Name: generating transgenic plants with single-copy insertions using bibac-gw binary vector
Uploaded: 2018-03-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector at JoVE.com

この研究は、オランダ技術財団 STW (12385) オランダ組織科学的研究 (NWO) の一部であるし、するが部分的で、経済情勢の大臣 (MS に OTP グラント 12385) 資金を供給によってサポートされます。 我々 は pCH20、BIBAC GW ベクトルのバックボーンを提供するキャロル ・ マクゴーギー ・ ハミルトン (コーネル大学、米国) をありがちましょう。

1. バイナリのベクトルに興味のシーケンスを挿入します。
<ol><li>
ゲートウェイのエントリとバイナリのベクトルを準備します。
	<ol>
<li>DNA のフラグメントまたはサプライヤーの提案によると小型準備キットを使用して興味の遺伝子を含むゲートウェイ エントリ ベクトルを分離します。 注: BIBAC GW ベクトルしたがって細菌の選択にカナマイシン (Km) を使用する必要、カナマイ...

<ol>
	<li>Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chalcone+synthase+cosuppression+phenotypes+in+petunia+flowers:+comparison+of+sense+vs.+antisense+constructs+and+single-copy+vs.+complex+T-DNA+sequences.">Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences.</a> Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).</li><li>Stam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+silencing+of+chalcone+synthase+in+Petunia+by+inverted+transgene+repeats.">Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats.</a> Plant J. 12, 63-82 (1997).</li><li>Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position-dependent+methylation+and+transcriptional+silencing+of+transgenes+in+inverted+T-DNA+repeats:+implications+for+posttranscriptional+silencing+of+homologous+host+genes+in+plants.">Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants.</a> Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).</li><li>Jin, Y., Guo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgene-induced+gene+silencing+in+plants.">Transgene-induced gene silencing in plants.</a> Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).</li><li>Oltmanns, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Backbone-Free,+Low+Transgene+Copy+Plants+by+Launching+T-DNA+from+the+Agrobacterium+Chromosome+1[W][OA].">Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA].</a> Plant Physiol. , (2010).</li><li>Ye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+production+of+single+copy+backbone-free+transgenic+plants+in+multiple+crop+species+using+binary+vectors+with+a+pRi+replication+origin+in+Agrobacterium+tumefaciens.">Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens.</a> Transgenic Res. , (2011).</li><li>Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+binary-BAC+system+for+plant+transformation+with+high-molecular-weight+DNA.">A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA.</a> Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).</li><li>Frary, A., Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+and+stability+of+high+molecular+weight+DNA+transformation:+an+analysis+in+tomato.">Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato.</a> Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).</li><li>Vega, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+maize+(Zea+mays)+with+Cre-lox+site+specific+recombination+cassettes+in+BIBAC+vectors.">Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors.</a> Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).</li><li>Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BIBAC-GW-based+vectors+for+generating+reporter+lines+for+site-specific+genome+editing+in+planta.">BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta.</a> Plasmid. 89, 27-36 (2017).</li><li>Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transfer+of+intact+high+molecular+weight+DNA+into+plant+chromosomes.">Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).</li><li>Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+tandem+repeats+are+sufficient+for+paramutation-induced+trans-generational+silencing.">Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing.</a> PLoS Genet. 9 (10), e1003773 (2013).</li><li>Shizuya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+stable+maintenance+of+300-kilobase-pair+fragments+of+human+DNA+in+Escherichia+coli+using+an+F-factor-based+vector.">Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).</li><li>Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pair+of+new+BAC+and+BIBAC+vectors+that+facilitate+BAC/BIBAC+library+construction+and+intact+large+genomic+DNA+insert+exchange.">A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange.</a> Plant Methods. 7, 33 (2011).</li><li>Woodman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+PCR+of+Intact+Bacteria+(Colony+PCR).">Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR).</a> Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).</li><li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mol+Biol.">Mol Biol.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).</li><li>Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+the+preparation+of+plant+genomic+DNA+for+PCR+analysis.">A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis.</a> Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349 (1991).</li><li>Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cetyltrimethyl+ammonium+bromide+(CTAB)+DNA+miniprep+for+plant+DNA+isolation.">Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation.</a> Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments.">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923 (2012).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (2012).</li><li>Sosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatography+with+Sephadex+Gels.">Chromatography with Sephadex Gels.</a> Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).</li><li>Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nopaline+synthase:+transcript+mapping+and+DNA+sequence.">Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence.</a> J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).</li><li>Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+BAC+and+BIBAC+libraries+from+sunflower+and+identification+of+linkage+group-specific+clones+by+overgo+hybridization.">Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization.</a> Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).</li><li>Lee, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+plant-transformation-competent+BIBAC+library+and+genome+sequence+analysis+of+polyploid+Upland+cotton+(Gossypium+hirsutum+L).">Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L).</a> BMC Genomics. 14, 208 (2013).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+insert+Thellungiella+halophila+BIBAC+library+for+genomics+and+identification+of+stress+tolerance+genes.">A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes.</a> Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+BAC-+and+BIBAC-based+physical+map+of+the+soybean+genome.">A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome.</a> Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+physical+mapping+from+large-insert+clones+by+fingerprint+analysis+with+capillary+electrophoresis:+a+robust+physical+map+of+Penicillium+chrysogenum.">Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum.</a> Nucleic Acids Res. 33 (5), e50 (2005).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+physical+mapping+of+polyploids:+a+BIBAC+physical+map+of+cultivated+tetraploid+cotton,+Gossypium+hirsutum+L.">Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L.</a> PLoS One. 7 (3), e33644 (2012).</li><li>Frary, A., Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+and+stability+of+high+molecular+weight+DNA+transformation:+An+analysis+in+tomato.">Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato.</a> Transgenic Res. , (2001).</li><li>Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position-Dependent+Methylation+and+Transcriptional+Silencing+of+Transgenes+in+Inverted+T-DNA+Repeats:+Implications+for+Posttranscriptional+Silencing+of+Homologous+Host+Genes+in+Plants.">Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants.</a> Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).</li><li>G&#322;owacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+new+and+established+methods+to+determine+T-DNA+copy+number+and+homozygosity+in+transgenic+plants.">An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants.</a> Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).</li><li>Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverse+PCR+and+Quantitative+PCR+as+Alternative+Methods+to+Southern+Blotting+Analysis+to+Assess+Transgene+Copy+Number+and+Characterize+the+Integration+Site+in+Transgenic+Woody+Plants.">Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants.</a> Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).</li></ol>

生成する重要な遺伝子組み換え transgene の 1 つ、そのまま統合は使用バイナリ ベクトルの選択です。BIBAC 家族のベクトルは、種植物多く23,24,25,26,27,28に興味のシーケンスを提供する使用されています。BIBAC ベクトル、BIBAC-GW を含む高効率単一コ?...

遺伝子組換え植物を生成、するとき通常目的は安定を表明した統合された transgene(s) を持つことです。これは、そのままシングル コピー transgene の統合によって達成できます。複数の統合は、遺伝子サイレンシングにも、遺伝子の発現増加につながることができます。遺伝子のサイレンシングは挿入されたシーケンスはタンデムまたは反転繰り返し1,2,3,4に配置された場合に生じやすい。バイナリのベクトル、アグロバクテリウムのシャトルとして使用されます-植物ゲノムに興味のシーケンスを提供する変換実験を介する。植物のゲノムに統合の数はアグロバクテリウム5,6.にバイナリのベクトルのコピー数に依存多くの一般的に使用されるバイナリ ベクトル高いコピー ベクトル、したがって高の平均遺伝子コピー数をもたらす:シロイヌナズナ53.3 4.9 にコピーします。
T DNA の統合の数は、BIBAC7などまたはA. 根頭がんしゅ病菌染色体5T DNA を起動することにより、 A. 根頭がんしゅ病菌で低コピー数を持つバイナリのベクトルを使用して下げることが。このような場合の transgene の統合の平均数は 25,8,9,10以下です。あることが原因シングル コピー A. 根頭がんしゅ病菌で、大腸菌、BIBAC 誘導体が維持し、150 kb11と同じ大きさの構造を提供します。
GW 互換 BIBAC ベクトル10、12は、ゲートウェイのクローン作成を使用してベクターに興味の遺伝子の簡単な紹介を許可します。ゲートウェイ技術を使用するクローンの手順を大幅に簡略化、大規模な低コピー数ベクトル13,14, 低 DNA 収量などユニークな制限の限られた選択に関連付けられている一般的な問題の解決にも7,11のクローンを作成できるサイト。グルホシネート アンモニウム (pBIBAC-バー-GW) にどちらかの抵抗性または種皮 (pBIBAC RFP GW) 植物 (図 1)10,12で選択した DsRed 蛍光 pBIBAC GW 誘導体があります。両方のベクトルのカナマイシン耐性遺伝子は、細菌の選択マーカーとして使用されます。
PBIBAC GW ベクトルを組み合わせる: (1) 簡単なデザインと大腸菌、および (2) そのままシングル コピー統合planta で高効率で遺伝子操作。単一を運ぶ遺伝子組換え植物のおよそ半分とシロイヌナズナにおける平均 1.7 インテグレーションの pBIBAC GW ベクトル収量は T-DNA10を統合されています。
遺伝子を安定に発現は、ほとんど遺伝子組み換え生成のための要件です。遺伝子発現の安定は、そのまま、単一コピーの統合によって実現できます。そのまま、単一コピーの統合を運ぶ遺伝子組換え植物の使用は、しかし、さらに重要な場合たとえば、目的これらの依存性や修復、組み換え、変異などのクロマチンによるプロセスの効率化を研究することですゲノムの位置と挿入部位のクロマチン構造上のプロセス。我々 の関心ローカル ゲノム コンテキストに関する監督オリゴヌクレオチド変異 (ODM) の依存性を研究する突然変異遺伝子のままに、単一コピーの統合記者行のセットだった生成された (図 2)10。この行セットを使用して、むしろ似ている遺伝子発現レベルにもかかわらず、ゲノムの異なる場所で統合された形質転換における遺伝子座間の ODM 効率が異なることが示されました。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate monohydrate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>K0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulphate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>G0124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>R0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-3383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB3.1 competent cells</td>
			<td>Thermo Scientific - Invitrogen</td>
			<td>11782-018</td>
			<td>One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10B competent cells</td>
			<td>Thermo Scientific - Invitrogen</td>
			<td>18290-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR clonase enzyme mix&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific - Invitrogen</td>
			<td>11791-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tri-Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium dihydrate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>E0511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto tryptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Honeywell Fluka</td>
			<td>13423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1652089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator Gene Pulser</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>442613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Maltose monohydrate 90%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>32991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0138454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige Skoog medium</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glufosinate-ammonium (Basta)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>79391781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction enzymes</td>
			<td>NEB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting nylon membrane Hybond N+</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>15358</td>
			<td>or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 3MM Chr blotting paper</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>3030-931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylated BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>805740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-50 Coarse</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17004401</td>
			<td>or Sephadex G-50 Medium (17004301)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate&#160;</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>S5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon Sperm DNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage Phosphor screen and casette</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9564-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphor imager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>Typhoon FLA 7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Crosslinker</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>Stratalinker 1800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cling film (Saran wrap)</td>
			<td>Omnilabo</td>
			<td>1090681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific - Invitrogen</td>
			<td>16500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA marker &#8216;Blauw&#8217;; DNA ladder.</td>
			<td>MRC Holland</td>
			<td>MCT8070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA marker &#8216;Rood&#8217;; DNA ladder</td>
			<td>MRC Holland</td>
			<td>MCT8080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexanucleotide Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11277081001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large-Construct Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-sealable polyethylene tubing, clear</td>
			<td>various providers</td>
			<td></td>
			<td>the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat sealer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter disk</td>
			<td>Merck</td>
			<td>VSWP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization mesh</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>RPN2519</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating transgenic plants with single-copy insertions using bibac-gw binary vector

遺伝子組換え植物を生成、するとき一般に目的は transgene を安定に発現をしています。複数コピーの統合遺伝子サイレンシングにさらされている多くの場合と、遺伝子の 1 つ、そのまま統合が必要です。他の pBIBAC の誘導体のような細菌人工染色体 (pBIBAC GW)、に基づいてゲートウェイ互換性がある二進ベクトルは、高効率で単一コピーの遺伝子の挿入をことができます。、元の pBIBAC に改善は興味のシーケンス組み込むことが今簡単にベクトル転送 DNA (T-DNA) ゲートウェイを複製して、ゲートウェイ カセットは pBIBAC GW にクローン化されています。一般的 pBIBAC GW と変換結果 0.2 – 0.5 の効率 %、T DNA のままのシングル コピー統合を運ぶ、遺伝子組み換えの半分という。グルホシネート アンモニウム抵抗または種皮の植物では、選択した DsRed 蛍光と細菌の選択項目としてカナマイシン抵抗 pBIBAC GW ベクトルがあります。ここでは、一連のプロトコルが表示 pBIBAC GW を用いたトランスジェニック植物を生成するプロセスを介してリーダーを指導: 選択するの変換を植物の pBIBAC GW ベクトルに興味のシーケンスを再結合から始まってアグロバクテリウム、各種、遺伝子組み換え、DNA にしみが付くことを使用して挿入のイヌイットとコピーの数のための植物をテストします。注目は、単一および複数の座位でシングルとマルチ コピー統合を認識する DNA あぶらとり戦略の設計に与えられます。

生成された10BIBAC GW システムを使用して、植物の ODM を勉強するため記者構造だった構造は、ゲートウェイ エントリ ベクトル力がある pENTR gm12に設計され、pBIBAC-バー-GW (図 1) ゲートウェイ LR 再結合反応を利用した挿入します。
シロイヌナズナの pDM19、位置 120 eYFP ...

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Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

PBIBAC GW バイナリ ベクトルを使用そのままシングル コピー挿入、簡単なプロセスを生成する遺伝子組換え植物になります。ここでは、一連のプロトコルは、形質転換シロイヌナズナ植物を生成し、イヌイットのための植物をテストのプロセスを介してリーダーを指導し、挿入の数がコピーされます。

BIBAC GW バイナリ ベクトルを使用してシングル コピー挿入と遺伝子組換え植物を生成します。

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

植物の細胞や細胞小器官の壁を越え遺伝子やタンパク質を輸送するために、ペプチド由来方法

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Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

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Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

遺伝子破壊ミュータンス連鎖球菌緊張せず遺伝子クローニングの生成

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A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

細胞分裂に CRISPR/Cas9 を介した遺伝子ノックアウトのインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターの生産のためのプロトコル

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胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

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迅速かつ安易なパイプラインを生成する突然変異点ゲノムにc. の elegansを用いた CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

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Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

南しみが付くことおよびポリメラーゼの連鎖反応を使用してマウス胚性幹細胞での相同組換えイベントの識別

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Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

レンチウイルスベクター人間にエピゲノム編集ツールの効率的な配信用誘導多能性幹細胞由来の疾患モデル

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A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

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BIBAC GW バイナリ ベクトルを使用してシングル コピー挿入と遺伝子組換え植物を生成します。

BIBAC GW バイナリベクトルを使用してシングルコピー挿入と遺伝子組換え植物を生成します。