Name: sampling strategies and processing of biobank tissue samples from porcine biomedical models
Uploaded: 2018-03-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models at JoVE.com

Författarna vill tacka Lisa Pichl för utmärkt teknisk assistans.

Alla metoder som beskrivs använder här vävnadsprover från döda djur och följa helt den tyska lagliga reglementet av djurskydd.
1. Volumetry
<ol><li>Nedsänkning teknik för bestämning av vävnad/Organ tätheter (figur 1 och figur 2) 7 , 12 , 16<ol>
<li>Förbereda material: skalpell...

<ol>
	<li>Aigner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+pigs+as+models+for+translational+biomedical+research.">Transgenic pigs as models for translational biomedical research.</a> J Mol. Med. 88, 653-664 (2010).</li><li>Blutke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Munich+MIDY+Pig+Biobank:+A+unique+resource+for+studying+organ+crosstalk+in+diabetes.">The Munich MIDY Pig Biobank: A unique resource for studying organ crosstalk in diabetes.</a> Mol Metab. 6, 931-940 (2017).</li><li>Klymiuk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-deficient+pigs+provide+new+insights+into+the+hierarchy+of+physiological+derangements+of+dystrophic+muscle.">Dystrophin-deficient pigs provide new insights into the hierarchy of physiological derangements of dystrophic muscle.</a> Hum Mol Genet. 22, 4368-4382 (2013).</li><li>Klymiuk, N., Seeliger, F., Bohlooly, Y. M., Blutke, A., Rudmann, D. G., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailored+pig+models+for+preclinical+efficacy+and+safety+testing+of+targeted+therapies.">Tailored pig models for preclinical efficacy and safety testing of targeted therapies.</a> Toxicol Pathol. 44, 346-357 (2016).</li><li>Renner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permanent+neonatal+diabetes+in+INSC94Y+transgenic+pigs.">Permanent neonatal diabetes in INSC94Y transgenic pigs.</a> Diabetes. 62, 1505-1511 (2013).</li><li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inside+the+first+pig+biobank.">Inside the first pig biobank.</a> Nature. 519, 397-398 (2015).</li><li>Albl, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+sampling+guides+for+porcine+biomedical+models.">Tissue sampling guides for porcine biomedical models.</a> Toxicol Pathol. 44, 414-420 (2016).</li><li>Gundersen, H. J. G., Mirabile, R., Brown, D., Boyce, R. W., Haschek, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+principles+and+sampling+procedures+for+toxicologic+pathologists.">Stereological principles and sampling procedures for toxicologic pathologists.</a> Haschek and Rousseaux's Handbook of Toxicologic Pathology. , 215-286 (2013).</li><li>Howard, C. V., Reed, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy. , 1-277 (2005).</li><li>Mattfeldt, T., Mall, G., Gharehbaghi, H., Moller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+surface+area+and+length+with+the+orientator.">Estimation of surface area and length with the orientator.</a> J Microsc. 159, 301-317 (1990).</li><li>Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isector:+A+simple+and+direct+method+for+generating+isotropic,+uniform+random+sections+from+small+specimens.">The isector: A simple and direct method for generating isotropic, uniform random sections from small specimens.</a> J Microsc. 165, 427-431 (1992).</li><li>Tschanz, S., Schneider, J. P., Knudsen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereology:+Planning,+volumetry+and+sampling+are+crucial+steps+for+a+successful+study.">Design-based stereology: Planning, volumetry and sampling are crucial steps for a successful study.</a> Ann Anat. 196, 3-11 (2014).</li><li>Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+shrinkage+and+unbiased+stereological+estimation+of+particle+number+and+size.">Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size.</a> J Microsc. 204, 232-246 (2001).</li><li>Mattfeldt, T., Doerr, W., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereologische+Methoden+in+der+Pathologie+[Stereologic+methods+in+pathology].">Stereologische Methoden in der Pathologie [Stereologic methods in pathology].</a> Normale und pathologische Anatomie. , (1990).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology+and+its+prediction.">The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction.</a> J Microsc. 147, 229-263 (1987).</li><li>Scherle, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+volumetry+of+organs+in+quantitative+stereology.">A simple method for volumetry of organs in quantitative stereology.</a> Mikroskopie. 26, 57-60 (1970).</li><li>Nielsen, K. K., Andersen, C. B., Kromann-Andersen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+between+the+effects+of+paraffin+and+plastic+embedding+of+the+normal+and+obstructed+minipig+detrusor+muscle+using+the+optical+disector.">A comparison between the effects of paraffin and plastic embedding of the normal and obstructed minipig detrusor muscle using the optical disector.</a> J Urol. 154, 2170-2173 (1995).</li><li>Schneider, J. P., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+mouse+lung+tissue+dimensions+during+processing+for+morphometry:+a+comparison+of+methods.">Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L341-L350 (2014).</li><li>von Bartheld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+particles+in+the+z-axis+of+tissue+sections:+Relevance+for+counting+methods.">Distribution of particles in the z-axis of tissue sections: Relevance for counting methods.</a> NeuroQuantology. 10, 66-75 (2012).</li><li>Baddeley, A. J., Gundersen, H. J., Cruz-Orive, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+surface+area+from+vertical+sections.">Estimation of surface area from vertical sections.</a> J microsc. 142, 259-276 (1986).</li><li>Blutke, A., Schneider, M. R., Wolf, E., Wanke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+hormone+(GH)-transgenic+insulin-like+growth+factor+1+(IGF1)-deficient+mice+allow+dissociation+of+excess+GH+and+IGF1+effects+on+glomerular+and+tubular+growth.">Growth hormone (GH)-transgenic insulin-like growth factor 1 (IGF1)-deficient mice allow dissociation of excess GH and IGF1 effects on glomerular and tubular growth.</a> Physiol Rep. 4, e12709 (2016).</li><li>Hermanns, W., Liebig, K., Schulz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembedding+immunohistochemical+demonstration+of+antigen+in+experimental+polyarthritis+using+plastic+embedded+whole+joints.">Postembedding immunohistochemical demonstration of antigen in experimental polyarthritis using plastic embedded whole joints.</a> Histochemistry. 73, 439-446 (1981).</li><li>Böck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Romeis Mikroskopische Technik. , 1-697 (1989).</li><li>Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D., Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bancroft's theory and practice of histological techniques. , 1-654 (2013).</li><li>Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+estimates+of+alveolar+number+and+size+and+capillary+length+and+surface+area+in+mice+lungs.">Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs.</a> Anat Rec (Hoboken). 292, 113-122 (2009).</li><li>Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+for+stereology+in+lungs.">Sampling for stereology in lungs.</a> Eur Respir Rev. 15, 107-114 (2006).</li><li>Junatas, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+analysis+of+size+and+density+of+hepatocytes+in+the+porcine+liver.">Stereological analysis of size and density of hepatocytes in the porcine liver.</a> J Anat. 230, 575-588 (2017).</li></ol>

Generering av biobank provkollektioner från svin djurmodeller kräver robusta tekniker och protokoll för bestämning av organ/vävnad volymer, reproducerbara generering av representant, redundanta vävnadsprover som är lämplig för ett brett spektrum av olika analysmetoder, och för randomisering av orienteringen av provet avsnitt för kvantitativa beteendetester analyser. De metoder som beskrivs i denna artikel är anpassade efter storleken på svin organ och vävnader, och har utvecklats för att effektivt möta de...

I translationell medicin, grisar är vanligare för användning som stort djur modeller1,2,3,4,5, flera fördelaktiga likheter mellan de svin och människans anatomi och fysiologi, och tillgängligheten av etablerade molekylär biologiska metoder som möjliggör generering av skräddarsydda, genetiskt modifierade gris modeller för ett brett utbud av sjukdom villkor1,4.
Jämfört med gnagare modeller, är antalet djur av en respektive gris modell som kan tillhandahållas för experiment när som helst dock begränsad. Detta beror på svin generation intervallet för ungefär ett år och de finansiella och tidskrävande insatser som krävs för generering av svin modeller och djurhållning. Enskilda djur av en svin modell, liksom de prover som kan genereras från dessa grisar, är därför mycket värdefullt, särskilt om genetiskt modifierade svin modeller och/eller långsiktiga experimentella problem (t.ex., det sena komplikationer av kroniska sjukdomar) undersöks i äldre individer2,6,7.
Under loppet av någon studie, prestanda av ytterligare analyser som inte hade planerats i den ursprungliga experimentella designen av studien skulle senare visa sig vara relevanta, t.ex., till adress skilda frågor som uppkommer tidigare upptäckt oväntade fynd. Om det inte finns lämpliga prover för sådana ytterligare experiment kan oproportionerligt höga kostnader och tidskrävande utgifter vara nödvändigt att generera ytterligare grisar och vävnadsprover. För att vara förberedd för sådana eventualiteter, anses generation av biobank samlingar av bevarade säkerhetskopiera prover av olika organ, vävnader eller bio-vätskor, kvantitativt och kvalitativt lämplig för ett brett spektrum av efterföljande analyser, en viktig strategi2,6,7. Som följer optimala fördelar ett porcint djurmodell, tillgången på lämpliga biobanksprov erbjuder också den unika möjligheten att utföra ett brett spektrum av olika analysmetoder på identiskt provmaterial på mång--organ nivå i den mycket samma enskilda djur, t.ex., av distribution av prover till forskare av olika arbetsgrupper som organiseras i en forskning nätverk2,6,7. Dessutom bidrar den '' framåtblickande '' provtagningsstrategi inom biobanker också till en minskning av antalet djur som behövs i en studie. Fördelarna med svin modell biobanker har nyligen visats i en flera organ, multiomics studie, att undersöka organ cross talk i en genetiskt modifierade svin modell av långvarig diabetes mellitus, med prover från München MIDY Gris biobanken 2.
Det finns vissa obligatoriska krav biobanksprov måste i allmänhet följa för att fastställa tillförlitlighet och tolkningsbarhet av resultaten av de senare utförda analyserna. Proverna måste genereras reproducibly, och de måste vara representant, dvstillräckligt återspeglar de berörda morfologiska och molekylära funktionerna av vävnad/organ proven togs från7. För att vara lämplig för ett brett utbud av nedströms analystyper, måste proverna tas i tillräckliga mängder och behandlas enligt de olika analysmetoder, inklusive beskrivande krav (inklusive tid och temperatur förhållanden) histopatologiska analyser, såsom cryohistology, paraffin och plast histologi, immunohistokemi, i situ hybridisering, ultrastrukturella elektron mikroskopisk analyser och kliniska diagnostiska laboratorieanalyser, samt som molekylär analyser av DNA, RNA, proteiner och metaboliter.
För att möjliggöra bedömning av en rad distinkta kvantitativa morfologiska parametrar såsom tal, volymer, längder eller ytor av distinkta vävnad strukturer av kvantitativa beteendetester analyser är randomiserade avsnitt flygplan av den histologiska prover av respektive organ/vävnader behöver förberedas7,8,9,10,11. I kvantitativa morfologiska studier, exakt bestämning av den totala volymen av vävnad, organ eller organ fack, proven togs från (dvs.utrymmet som referens) är ytterst viktig7,9 , 12 för att beräkna de absoluta kvantiteterna av de berörda parametrarna inom respektive organ, vävnad eller organism. Effekten av inbäddning-relaterade vävnad krympning under upprättandet av histologiska avsnitt har småningom, bestämmas och tas in i konto13. Kvantitativa beteendetester analyser, särskilt av arkiverade prover (fast vävnadsprover, inbäddade vävnad block, histologiska sektioner, etc.) från tidigare studier är därför ibland starkt begränsad eller omöjligt12, särskilt om volumetry i respektive organ/vävnader inte utfördes, om ingen adekvat provtagning mönster tillämpades för att motivera representativa prover, om de siffror och mängder av tillgängliga enskilda prover är otillräckliga eller om behandlingen av den prover är oförenligt med uppskattning av den kvantitativa morfologiska parametrar av intresse. På grund av de många möjliga påverkande faktorerna, lämpligheten av Arkiv-provmaterial för analyser av olika kvantitativa morfologiska parametrar kan inte entydigt besvaras, men beror på en noggrann bedömning av varje enskilt fall.
Således, eftersom plats, storlek, antal, bearbetning, trimning riktning och orientering av prover potentiellt påverkar resultaten av de efterföljande analyserna, dessa faktorer är av stor betydelse och måste beaktas i experimentell design av någon studie. När det gäller dessa aspekter och särdragen hos svin anatomi, omfattande, detaljerad, storskalig provtagning riktlinjer anpassas till svin djurmodeller har nyligen fastställts, som ger en robust hänvisning till standardiserade och reproducerbar , och effektiv generering av redundant, tillräckligt bearbetade, högkvalitativa prover från mer än 50 olika svin organ och vävnader6,7.
De metodiska beskrivningarna och den video tutorial som visas i denna artikel ger detaljerad, belysande, begriplig, steg-för-steg-instruktioner för praktiska utförandet av en mängd olika tekniker för volumetry, provtagning av svin vävnader och organ, och bearbetning av vävnadsprover för olika nedströms analysmetoder. De utvalda teknikerna inkluderar metoder för bestämning av organ/vävnad volymer och densiteter baserat på principerna om Archimedes och Cavalieri9, inklusive fastställande av dimensionerar av tredimensionella krympning av vävnad relaterade till den inbäddning i olika bädda media14 under bearbetning för Histologisk undersökning, tillämpningen av genomförbara volymvägda systematisk slumpmässig provtagning metoder, behandling av samplade vävnadsprover för olika efterföljande analyser7,8,9,15, och generation av korrekt orienterade och bearbetade prover för potentiella kvantitativa beteendetester analyser7,8, 9,10,11. Bredvid deras tillämpning i svin biobank projekt är påvisade metoderna i allmänhet lämpligt för alla studier kvantitativa histo-morfologiska egenskaper av organ/vävnader. Dessutom är systematisk slumpmässig provtagning mönster särskilt fördelaktigt för generering av representativa prover i experiment med molekylära analysmetoder för att upptäcka överflöd förändringar av, t.ex., RNAs, proteiner eller metaboliter i olika organ och vävnader.
Nästa punkter ger en kort introduktion till dessa metoder, medan deras praktiska resultat beskrivs i avsnittet protokoll.
Bestämning av organ/vävnad volymer Bestämning av organvikter och volymer är viktigt i flera experimentella inställningar, eftersom dessa faktorer kan indikera förändringar, potentiellt relaterade till experimentellt undersökte faktorer av intresse. Den totala volymen av en organ/vävnad krävs också ofta att beräkna absoluta kvantitativa parametrar (t.ex., den totala mobilnummer), från stereologically beräknade numeriska volym tätheter (dvs, det antalet celler per volymenhet av vävnad)7,12. Förutom teknik använder komplexa tekniska utrustning, såsom datortomografi, det finns i princip tre praktiska metoder som vanligen används för att bestämma den absoluta volymen av ett organ eller vävnad. Volymen av en orgel kan bestämmas genom ”direkt volumetrisk mätning” enligt principen om Archimedes, dvs, volymmätning av vatten eller koksaltlösning som fördrivits av strukturen när helt nedsänkt. För comparably stora svin organ är dessa metoder dock opraktisk och benägna att vagheten, eftersom de kräver mycket stor volymetrisk/mäta kolvar. Mer bekvämt, volymen av en organ/vävnad kan beräknas från dess vikt och densitet7,12,16, som effektivt kan bestämmas med hjälp av den ”nedsänkning metod”7,12 ,16 (protokoll steg 1.1.). Organ/vävnad volymer kan också uppskattas med volumetry metoder som bygger på ”principen om Cavalieri” (1598 – 1647). I enkla termer, Cavalieri principen anges, att om två objekt är sektioneras på plan som är parallellt med ett jordplan och profiler av avsnitten skär genom de två objekten på motsvarande avstånd från jordplanet har samma områden, två objekt har samma volym. Volymen av godtyckligt formade objekt kan således beräknas som produkten av deras avsnitt profilområden i parallella, lika avlägsen avsnitt flygplan och avståndet mellan de avsnitt plan. Detta är begripligt med följande liknelse: överväga två högar bestående av samma antal identiskt mynt placeras sida vid sida, en stack med den mynt ordnad staplade ovanpå varandra ger en cylindrisk form av mynt stacken och andra stack av mynt med off-center placerad mynt (figur 3A). Även om båda mynt stackar former är olika, deras volymer är samma, sedan områdena av mynten på motsvarande nivåer i båda stackar (dvs.områdena av profiler av parallella sektioner skär genom båda mynt stackar på lika avstånd från den marken) är identiska. Uppskattning av volymerna av svin organ och vävnader med hjälp av Cavalieri princip7,12,15 beskrivs i steg 1.2.
Fastställande av omfattningen av vävnad krympning relaterade till histologiska inbäddning I analyser av flera kvantitativa morfologiska parametrar mäts i histologiska vävnadssnitt, har effekten av inbäddning-relaterade vävnad krympning som inträffar under vävnad behandling för histologi skall fastställas och beaktas. Omfattningen av inbäddning-relaterade vävnad krympning kan vara variabel, och beror både på vävnaden, dess bearbetning och inbäddning medium8,13,17,18,19. Allmänhet, inbäddning-relaterade förändringar av volymen av ett vävnadsprov (dvsmestadels krympning) förekommer i alla tre dimensioner av rymden, och därmed påverkar alla dimensionell parametrar beräknad av kvantitativa beteendetester analyser8 . I princip kan omfattningen av inbäddning-relaterade vävnad krympning, uttryckt som en Linjär krympning vävnadsfaktor (fS), uppskattas som visas i steg 1.3. och används för korrigering av (krympning-känslig) kvantitativa morfologiska parametrar14.
Volymvägda systematisk slumpmässig provtagning av organ/vävnader För etableringen av en biobank samling av svin orgel/vävnadsprover, har volymviktade systematisk slumpmässig provtagning metoder såsom beskrivs i steg 2 visat sig vara praktiska, tidsbesparande och effektiva tekniker för generering av ombud, Multi-Purpose vävnad prover7,8,9,15.
Generation av isotropiskt enhetliga Random avsnitt och vertikala enhetliga Random avsnitt för kvantitativa beteendetester analyser Biobank vävnadsprover måste vara lämplig för ett brett utbud av olika kvantitativa beteendetester analysmetoder för uppskattning av högst parametrar som inte kunde fastställas utan en lämplig förlaga. Nästan alla kvantitativa beteendetester parametrar kan bestämmas med hjälp av ”isotropiskt (oberoende) enhetliga slumpmässiga (IUR) avsnitt”8,9. I IUR avsnitt, är avsnittsplanet av vävnadsprov tredimensionella orientering randomiserade. Detta kan uppnås genom randomisering av placera av vävnadsprov i förhållande till placeringen av avsnittsplanet, som tillämpas i ”Isector” metod11 (protokoll steg 3.1) eller genom randomisering av orienteringen av avsnittsplanet förhållande till den vävnadsprov, liksom de ”Orientator” metod10 (protokoll steg 3,2). I vävnadsprover, som hud- eller slemhinna specimen visar en naturligt, eller definierade och korrekt identifierbar vertikal axel, upprättandet av ”vertikala enhetliga slumpmässiga (VUR) avsnitt” (protokoll steg 3.3.) strikt sektioneras inom planet för deras lodräta axeln är fördelaktiga8,20. För en komplett diskurs de teoretiska grunderna i IUR/VUR provtagning och en omfattande diskussion om potentiella nedströms kvantitativa beteendetester analyser hänvisas intresserade till läroböcker av kvantitativa stereology i livet vetenskaper8,9.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Carl Roth GmbH, Germany</td>
			<td>Agar (powder), Cat.: 5210.3</td>
			<td>Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper</td>
			<td>Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany</td>
			<td>Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902</td>
			<td>Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casting molds (metal)</td>
			<td>Engelbrecht Medizin &#38; Labortechnik, Ederm&#252;nde, Germany</td>
			<td>Einbettsch&#228;lchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b</td>
			<td>Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm)</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Copy templates of cross grids (5mm - 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.&#160; Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard &#38; Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux&#180;s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)</td>
			<td>Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China</td>
			<td>Y10006 and Y10005</td>
			<td>Any other type of standard office foldback clamps will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (anatomical)</td>
			<td>NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811</td>
			<td>Any type of anatomical forceps will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde-solution 4%</td>
			<td>SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany</td>
			<td>Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005</td>
			<td>Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph paper (for calibration)</td>
			<td>B&#252;romarkt B&#246;ttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de</td>
			<td>Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514</td>
			<td>Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)</td>
			<td>NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Becherglas SIMAX&#174; , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036</td>
			<td>Any kind of glass- or plastic beakers of 5 &#8211; 100 ml volume will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory scale(s)</td>
			<td>Mettler Toledo GmbH, Gie&#223;en, Germany</td>
			<td>PM6000</td>
			<td rowspan="2">Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Sartorius AG, G&#246;ttingen, Germany</td>
			<td>BP61S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Engelbrecht Medizin &#38; Labortechnik, Ederm&#252;nde, Germany</td>
			<td>FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700</td>
			<td>Any kind of single-use microtome blades will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Morphometry/planimetry software/system</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss-Kontron, Eching, Germany</td>
			<td>VideoplanTM image analysis system</td>
			<td>Out of stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D40</td>
			<td>Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod&#160; will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transparencies</td>
			<td>Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany</td>
			<td>Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:&#160; 3562</td>
			<td>Any (laser)-printable plastic transparency will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random number tables</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Plano GmbH, Wetzlar, Germany</td>
			<td>T5016</td>
			<td>Any kind of razor blades will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler</td>
			<td>B&#252;romarkt B&#246;ttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de</td>
			<td>Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30</td>
			<td>Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline (0.9%)</td>
			<td>Carl Roth GmbH, Germany</td>
			<td>Natriumchlorid, &#62;99% Cat.: 0601.1</td>
			<td>To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Aesculap AG &#38; Co KG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>BRAUN Surgical blades N&#176;22</td>
			<td>Any kind of scalpel blades will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanner</td>
			<td>Hewlett-Packard</td>
			<td>hp scanjet 7400c</td>
			<td>Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicing devices</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>n.a.</td>
			<td>Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.&#160; Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)</td>
			<td>Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany</td>
			<td>Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm</td>
			<td>Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin wire</td>
			<td>Basteln &#38; Hobby Schobes, Stra&#223;furth, Germany. www,bastel-welt.de</td>
			<td>Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742</td>
			<td>Any other kind of thin wire will also do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue paper</td>
			<td>NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305</td>
			<td>Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof pen</td>
			<td>Staedler Mars GmbH &#38; Co KG, N&#252;rnberg, Grmany</td>
			<td>Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2</td>
			<td>Any other kind of waterproof pen will do as well.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sampling strategies and processing of biobank tissue samples from porcine biomedical models

I translationell medicinsk forskning, har svin modeller stadigt blivit mer populära. Med tanke på det höga värdet på enskilda djur, särskilt av genmodifierad gris modeller och ofta begränsas av antalet tillgängliga djur av dessa modeller, inrättandet av (biobank) samlingar av tillräckligt bearbetade vävnadsprover passar en brett spektrum av efterföljande analyser metoder, inklusive analyser inte anges vid tidpunkten för provtagning, utgör meningsfulla strategier för att dra full nytta av överbryggande värdet av modellen. Om Europeiska skoindustrins särdrag av svin anatomi, har omfattande riktlinjer nyligen fastställts för standardiserade generation av företrädare, högkvalitativa prover från olika svin organ och vävnader. Dessa riktlinjer är väsentliga förutsättningar för reproducerbarheten för resultaten och deras jämförbarhet mellan olika studier och utredare. Registrering av grundläggande uppgifter, såsom organvikter och volymer, vid fastställandet av mätplatser som numrerar av vävnadsprover ska genereras, samt deras orientering, storlek, bearbetning och trimning riktningar, är relevanta faktorer fastställande av generaliserbarhet och användbarhet av förlagan för molekylär, kvalitativa och kvantitativa morfologiska analyser. Här, en belysande, praktiska, stegvisa demonstration av de viktigaste teknikerna för generering av representant, multi-purpose biobank provbit från svin vävnader presenteras. Metoderna som beskrivs här inkludera bestämning av organ/vävnad volymer och densiteter, tillämpningen av ett volymvägda systematisk slumpmässig provtagningsförfarande för parenkymal organ genom punkt-räkna, bestämning av omfattningen av vävnad krympning relaterade till histologiska inbäddning av prover, och generering av slumpmässigt orienterade prover för kvantitativa beteendetester analyser, till exempel isotropa enhetliga slumpmässiga (IUR) avsnitt genereras av metoderna ”Orientator” och ”Isector”, och vertikala uniform slumpmässig (VUR) sektioner.

Nedsänkning teknik för bestämning av vävnad/organ densitet
Figur 12A -B visar representativa bestämning av densiteten och volymen av en svin njure med nedsänkning tekniken som beskrivs i steg 1,1 (figur 1, figur 2). Mer representativa resultat densitet mätningar av ytterligare svin organ och vävnader presenteras i <str...

Watch this Scientific Journal Video about Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models at JoVE.com

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

Strategier för provtagning och behandling av Biobank vävnadsprover från svin biomedicinska modeller

Den praktiska tillämpningen och prestanda för metoder för generering av representativa vävnadsprover på svin djurmodeller för ett brett spektrum av nedströms analyser i biobank projekt demonstreras, inklusive volumetry, systematisk slumpmässig provtagning, och differentierad behandling av vävnadsprover för kvalitativa och kvantitativa morfologiska och molekylära analyser typer.

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

This video demonstrates two key techniques for sampling and processing biobank porcine tissue specimens. The submersion technique reliably estimates total organ and tissue volume and the orientator technique generates random isotropic tissue sections for unbiased estimation of quantitative morphological parameters. The main advantage of the submersion technique for tissue density determination is that it can be applied to any kind of tissue and that it produces reliable results for small as well as for large samples.The advantages of the orientator technique are that it is highly efficient and also works with large tissue samples. To begin volumetry for a large organ excise an appropriately sized piece of tissue from the organ. Carefully swab the sample with a paper towel to remove excess blood and tissue fluid.Then weigh the sample on a precision scale and record the weight of the sample. Add 0.9%saline to a beaker of suitable size. Do not completely fill the beaker to prevent overflow during tissue emersion.Place the beaker on the scale then submerge a forceps or a self-constructed sample holder in the saline until the mark on the forceps or sample holder reaches the liquid. Next, reset the display of the scale to zero. Carefully attach the tissue sample to the forceps or sample holder and completely submerge the sample in the saline until the marked position is reached.To record reliable density measurements it is important to ensure that the sample is completely submerged and to avoid any contact of the submerged sample to the inner walls or the bottom of the beaker. While holding the sample in position, record the weight displayed on the scale. Use this measurement and the density of saline at room temperature to calculate the volume of the sample.Then calculate the density of the tissue sample from the weight of the sample and its volume. For large organs and tissues, such as this kidney, perform repeated measurements with multiple samples and calculate the average density from the single measurements. For small samples and small organs measured in total such as the pituitary gland, repeat the measurement three times before calculating the average organ density from the single measurement values.Finally, calculate the total volume of the organ, tissue or organ compartment from its weight and density. Place a fixed tissue specimen on a print of an equiangular circle with one edge parallel to the zero to 180 degree direction. Then use a random number table to determine a random angle.Find the corresponding marks on the scale of the equiangular circle. Using these marks, cut a section through the sample with the section plane oriented parallel to the direction of the random angle indicated on the scale of the equiangular circle and a vertical to the resting surface of the sample. Place the tissue block with the section surface facing down on a cosine weighted circle.With the edge of the resting surface placed parallel to the one-to-one direction. Now cut a new section through the sample at a random angle determined using the random number table. The resulting section plane is an isotropic uniform random section.This table shows the representative densities of several porcine tissues and organs determined using the submersion technique. Most porcine tissues display density values slightly higher than one referring to the density of water. Whereas tissues swimming in saline, such as adipose tissue for example, display densities lower than one.This figure shows four representative IUR sections of porcine left ventricular myocardium prepared with the orientator technique. Note the changed cutting angles in the different IUR sections. Once mastered, the submersion technique for tissue density determination can be done in a few minutes.If it is performed properly. Isotropic uniform random tissue sections generated with the orientator technique are suitable for estimation of any quantitative morphological parameters using appropriate stereological analysis methods. digital music.

Research

JoVE Journal

Medicine

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Generering av alginatmikrosfärer för biomedicinska tillämpningar

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Hur man mäter Bark Folding från MR bilder: en steg-för-steg anvisning för att beräkna lokala Gyrification Index

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Behandling av primär hjärntumör Mjukpapper för analyser stamceller och Flow Sortering

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

Den Bovin Lung i biomedicinsk forskning: Visuellt Guidad Bronkoskopi, intrabronkial Ympning och<em&gt; In Vivo</em&gt; Provtagningstekniker

There is an ongoing search for alternative animal models in research of respiratory medicine. Depending on the goal of the research, large animals as ...

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Absorptionen av Nasal och bronkiell vätskor: Precision provtagning i mänskliga andningsorganen slemhinnor och laboratorium bearbetning av prover

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

Improvement of a Closed Chest Porcine Myocardial Infarction Model by Standardization of Tissue and Blood Sampling Procedures

Förbättring av en sluten bröstet svin hjärtinfarkt modell av standardisering av vävnad och blod provtagningsmetoder

Myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury contributes to almost half of the necrotic area after myocardial infarction. To date there is no approved ...

Human Subcutaneous Adipose Tissue Sampling Using a Mini-Liposuction Technique

Humant subkutant fettvävnadsprovtagning med hjälp av en minifettsugningsteknik

Studies on adipose tissue are useful in understanding metabolic and other conditions. Human subcutaneous adipose tissue is accessible. With appropriate ...

Repetitive Blood Sampling from the Subclavian Vein of Conscious Rat

Repetitiv blodprovtagning från den subklaviska venen hos medveten råtta

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to ...

Dissection Techniques and Histological Sampling of the Heart in Large Animal Models for Cardiovascular Diseases

Dissektionstekniker och histologisk provtagning av hjärtat i stora djurmodeller för hjärt-kärlsjukdomar

The standard gross examination and sampling are key elements in the reproducibility and success of experimental studies of cardiovascular diseases carried ...

Ekonomisk DNA-extraktion av kiselalger med hjälp av ett modifierat kit

Extraction of Diatom DNA from Water Samples and Tissues

Författare i fokus: Kiselalgstestning för rättsmedicinsk drunkningsundersökning 

Extraktion av kiselalgs-DNA från vattenprover och vävnader

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. ...