Name: sampling strategies and processing of biobank tissue samples from porcine biomedical models
Uploaded: 2018-03-06T14:00:00
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Los autores agradecen a Lisa Pichl excelente asistencia técnica.

Todos los métodos descritos aquí utilizan muestras de tejidos derivadas animales muertos y cumplen con las regulaciones legales alemanas del bienestar animal.
1. volumetría
<ol><li>Técnica de inmersión para la determinación de densidades de tejido/órgano (figura 1 y figura 2) 7 , 12 , 16...

<ol>
	<li>Aigner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+pigs+as+models+for+translational+biomedical+research.">Transgenic pigs as models for translational biomedical research.</a> J Mol. Med. 88, 653-664 (2010).</li><li>Blutke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Munich+MIDY+Pig+Biobank:+A+unique+resource+for+studying+organ+crosstalk+in+diabetes.">The Munich MIDY Pig Biobank: A unique resource for studying organ crosstalk in diabetes.</a> Mol Metab. 6, 931-940 (2017).</li><li>Klymiuk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-deficient+pigs+provide+new+insights+into+the+hierarchy+of+physiological+derangements+of+dystrophic+muscle.">Dystrophin-deficient pigs provide new insights into the hierarchy of physiological derangements of dystrophic muscle.</a> Hum Mol Genet. 22, 4368-4382 (2013).</li><li>Klymiuk, N., Seeliger, F., Bohlooly, Y. M., Blutke, A., Rudmann, D. G., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailored+pig+models+for+preclinical+efficacy+and+safety+testing+of+targeted+therapies.">Tailored pig models for preclinical efficacy and safety testing of targeted therapies.</a> Toxicol Pathol. 44, 346-357 (2016).</li><li>Renner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permanent+neonatal+diabetes+in+INSC94Y+transgenic+pigs.">Permanent neonatal diabetes in INSC94Y transgenic pigs.</a> Diabetes. 62, 1505-1511 (2013).</li><li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inside+the+first+pig+biobank.">Inside the first pig biobank.</a> Nature. 519, 397-398 (2015).</li><li>Albl, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+sampling+guides+for+porcine+biomedical+models.">Tissue sampling guides for porcine biomedical models.</a> Toxicol Pathol. 44, 414-420 (2016).</li><li>Gundersen, H. J. G., Mirabile, R., Brown, D., Boyce, R. W., Haschek, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+principles+and+sampling+procedures+for+toxicologic+pathologists.">Stereological principles and sampling procedures for toxicologic pathologists.</a> Haschek and Rousseaux's Handbook of Toxicologic Pathology. , 215-286 (2013).</li><li>Howard, C. V., Reed, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. , 1-277 (2005).</li><li>Mattfeldt, T., Mall, G., Gharehbaghi, H., Moller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+surface+area+and+length+with+the+orientator.">Estimation of surface area and length with the orientator.</a> J Microsc. 159, 301-317 (1990).</li><li>Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isector:+A+simple+and+direct+method+for+generating+isotropic,+uniform+random+sections+from+small+specimens.">The isector: A simple and direct method for generating isotropic, uniform random sections from small specimens.</a> J Microsc. 165, 427-431 (1992).</li><li>Tschanz, S., Schneider, J. P., Knudsen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereology:+Planning,+volumetry+and+sampling+are+crucial+steps+for+a+successful+study.">Design-based stereology: Planning, volumetry and sampling are crucial steps for a successful study.</a> Ann Anat. 196, 3-11 (2014).</li><li>Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+shrinkage+and+unbiased+stereological+estimation+of+particle+number+and+size.">Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size.</a> J Microsc. 204, 232-246 (2001).</li><li>Mattfeldt, T., Doerr, W., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereologische+Methoden+in+der+Pathologie+[Stereologic+methods+in+pathology].">Stereologische Methoden in der Pathologie [Stereologic methods in pathology].</a> Normale und pathologische Anatomie. , (1990).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology+and+its+prediction.">The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction.</a> J Microsc. 147, 229-263 (1987).</li><li>Scherle, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+volumetry+of+organs+in+quantitative+stereology.">A simple method for volumetry of organs in quantitative stereology.</a> Mikroskopie. 26, 57-60 (1970).</li><li>Nielsen, K. K., Andersen, C. B., Kromann-Andersen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+the+effects+of+paraffin+and+plastic+embedding+of+the+normal+and+obstructed+minipig+detrusor+muscle+using+the+optical+disector.">A comparison between the effects of paraffin and plastic embedding of the normal and obstructed minipig detrusor muscle using the optical disector.</a> J Urol. 154, 2170-2173 (1995).</li><li>Schneider, J. P., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+mouse+lung+tissue+dimensions+during+processing+for+morphometry:+a+comparison+of+methods.">Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L341-L350 (2014).</li><li>von Bartheld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+particles+in+the+z-axis+of+tissue+sections:+Relevance+for+counting+methods.">Distribution of particles in the z-axis of tissue sections: Relevance for counting methods.</a> NeuroQuantology. 10, 66-75 (2012).</li><li>Baddeley, A. J., Gundersen, H. J., Cruz-Orive, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+surface+area+from+vertical+sections.">Estimation of surface area from vertical sections.</a> J microsc. 142, 259-276 (1986).</li><li>Blutke, A., Schneider, M. R., Wolf, E., Wanke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+hormone+(GH)-transgenic+insulin-like+growth+factor+1+(IGF1)-deficient+mice+allow+dissociation+of+excess+GH+and+IGF1+effects+on+glomerular+and+tubular+growth.">Growth hormone (GH)-transgenic insulin-like growth factor 1 (IGF1)-deficient mice allow dissociation of excess GH and IGF1 effects on glomerular and tubular growth.</a> Physiol Rep. 4, e12709 (2016).</li><li>Hermanns, W., Liebig, K., Schulz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembedding+immunohistochemical+demonstration+of+antigen+in+experimental+polyarthritis+using+plastic+embedded+whole+joints.">Postembedding immunohistochemical demonstration of antigen in experimental polyarthritis using plastic embedded whole joints.</a> Histochemistry. 73, 439-446 (1981).</li><li>Böck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Romeis Mikroskopische Technik. , 1-697 (1989).</li><li>Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D., Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bancroft's theory and practice of histological techniques. , 1-654 (2013).</li><li>Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+estimates+of+alveolar+number+and+size+and+capillary+length+and+surface+area+in+mice+lungs.">Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs.</a> Anat Rec (Hoboken). 292, 113-122 (2009).</li><li>Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+for+stereology+in+lungs.">Sampling for stereology in lungs.</a> Eur Respir Rev. 15, 107-114 (2006).</li><li>Junatas, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+analysis+of+size+and+density+of+hepatocytes+in+the+porcine+liver.">Stereological analysis of size and density of hepatocytes in the porcine liver.</a> J Anat. 230, 575-588 (2017).</li></ol>

Generación de colecciones de muestras Biobanco de modelos animales porcinos requiere técnicas robustas y protocolos para la determinación de volúmenes de órganos y tejidos, la generación reproducible de representante, las muestras de tejido redundante apto para una amplia gama de métodos de análisis diferentes y por la aleatorización de la orientación de las secciones de la muestra para los análisis cuantitativos de estereológicos. Los métodos descritos en el presente artículo se adaptan a los tamaños de p...

En la medicina traslacional, los cerdos son cada vez más común para el uso como modelos de animales grandes1,2,3,4,5, debido a varias ventajas similitudes el porcino y anatomía humana y fisiología y la disponibilidad de métodos biológicos moleculares establecidos permitiendo generación de adaptados, modificados genéticamente modelos de cerdo para una amplia gama de condiciones de enfermedad1,4.
Sin embargo, en comparación con modelos de roedores, se limita el número de animales de un modelo de cerdo respectivo que puede prestarse para experimentos en cualquier momento. Esto es debido al intervalo de generación porcina de aproximadamente un año y los esfuerzos financieros y tiempo necesarios para la generación de modelos porcinos y cría de animales. Por lo tanto, los individuos de un modelo porcino, así como las muestras que se pueden generar de estos cerdos, son muy valiosos, especialmente si genéticamente modelos porcinos o cuestiones experimentales a largo plazo (por ejemplo, las complicaciones tardías de enfermedades crónicas) se examinan en individuos de2,6,7.
En el curso de cualquier estudio, realización de análisis adicionales que no había sido previsto en el diseño experimental inicial del estudio puede más tarde resultan para ser relevantes, por ejemplo, distintas preguntas que surgen de previamente descubiertos por dirección resultados inesperados. Si las muestras adecuadas para tales experimentos adicionales no están disponibles, desproporcionadamente elevado costo y gastos de tiempo podrían ser necesarios generar cerdos adicionales y muestras de tejido. Para estar preparado para tales eventualidades, generación de colecciones de Biobanco de conservado muestras de respaldo de diferentes órganos, tejidos o bio-líquidos, cuantitativa y cualitativamente adecuados para una amplia gama de análisis posteriores, se considera un importante enfoque2,6,7. Derivando beneficios óptima de un modelo animal porcino, la disponibilidad de muestras adecuada Biobanco también ofrece la posibilidad única para efectuar un amplio espectro de métodos de análisis diferentes sobre los materiales idénticos a nivel de órganos múltiples en la misma cada animal, por ejemplo, por la distribución de las muestras a los científicos de diferentes grupos de trabajo organizados en una red de investigación2,6,7. Además, la estrategia de muestreo '' progresista '' en biobancos también contribuye a una reducción del número de animales necesarios en un estudio. Las ventajas del modelo porcino biobancos han demostrado recientemente en un órgano múltiple, multiomics estudio, examen de órganos diafonía en un modelo porcino genéticamente modificado de la diabetes a largo plazo, utilizando muestras del Biobanco cerdo Munich MIDY 2.
Hay algunos requisitos obligatorios Biobanco de muestras generalmente deben cumplir para establecer la fiabilidad y la interpretabilidad de los resultados de los análisis realizados posteriormente. Las muestras deben generarse reproducible, y deben ser adecuadamente representante, es decir, que reflejan las características morfológicas y moleculares interesadas del tejido/órgano las muestras fueron tomadas de7. Para ser conveniente para una amplia gama de tipos de análisis posteriores, las muestras deberán tomadas en cantidades suficientes y procesadas según las demandas (incluyendo las condiciones de tiempo y temperatura) de los diferentes métodos analíticos, incluyendo descriptivo Análisis histopatológicos, como cryohistology, parafina plástico histología, inmunohistoquímica, hibridación en situ , análisis microscópico ultraestructural de electrón y diagnóstico análisis de laboratorio clínico, así como moleculares Análisis de DNA, RNA, proteínas y metabolitos.
Para permitir la evaluación de una amplia gama de distintos parámetros morfológicos cuantitativos tales como números, volúmenes, longitudes o superficies de las estructuras tisulares distintos análisis estereológicos cuantitativa, planos de sección al azar de la las muestras histológicas de los respectivos órganos/tejidos necesitan ser preparado7,8,9,10,11. En estudios morfológicos cuantitativos, la determinación precisa del volumen total del tejido, órgano o compartimiento del órgano, las muestras fueron tomadas de (es decir, el espacio de referencia) es de crucial importancia7,9 , 12 para calcular las cantidades absolutas de los parámetros de interés en el respectivo órgano, tejido u organismo. Finalmente, el efecto de la contracción relacionada con la inclusión del tejido durante la preparación de secciones histológicas tiene que ser determinada y tener en cuenta13. Por lo tanto, cuantitativos análisis estereológicos, especialmente de muestras archivadas (fijada bloques de tejido embebido, cortes histológicos, las muestras de tejido, etc.) de los estudios anteriores son a veces severamente limitada o incluso imposible12, particularmente si la volumetría de los respectivos órganos/tejidos no se realizó, si no hay diseños de muestreo adecuado se aplicaron para garantizar muestras representativas, si los números y cantidades de muestras individuales disponibles no son suficientes, o si el procesamiento de la muestras es incompatible con la estimación de los parámetros morfológicos cuantitativos de interés. Debido a los múltiples posibles factores que influyen en la adecuación de los materiales de archivo-muestra para los análisis de distintos parámetros morfológicos cuantitativos inequívocamente no puede ser respondida, pero depende de la cuidadosa evaluación de cada caso individual.
Así, como la ubicación, tamaño, número, proceso, dirección de ajuste y orientación de muestras potencialmente afectarán los resultados de los análisis posteriores, estos factores son de gran importancia y deben ser considerados en el diseño experimental de cualquier estudio. En cuanto a estos aspectos y las particularidades de la anatomía porcina, directrices de muestreo completa, detallada, a gran escala recientemente se han establecido modelos animales adaptados al porcino, proporcionando una sólida referencia estandarizados, reproducibles y la eficiente generación de muestras redundantes, adecuadamente procesadas, alta calidad de más de 50 diferentes porcino órganos y tejidos6,7.
Las descripciones metodológicas y el video tutorial se muestra en el presente artículo proporcionan detallada, ilustrativo, comprensible, instrucciones paso a paso para el funcionamiento práctico de una variedad de técnicas de volumetría, toma de muestras de tejidos porcinos y órganos y procesamiento de las muestras de tejido para métodos de diferente análisis aguas abajo. Las técnicas recomendadas incluyen métodos para determinación de densidades basadas en los principios de Arquímedes y Cavalieri9y volúmenes de órganos y tejidos, incluyendo la determinación de las dimensiones de la contracción tridimensional de tejidos relacionados con la incrustación en diferentes inclusión media14 durante el proceso de la examinación histológica, acerca de la aplicación del muestreo aleatorio sistemático ponderado de volumen posible, procesamiento de muestras de tejido muestreado para diferentes posterior Análisis7,8,9,15y generación de apropiadamente orientan y procesaron muestras para posibles análisis estereológicos cuantitativa7,8, 9,10,11. Junto a su aplicación en proyectos de Biobanco porcino, los métodos demostrados son generalmente apropiados para examinar propiedades cuantitativas histo-morfológico de órganos/tejidos todos los estudios. Además, diseños de muestreo al azar sistemático son particularmente beneficios para la generación de muestras representativas en experimentos utilizando métodos de análisis molecular para detectar alteraciones de la abundancia de, por ejemplo, ARN, proteínas o metabolitos en distintos órganos y tejidos.
Los párrafos siguientes proporcionan una breve introducción a estos métodos, mientras que su rendimiento práctico se describe en la sección de protocolo.
Determinación de volúmenes de órganos y tejidos Determinación de volúmenes y pesos de órganos es importante en varios parámetros experimentales, como estos factores podrían indicar cambios, potencialmente relacionados a experimentalmente examinan factores de interés. El volumen total de un órgano, tejido también es necesaria para calcular parámetros cuantitativos absolutos (por ejemplo, el número total de células), de densidades de volumen stereologically Estimado numérico(es decir, el número de células por unidad de volumen del tejido)7,12. Aparte de técnicas de uso de equipo técnico complejo, tales como tomography de la computadora, hay básicamente tres métodos prácticos utilizados para determinar el volumen absoluto de un órgano o tejido. El volumen de un órgano puede determinarse "volumétrica medida directa" según el principio de Arquímedes, es decir, medición del volumen de agua o solución salina desplazados por la estructura cuando completamente sumergida. Sin embargo, de órganos porcinos comparable grandes, estos enfoques son imprácticos y propensas a la imprecisión, ya que requieren matraces volumétricos/medición muy grande. Más convenientemente, se puede calcular el volumen de un órgano/tejido de su peso y densidad7,12,16, que eficientemente puede ser determinado mediante el «método de inmersión»7,12 ,16 (paso protocolo 1.1.). Volúmenes de órganos y tejidos se pueden calcular también mediante volumetría enfoques basados en el "principio de Cavalieri" (1598-1647). En términos simples, se establece el principio de Cavalieri, que si dos objetos son seccionados en planos paralelos a un plano de tierra, y los perfiles de las secciones de cortan a través de los dos objetos en la correspondiente Distancias desde el plano de tierra tienen las mismas áreas, los dos objetos tienen el mismo volumen. Así, el volumen de los objetos forma arbitrariamente puede estimarse como el producto de sus áreas de Perfil de sección en planos paralelos, igualmente distante de la sección y la distancia entre los planos de sección. Esto es comprensible con la siguiente analogía: considere dos pilas que consiste en el mismo número de monedas idénticas se colocan lado a lado, una pila con la ordenada de monedas apilado uno encima del otro dando forma cilíndrica de la pila de monedas y el otro pila de monedas con el centro coloca monedas (Figura 3A). Aunque las formas de las dos pilas de moneda son diferentes, sus volúmenes son los mismos, desde las áreas de las monedas en los niveles correspondientes de ambas pilas (es decir, las áreas de los perfiles de secciones paralelas de cortan a través de dos pilas de moneda en distancias iguales desde el de tierra) son idénticos. Estimación de los volúmenes de órganos porcinos y tejidos utilizando el principio de Cavalieri7,12,15 se describe en el paso 1.2.
Determinación del grado de contracción de tejidos relacionados con la inclusión histológica En el análisis de varios parámetros morfológicos cuantitativos medidos en las secciones histológicas del tejido, el efecto de la contracción relacionada con la inclusión del tejido que ocurre durante el proceso de la histología del tejido debe ser determinado y tomado en cuenta. El grado de contracción de tejidos relacionados con la inclusión puede ser variable y depende tanto en el tejido, su procesamiento y el medio empotrar8,13,17,18,19. Generalmente, se producen cambios relacionados con la inclusión del volumen de una muestra de tejido (es decir, principalmente la contracción) en las tres dimensiones del espacio y, por tanto, afecta a todos los parámetros dimensionales estimados por análisis cuantitativos estereológicos8 . Básicamente, se puede estimar el grado de contracción de tejidos relacionados con la inclusión, expresado como el factor de contracción de tejido lineal (fS), como se muestra en el paso 1.3. y se utiliza para la corrección de parámetros morfológicos cuantitativos (sensible a la contracción)14.
Muestreo aleatorio sistemático ponderado por el volumen de órganos/tejidos Para el establecimiento de una colección de Biobanco de muestras de órganos y tejidos porcinos, enfoques de muestreo al azar sistemático ponderado por el volumen como se describe en el paso 2 han demostrado para ser técnicas prácticas, ahorro de tiempo y eficientes para la generación de representante, tejido de usos múltiples muestras7,8,9,15.
Generación de secciones isotrópico aleatorio uniforme y Vertical uniforme aleatoria secciones para cuantitativos análisis estereológicos Las muestras de tejido de Biobanco deben ser conveniente para una amplia variedad de métodos diferentes análisis estereológicos cuantitativa para la estimación de un máximo de parámetros que no se pudo determinar sin una muestra adecuadamente preparada. Casi todos los parámetros estereológicos cuantitativos pueden determinarse, utilizando «isotrópico (independiente) uniforme aleatorio (IUR) las secciones»8,9. En las secciones IUR, la orientación tridimensional del plano de sección de la muestra de tejido es al azar. Esto puede lograrse por asignación al azar de la posición de la muestra de tejido en relación con la posición del plano de sección, como se aplica en el método de "Isector"11 (paso 3.1 del Protocolo), o por asignación al azar de la orientación del plano de sección relativa a la muestra de tejido, como en el método de "Orientadores"10 (paso 3.2 del Protocolo). En muestras de tejido, como piel o mucosa muestra mostrar un eje vertical presente de forma natural, o definido y bien identificable, preparación de "uniforme aleatorio (VUR) las secciones verticales" (paso de protocolo 3.3.) estrictamente seccionado en el plano de su eje vertical es ventajoso8,20. Para un discurso completo de los fundamentos teóricos del muestreo de IUR/VUR y una discusión amplia de posibles análisis estereológicos cuantitativas aguas abajo, el lector interesado se refiere a los libros de texto de estereología cuantitativa en la vida Ciencias8,9.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Carl Roth GmbH, Germany</td>
			<td>Agar (powder), Cat.: 5210.3</td>
			<td>Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany</td>
			<td>Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902</td>
			<td>Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casting molds (metal)</td>
			<td>Engelbrecht Medizin &#38; Labortechnik, Ederm&#252;nde, Germany</td>
			<td>Einbettsch&#228;lchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b</td>
			<td>Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm)</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.&#160; Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard &#38; Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux&#180;s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)</td>
			<td>Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China</td>
			<td>Y10006 and Y10005</td>
			<td>Any other type of standard office foldback clamps will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (anatomical)</td>
			<td>NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811</td>
			<td>Any type of anatomical forceps will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde-solution 4%</td>
			<td>SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany</td>
			<td>Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005</td>
			<td>Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph paper (for calibration)</td>
			<td>B&#252;romarkt B&#246;ttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de</td>
			<td>Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514</td>
			<td>Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)</td>
			<td>NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Becherglas SIMAX&#174; , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036</td>
			<td>Any kind of glass- or plastic beakers of 5 &#8211; 100 ml volume will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory scale(s)</td>
			<td>Mettler Toledo GmbH, Gie&#223;en, Germany</td>
			<td>PM6000</td>
			<td rowspan="2">Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Sartorius AG, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>BP61S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Engelbrecht Medizin &#38; Labortechnik, Ederm&#252;nde, Germany</td>
			<td>FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700</td>
			<td>Any kind of single-use microtome blades will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Morphometry/planimetry software/system</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss-Kontron, Eching, Germany</td>
			<td>VideoplanTM image analysis system</td>
			<td>Out of stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D40</td>
			<td>Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod&#160; will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transparencies</td>
			<td>Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany</td>
			<td>Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:&#160; 3562</td>
			<td>Any (laser)-printable plastic transparency will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random number tables</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Plano GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td>T5016</td>
			<td>Any kind of razor blades will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler</td>
			<td>B&#252;romarkt B&#246;ttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de</td>
			<td>Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30</td>
			<td>Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline (0.9%)</td>
			<td>Carl Roth GmbH, Germany</td>
			<td>Natriumchlorid, &#62;99% Cat.: 0601.1</td>
			<td>To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Aesculap AG &#38; Co KG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>BRAUN Surgical blades N&#176;22</td>
			<td>Any kind of scalpel blades will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanner</td>
			<td>Hewlett-Packard</td>
			<td>hp scanjet 7400c</td>
			<td>Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicing devices</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.&#160; Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)</td>
			<td>Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany</td>
			<td>Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm</td>
			<td>Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin wire</td>
			<td>Basteln &#38; Hobby Schobes, Stra&#223;furth, Germany. www,bastel-welt.de</td>
			<td>Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742</td>
			<td>Any other kind of thin wire will also do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue paper</td>
			<td>NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305</td>
			<td>Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof pen</td>
			<td>Staedler Mars GmbH &#38; Co KG, N&#252;rnberg, Grmany</td>
			<td>Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2</td>
			<td>Any other kind of waterproof pen will do as well.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sampling strategies and processing of biobank tissue samples from porcine biomedical models

En la investigación médica aplicada, modelos porcinos constantemente han vuelto más populares. Considerando el alto valor de cada animal, particularmente de cerdos genéticamente modificados modelos y a menudo limitado número de animales disponibles de estos modelos, establecimiento de colecciones (Biobanco) de muestras de tejido adecuadamente procesado adecuado para un amplio espectro de métodos de análisis posteriores, incluyendo análisis no especificados en el momento del muestreo, representan enfoques significativos para aprovechar al máximo el valor traslacional del modelo. Con respecto a las peculiaridades de la anatomía porcina, recientemente han establecido directrices amplias para generación estandarizado de representante, muestras de alta calidad de diferentes órganos porcinos y tejidos. Estas directrices son indispensables para la reproducibilidad de los resultados y su comparabilidad entre diferentes estudios e investigadores. La grabación de los datos básicos, como el órgano pesos y volúmenes, la determinación de los lugares de muestreo y de los números de las muestras de tejido que se generen, así como su orientación, tamaño, proceso y direcciones de ajuste, es factores relevantes determinar la generalización y la utilización de la muestra para análisis morfológicos moleculares, cualitativas y cuantitativas. Aquí, se presenta una demostración ilustrativa, práctica, paso a paso de las técnicas más importantes para la generación de representante, espécimen multiuso Biobanco de tejidos porcinos. Los métodos aquí descritos incluyen la determinación de volúmenes de órganos y tejidos y densidades, la aplicación de un procedimiento de muestreo al azar sistemático ponderado por el volumen de órganos parenquimales por punto de conteo, la determinación del grado de contracción de tejido relacionadas con la fijación histológica de las muestras y la generación de muestras aleatoriamente orientadas para análisis estereológicos cuantitativos, como isotrópica uniforme aleatorio (IUR) las secciones generadas por los métodos de "Orientador" y "Isector" y vertical uniforme aleatorias secciones (VUR).

Técnica de inmersión para la determinación de la densidad del tejido/órgano
Figura 12A -B muestra la representación determinación de la densidad y el volumen de un riñón porcino utilizando la técnica de inmersión que se describe en el paso 1.1 (figura 1, figura 2). Resultados más representativos de las mediciones de...

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Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

Estrategias de muestreo y procesamiento de las muestras de tejido de Biobanco de porcinos modelos biomédicos

La aplicación práctica y el rendimiento de métodos para la generación de muestras de tejido representativo de modelos animales porcinos para un amplio espectro de análisis aguas abajo en el Banco de proyectos se demuestran, incluyendo volumetría, muestreo al azar sistemático, y procesamiento de muestras de tejido de tipo cualitativo y cuantitativo análisis morfológicos y moleculares de diagnóstico.

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

This video demonstrates two key techniques for sampling and processing biobank porcine tissue specimens. The submersion technique reliably estimates total organ and tissue volume and the orientator technique generates random isotropic tissue sections for unbiased estimation of quantitative morphological parameters. The main advantage of the submersion technique for tissue density determination is that it can be applied to any kind of tissue and that it produces reliable results for small as well as for large samples.The advantages of the orientator technique are that it is highly efficient and also works with large tissue samples. To begin volumetry for a large organ excise an appropriately sized piece of tissue from the organ. Carefully swab the sample with a paper towel to remove excess blood and tissue fluid.Then weigh the sample on a precision scale and record the weight of the sample. Add 0.9%saline to a beaker of suitable size. Do not completely fill the beaker to prevent overflow during tissue emersion.Place the beaker on the scale then submerge a forceps or a self-constructed sample holder in the saline until the mark on the forceps or sample holder reaches the liquid. Next, reset the display of the scale to zero. Carefully attach the tissue sample to the forceps or sample holder and completely submerge the sample in the saline until the marked position is reached.To record reliable density measurements it is important to ensure that the sample is completely submerged and to avoid any contact of the submerged sample to the inner walls or the bottom of the beaker. While holding the sample in position, record the weight displayed on the scale. Use this measurement and the density of saline at room temperature to calculate the volume of the sample.Then calculate the density of the tissue sample from the weight of the sample and its volume. For large organs and tissues, such as this kidney, perform repeated measurements with multiple samples and calculate the average density from the single measurements. For small samples and small organs measured in total such as the pituitary gland, repeat the measurement three times before calculating the average organ density from the single measurement values.Finally, calculate the total volume of the organ, tissue or organ compartment from its weight and density. Place a fixed tissue specimen on a print of an equiangular circle with one edge parallel to the zero to 180 degree direction. Then use a random number table to determine a random angle.Find the corresponding marks on the scale of the equiangular circle. Using these marks, cut a section through the sample with the section plane oriented parallel to the direction of the random angle indicated on the scale of the equiangular circle and a vertical to the resting surface of the sample. Place the tissue block with the section surface facing down on a cosine weighted circle.With the edge of the resting surface placed parallel to the one-to-one direction. Now cut a new section through the sample at a random angle determined using the random number table. The resulting section plane is an isotropic uniform random section.This table shows the representative densities of several porcine tissues and organs determined using the submersion technique. Most porcine tissues display density values slightly higher than one referring to the density of water. Whereas tissues swimming in saline, such as adipose tissue for example, display densities lower than one.This figure shows four representative IUR sections of porcine left ventricular myocardium prepared with the orientator technique. Note the changed cutting angles in the different IUR sections. Once mastered, the submersion technique for tissue density determination can be done in a few minutes.If it is performed properly. Isotropic uniform random tissue sections generated with the orientator technique are suitable for estimation of any quantitative morphological parameters using appropriate stereological analysis methods. digital music.

Research

JoVE Journal

Medicine

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Generación de microesferas de alginato para aplicaciones biomédicas

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

Investigación

Medicina

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Cómo medir plegable cortical a partir de imágenes MR: un tutorial paso a paso para Calcular Índice Gyrification Local

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Procesamiento de tejido primario Tumor cerebral para ensayos con células madre y flujo de Ordenación

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

La broncoscopia guiada visualmente, intrabronquial Inoculación e: El pulmón bovino en la Investigación Biomédica<em&gt; En Vivo</em&gt; Técnicas de Muestreo

There is an ongoing search for alternative animal models in research of respiratory medicine. Depending on the goal of the research, large animals as ...

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Absorción de fluidos nasales y bronquiales: precisión muestras de la Mucosa respiratoria humana y laboratorio de procesamiento de muestras

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

Mejora de un modelo de infarto de miocardio porcino pecho cerrado por normalización del tejido y procedimientos de muestreo de sangre

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved ...

Human Subcutaneous Adipose Tissue Sampling Using a Mini-Liposuction Technique

Muestreo de tejido adiposo subcutáneo humano mediante una técnica de mini-liposucción

Studies on adipose tissue are useful in understanding metabolic and other conditions. Human subcutaneous adipose tissue is accessible. With appropriate ...

Repetitive Blood Sampling from the Subclavian Vein of Conscious Rat

Muestreo repetitivo de sangre de la vena subclavia de rata consciente

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to ...

Dissection Techniques and Histological Sampling of the Heart in Large Animal Models for Cardiovascular Diseases

Técnicas de disección y muestreo histológico del corazón en grandes modelos animales para enfermedades cardiovasculares

The standard gross examination and sampling are key elements in the reproducibility and success of experimental studies of cardiovascular diseases carried ...

Extracción económica de ADN de diatomeas con un kit modificado

Extraction of Diatom DNA from Water Samples and Tissues

Autor destacado: Pruebas de diatomeas para el examen forense de ahogamiento 

Extracción de ADN de diatomeas a partir de muestras de agua y tejidos

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. ...