvstilstrekkelig reflekterer interessert morfologiske og molekylære funksjonene i vev/orgel prøvene er tatt fra7. For å være egnet for en rekke nedstrøms analysetyper, må prøvene være tatt i tilstrekkelige mengder og bearbeidet etter kravene (inkludert tid og temperatur) av forskjellige analytiske metoder, inkludert beskrivende histopathological analyser, som cryohistology, parafin og plast histology, immunohistochemistry, i situ hybridisering, ultrastructural elektron mikroskopiske analyser og kliniske laboratoriet diagnostiske analyser, så vel som molekylær analyser av DNA, RNA, proteiner og metabolitter.
Som tillater for vurdering av en rekke forskjellige kvantitative morfologiske parametere som tall, volum, lengde eller flater av ulike vev strukturer av kvantitative stereological analyser, randomisert delen fly av den histologiske prøver av respektive organer/vev må være forberedt7,8,9,10,11. Kvantitativ morfologiske studier, nøyaktig bestemmelse av det totale volumet av vev, orgel eller orgel kupeen, prøvene var tatt fra (i.e.referanse plass) er avgjørende viktig7,9 , 12 for å beregne den absolutte mengder parameterne interessert i de respektive orgel, vev eller organisme. Til slutt, har effekten av bygge-relatert vev krymping av histologiske deler bestemt og tatt konto13. Derfor er kvantitative stereological analyser, spesielt med arkiverte prøver (fast vevsprøver, innebygde vev blokker, histologiske deler, etc.) fra tidligere studier sterkt begrenset eller umulig12, spesielt hvis volumetry av respektive organer/vev ikke ble utført, hvis ingen tilstrekkelig utvalg design ble brukt til å rettferdiggjøre representative utvalg, hvis tallene og mengder av tilgjengelige personlige prøver er ikke nok, eller hvis behandlingen av den Eksempler er inkompatibel med estimering av parameteren(e) kvantitative morfologiske rundt. De mange mulige påvirker faktorene hensiktsmessigheten av arkiv utvalg materiale for analyser av forskjellige kvantitative morfologiske parametere kan ikke utvetydig besvares, men avhenger nøye vurdering av hvert enkelt tilfelle.
Dermed som plasseringen, størrelsen, antall, behandling, trimming retning og orientering av prøvene vil påvirke resultatene av påfølgende analysene, disse faktorene er av stor betydning og må vurderes i eksperimentell design av noen studier. Disse aspektene og de spesielle funksjonene i den svin anatomien, omfattende, detaljert, omfattende utvalg retningslinjer tilpasset svin dyremodeller har nylig blitt opprettet, gir en robust referanse til standardisert, reproduserbare , og effektiv generasjon av overflødig, tilstrekkelig behandlet, høy kvalitet prøver fra mer enn 50 forskjellige svin organer og vev6,7.
Metodologiske beskrivelsene og videodemonstrasjon vises i denne artikkel gir detaljert, illustrasjon, forståelig, steg-for trinnvise instruksjoner for praktisk ytelse av en rekke teknikker for volumetry, prøvetaking av svin vev og organer og behandling av vevsprøver for nedstrøms analyse metoder. Utvalgte teknikkene omfatter metoder for fastsettelse av orgel/vev volumer og tettheter basert på prinsippene om Arkimedes og Cavalieri9, herunder fastsettelse av dimensjonene for tredimensjonale krymping av vev gjelder de innebygging i forskjellige innebygging media14 under behandlingen for histologiske eksamen, anvendelse av praktisk volum-vektet systematisk tilfeldig utvalg tilnærminger, behandling av samplet vevsprøver for ulike etterfølgende analyser7,8,9,15, og generasjon riktig orientert og behandlet prøver for potensielle kvantitative stereological analyser7,8, 9,10,11. Ved sin søknad i svin biobank prosjekter er demonstrerte metodene generelt passende for alle studier undersøke kvantitative histo-morfologiske egenskaper av organer/vev. Videre er systematisk stikkprøvekontroll design spesielt nyttige for generering av representative utvalg eksperimenter bruker molekylær analyseteknologi for å oppdage overflod endringer av f.eks, RNAs, proteiner og metabolitter i ulike organer og vev.
De neste avsnittene gir en kort introduksjon til disse metodene, mens praktiske resultatene er beskrevet i delen protokollen.
Fastsettelse av orgel/vev volumer Fastsettelse av orgel vekter og volumer er viktig i flere eksperimentelle innstillinger, som disse faktorene kan bety endringer, potensielt eksperimentelt undersøkt faktorer av interesse. Det totale volumet av en orgel/vev er også ofte nødvendig å beregne absolutt kvantitative parametere, (f.eks, hvor total-celle) fra stereologically beregnede numeriske volum tettheter (dvs., antall celler per Volumenhet av vev)7,12. Bortsett fra teknikker bruker komplekse tekniske utstyr, slik som konstatere, det er i utgangspunktet tre praktiske metoder som vanligvis brukes til å bestemme den absolutte mengden et organ eller vev. Volumet av et organ kan bestemmes av "direkte volumetriske measurement" i henhold til prinsippet om Arkimedes, dvs, måle volumet av vann eller saltløsning fortrengt av strukturen når helt neddykket. Men for relativt store svin organer er disse tilnærmingene upraktisk og utsatt for upresisjonsverdier, siden de krever stor volumetriske/måle flasker. Mer praktisk, volumet av en orgel/vev kan beregnes fra sin vekt og tetthet7,12,16, som kan effektivt bestemmes ved hjelp av "neddykking metoden"7,12 ,16 (protokollen trinn 1.1.). Orgel/vev volumer kan også estimeres ved hjelp av volumetry tilnærminger basert på "prinsippet om Cavalieri" (1598-1647). Enkelt sagt, Cavalieri prinsippet sier, at hvis to objekter er delt i fly parallelt med et grunnplan og profiler av delene skjære gjennom to objekter på tilsvarende avstand til på grunnplan har de samme områdene, to objekter har samme volum. Dermed kan volumet av vilkårlig formet objekter anslås som produktet av deres delen profil områder i parallell, like fjernt delen fly og avstanden mellom avsnittet flyene. Dette er forståelig med følgende analogien: Tenk to stabler bestående av samme antall identiske mynter er plassert side ved side, en stabel med mynter ryddig stablet oppå hverandre gir sylinderform mynt stabelen, og den andre stabel med mynter med midtstilt plassert mynter (figur 3A). Selv om formen på begge mynt stabler er forskjellige, volumene er den samme, siden områdene mynter på tilsvarende nivåer av begge stabler (i.e.områdene profiler av parallelle skjære gjennom begge mynt stabler i samme avstand fra den bakken) er identiske. Estimering av volum av svin organer og vev bruker Cavalieri prinsipp7,12,15 er beskrevet i trinn 1.2.
Fastsettelse av omfanget av vev krymping knyttet til histologiske innebygging Analyser av flere kvantitative morfologiske parametere målt i histologiske vev deler, har effekten av bygge-relatert vev krymping forekommer under vev behandling for histology bestemt og tatt hensyn til. Omfanget av bygge-relatert vev krymping kan være variabel, og avhenger både på vevet, behandlingen og innebygging middels8,13,17,18,19. Generelt forekommer bygge-relaterte endringer av volumet av en Vevsprøve (dvsdet meste krymping) i alle tre dimensjoner av plass, og derfor påvirker alle dimensjonale parametrene anslått av kvantitative stereological analyser8 . I utgangspunktet kan omfanget av bygge-relatert vev krymping, uttrykt som den lineære vev krymping faktoren (fS), anslås som vist i trinn 1.3. og brukes for korreksjon (krymping-sensitive) kvantitative morfologiske parametere14.
Volum-vektet systematisk tilfeldig utvalg av organer/vev For etableringen av en biobank samling av svin orgel/vevsprøver, volum-vektet systematisk stikkprøvekontroll tilnærminger som beskrevet i trinn 2 har vist seg for å være praktisk, tidsbesparende og effektive teknikker for generering av representant, Multi-Purpose vev eksempler7,8,9,15.
Generasjons Isotropic Uniform tilfeldig deler og loddrett Uniform tilfeldig seksjoner for kvantitative stereological analyser Biobank vevsprøver må være egnet for en rekke stereological kvantitativ analyse metoder for estimering av antallet parametere som ikke kunne fastslås uten en tilstrekkelig forberedt prøven. Nesten alle kvantitativt stereological parametere kan bestemmes, bruker "isotropic (uavhengig) uniform tilfeldig (IUR) kapitler"8,9. I IUR deler, er tredimensjonale retningen for inndelingsplanet av vev utvalget randomisert. Dette kan oppnås ved tilfeldiggjøring av stillingen vevet prøven i forhold til inndelingsplanet, som brukes i "Isector" metoden11 (protokollen trinn 3.1), eller av tilfeldiggjøring av retningen for inndelingsplanet forhold til den Vevsprøve, som "Orientator" metoden10 (protokollen trinn 3.2). I vevsprøver, for eksempel hud- eller mucosa prøven viser en naturlig tilstede, eller definert og riktig identifiserbar loddrett akse, utarbeidelsen av "vertikal uniform tilfeldig (VUR) kapitler" (protokollen trinn 3.3.) strengt delt i fly av deres loddrett akse er fordelaktig8,20. For en komplett diskurs av teoretiske grunnlaget for IUR/VUR prøvetaking og en omfattende diskusjon om potensielle nedstrøms kvantitative stereological analyser kalles den interesserte leseren lærebøker av kvantitative stereology i livet Sciences8,9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Carl Roth GmbH, Germany</td>
			<td>Agar (powder), Cat.: 5210.3</td>
			<td>Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany</td>
			<td>Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902</td>
			<td>Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casting molds (metal)</td>
			<td>Engelbrecht Medizin &#38; Labortechnik, Ederm&#252;nde, Germany</td>
			<td>Einbettsch&#228;lchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b</td>
			<td>Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm)</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.&#160; Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard &#38; Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux&#180;s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)</td>
			<td>Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China</td>
			<td>Y10006 and Y10005</td>
			<td>Any other type of standard office foldback clamps will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (anatomical)</td>
			<td>NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811</td>
			<td>Any type of anatomical forceps will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde-solution 4%</td>
			<td>SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany</td>
			<td>Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005</td>
			<td>Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph paper (for calibration)</td>
			<td>B&#252;romarkt B&#246;ttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de</td>
			<td>Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514</td>
			<td>Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)</td>
			<td>NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Becherglas SIMAX&#174; , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036</td>
			<td>Any kind of glass- or plastic beakers of 5 &#8211; 100 ml volume will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory scale(s)</td>
			<td>Mettler Toledo GmbH, Gie&#223;en, Germany</td>
			<td>PM6000</td>
			<td rowspan="2">Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Sartorius AG, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>BP61S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Engelbrecht Medizin &#38; Labortechnik, Ederm&#252;nde, Germany</td>
			<td>FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700</td>
			<td>Any kind of single-use microtome blades will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Morphometry/planimetry software/system</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss-Kontron, Eching, Germany</td>
			<td>VideoplanTM image analysis system</td>
			<td>Out of stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D40</td>
			<td>Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod&#160; will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transparencies</td>
			<td>Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany</td>
			<td>Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:&#160; 3562</td>
			<td>Any (laser)-printable plastic transparency will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random number tables</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Plano GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td>T5016</td>
			<td>Any kind of razor blades will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler</td>
			<td>B&#252;romarkt B&#246;ttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de</td>
			<td>Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30</td>
			<td>Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline (0.9%)</td>
			<td>Carl Roth GmbH, Germany</td>
			<td>Natriumchlorid, &#62;99% Cat.: 0601.1</td>
			<td>To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Aesculap AG &#38; Co KG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>BRAUN Surgical blades N&#176;22</td>
			<td>Any kind of scalpel blades will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanner</td>
			<td>Hewlett-Packard</td>
			<td>hp scanjet 7400c</td>
			<td>Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicing devices</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.&#160; Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)</td>
			<td>Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany</td>
			<td>Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm</td>
			<td>Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin wire</td>
			<td>Basteln &#38; Hobby Schobes, Stra&#223;furth, Germany. www,bastel-welt.de</td>
			<td>Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742</td>
			<td>Any other kind of thin wire will also do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue paper</td>
			<td>NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305</td>
			<td>Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof pen</td>
			<td>Staedler Mars GmbH &#38; Co KG, N&#252;rnberg, Grmany</td>
			<td>Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2</td>
			<td>Any other kind of waterproof pen will do as well.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sampling strategies and processing of biobank tissue samples from porcine biomedical models

I medisinsk translasjonsforskning, har svin modeller stadig blitt mer populært. Vurderer den høye verdien av enkelte dyr, spesielt av genmodifiserte gris modeller, og ofte begrenset antall tilgjengelige dyr disse modellene, etablering av (biobank) samlinger av tilstrekkelig behandlet egnet for en bredt spekter av påfølgende analyser metoder, inkludert analyser ikke angitt på tidspunkt for prøvetaking, representerer meningsfull tilnærminger til å dra full nytte av translasjonsforskning verdien av modellen. Med hensyn til peculiarities av svin anatomi, er omfattende retningslinjer nylig etablert for standardisert generasjon av representant, høy kvalitet prøver fra ulike svin organer og vev. Disse retningslinjene er avgjørende forutsetninger for reproduserbarhet resultater og sammenlignbarheten mellom forskjellige studier og etterforskere. Innspillingen av grunnleggende data, for eksempel orgel vekter og volumer, fastsettelse av prøvetaking plasseringer og antall vevsprøver genereres, samt deres retning, størrelse, behandling og trimming retninger, er relevante faktorer avgjøre generalizability og brukervennlighet av prøven for molekylær, kvalitativ og kvantitativ morfologiske analyser. Her, en illustrasjon, praktisk, trinnvis demonstrasjon av de viktigste teknikkene for generering av representant, multi-purpose biobank prøven fra svin vev er presentert. Metodene som er beskrevet her inkluderer fastsettelse av orgel/vev volumer og tettheter, anvendelse av en volum-vektet systematisk stikkprøvekontroll prosedyre for parenchymal organer av punkt-telling, bestemmelse av omfanget av vev krymping relatert til histologiske innebygging av eksempler og generering av tilfeldig orientert prøver for kvantitative stereological analyser, for eksempel isotropic uniform tilfeldig (IUR)-inndelinger generert av "Orientator" og "Isector", og loddrette uniform tilfeldig (VUR) deler.

Neddykking teknikk for fastsettelse av vev/orgel
Figur 12A -B viser representant fastsettelse av tetthet og volum for en svin nyre bruke neddykking teknikken beskrevet i trinn 1.1 (figur 1, figur 2). Mer representativt resultatene av tetthet målinger av flere svin organer og vev er presentert i tabell 2. En m...

Watch this Scientific Journal Video about Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models at JoVE.com

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

Prøvetaking strategier og behandling av Biobank fra svin biomedisinsk modeller

Praktisk programmet og gjennomførelse av metoder for generering av representant av svin dyremodeller for et bredt spekter av nedstrøms analyser i biobank prosjekter er vist, inkludert volumetry, systematisk stikkprøvekontroll, og differensial behandling av vevsprøver for kvalitativ og kvantitativ morfologiske og molekylære analyser typer.

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

This video demonstrates two key techniques for sampling and processing biobank porcine tissue specimens. The submersion technique reliably estimates total organ and tissue volume and the orientator technique generates random isotropic tissue sections for unbiased estimation of quantitative morphological parameters. The main advantage of the submersion technique for tissue density determination is that it can be applied to any kind of tissue and that it produces reliable results for small as well as for large samples.The advantages of the orientator technique are that it is highly efficient and also works with large tissue samples. To begin volumetry for a large organ excise an appropriately sized piece of tissue from the organ. Carefully swab the sample with a paper towel to remove excess blood and tissue fluid.Then weigh the sample on a precision scale and record the weight of the sample. Add 0.9%saline to a beaker of suitable size. Do not completely fill the beaker to prevent overflow during tissue emersion.Place the beaker on the scale then submerge a forceps or a self-constructed sample holder in the saline until the mark on the forceps or sample holder reaches the liquid. Next, reset the display of the scale to zero. Carefully attach the tissue sample to the forceps or sample holder and completely submerge the sample in the saline until the marked position is reached.To record reliable density measurements it is important to ensure that the sample is completely submerged and to avoid any contact of the submerged sample to the inner walls or the bottom of the beaker. While holding the sample in position, record the weight displayed on the scale. Use this measurement and the density of saline at room temperature to calculate the volume of the sample.Then calculate the density of the tissue sample from the weight of the sample and its volume. For large organs and tissues, such as this kidney, perform repeated measurements with multiple samples and calculate the average density from the single measurements. For small samples and small organs measured in total such as the pituitary gland, repeat the measurement three times before calculating the average organ density from the single measurement values.Finally, calculate the total volume of the organ, tissue or organ compartment from its weight and density. Place a fixed tissue specimen on a print of an equiangular circle with one edge parallel to the zero to 180 degree direction. Then use a random number table to determine a random angle.Find the corresponding marks on the scale of the equiangular circle. Using these marks, cut a section through the sample with the section plane oriented parallel to the direction of the random angle indicated on the scale of the equiangular circle and a vertical to the resting surface of the sample. Place the tissue block with the section surface facing down on a cosine weighted circle.With the edge of the resting surface placed parallel to the one-to-one direction. Now cut a new section through the sample at a random angle determined using the random number table. The resulting section plane is an isotropic uniform random section.This table shows the representative densities of several porcine tissues and organs determined using the submersion technique. Most porcine tissues display density values slightly higher than one referring to the density of water. Whereas tissues swimming in saline, such as adipose tissue for example, display densities lower than one.This figure shows four representative IUR sections of porcine left ventricular myocardium prepared with the orientator technique. Note the changed cutting angles in the different IUR sections. Once mastered, the submersion technique for tissue density determination can be done in a few minutes.If it is performed properly. Isotropic uniform random tissue sections generated with the orientator technique are suitable for estimation of any quantitative morphological parameters using appropriate stereological analysis methods. digital music.

Research

JoVE Journal

Medicine

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Generering av Alginat Mikrokuler for biomedisinske applikasjoner

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

How to Measure kortikal Folding fra MR bilder: en Step-by-Step Tutorial å beregne Local Gyrification Hovedsiden

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Behandling av primær hjernesvulst Tissue for Stem Cell Assays og Flow Sortere

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

Den Bovine Lung i biomedisinsk forskning: Visuelt Guidet Bronkoskopi, intrabronkial Pode og<em&gt; I Vivo</em&gt; sampling teknikker

There is an ongoing search for alternative animal models in research of respiratory medicine. Depending on the goal of the research, large animals as ...

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Absorpsjon av nese og bronkial væsker: Precision prøvetaking av menneskelig luftveiene Mucosa og laboratoriet behandling av prøver

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

Forbedring av en lukket kiste svin hjerteinfarkt modell av standardisering av vev og blod utvalgstrekking

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved ...

Human Subcutaneous Adipose Tissue Sampling Using a Mini-Liposuction Technique

Prøvetaking av humant subkutant fettvev ved hjelp av en mini-fettsugingsteknikk

Studies on adipose tissue are useful in understanding metabolic and other conditions. Human subcutaneous adipose tissue is accessible. With appropriate ...

Repetitive Blood Sampling from the Subclavian Vein of Conscious Rat

Repeterende blodprøvetaking fra den subklaviske venen hos bevisst rotte

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to ...

Dissection Techniques and Histological Sampling of the Heart in Large Animal Models for Cardiovascular Diseases

Disseksjonsteknikker og histologisk prøvetaking av hjertet i store dyremodeller for hjerte- og karsykdommer

The standard gross examination and sampling are key elements in the reproducibility and success of experimental studies of cardiovascular diseases carried ...

Økonomisk kiselalger DNA-ekstraksjon ved hjelp av et modifisert sett

Extraction of Diatom DNA from Water Samples and Tissues

Forfatter i søkelyset: Diatom testing for rettsmedisinsk drukningsundersøkelse 

Ekstraksjon av diatome-DNA fra vannprøver og vev

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. ...