Name: partial lobular hepatectomy: a surgical model for morphologic liver regeneration
Uploaded: 2018-05-31T13:30:00
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Nous remercions P. Chu pour l’exécution de H & E et histologie ; et C. Wang et A. McCarty pour discussions utiles. Recherche a été financée grâce au financement de la Virginie et D. K. Ludwig Fund for Cancer Research ; le National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL058770 et U01HL099999) ; le California Institute for Regenerative Medicine (RC1 00354) subventions à I.W. Y.R. a été soutenue par le Human Frontier Science programme Career Development Award (CDA00017), la Fondation de recherche allemande (RI 2787/1), l’Institut de cellules souches de Siebel et le Thomas et Stacey Siebel Foundation (1119368-104-GHBJI). J.M.T. était accompagnée de la NIH (T32GM007365), le prix National du Service de recherche (1F30DK108561) et Paul et Daisy Soros Fellowship pour les nouveaux américains.

Toutes les expériences sur des animaux ont été réalisées en stricte conformité avec les directives énoncées par l’Association pour l’évaluation et de la Commission Administrative d’accréditation du laboratoire Animal Care International (AAALAC) et de l’Université de Stanford sur l’Animal de laboratoire Soins (APLAC), (numéro de protocole #10266) et dans les États-Unis ou la Loi sur la protection des animaux européenne, Directive 2010/63/UE. Le protocole a été approuvé par le Comité sur l’ét...

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Atteinte hépatique aiguë a traditionnellement étudiée à l’aide de produit chimique (acétaminophène, éthanol, tétrachlorure de carbone) ou modèles chirurgicaux (70 % une hépatectomie partielle). La réponse régénératrice après hépatectomie partielle de 70 % a été caractérisée d’impliquer l’hypertrophie des hépatocytes global et plusieurs cycles de division cellulaire4,5. Pour arrêter l’hémorragie, cependant, ce modèle est limité, c...

La capacité de régénérer un organe, soit de rétablir la forme et la fonction, a été pensée pour être plus souvent perdu au fil du temps évolutionnaire. Le potentiel de régénération du foie chez les mammifères adult après une lésion aiguë chimique ou physique s’est avéré implique la mobilisation de tous les hépatocytes restants aboutissant à des vagues d’hypertrophie et quelques tours de la division cellulaire, résultant en un mais fonctionnel orgue architecture différente1,2,3,4,5. Récemment, les études ont commencé à caractériser le comportement régénératrice d’organes chez les mammifères nouveau-nés à des blessures au sein de la première semaine de vie6,7,8. Ces études ont montré que lorsque blessé durant le développement néonatal, certains organes de mammifères réagissent avec régénération morphologique au lieu de compensatoire croissance ou fibrose7,8.
Des études récentes ont montré que la régénération de la structure globale et la fonction se produit pendant le tôt période néonatale6,7,8. Protocoles établis des lésions hépatiques impliquent des blessures chimiques ou administration d’éthanol9,10,11, acétaminophène12,13,14,15 , tétrachlorure de carbone16,17,18,19, 70 % une hépatectomie partielle4,20,21ou la suppression de la gauche et lobes médians. Administration chimique conduit à la mort des cellules hépatocytes, mais laisse souvent des micro - et macro-structures intactes. Régénération morphologique ne peut être étudiée aisément dans ce contexte, que l’architecture globale hépatique n’était pas oblitéré. L’hépatectomie partielle 70 % implique les ligature de suture des vaisseaux principaux, qui est nécessaire pour arrêter le saignement, mais laisse un environnement non physiologique avec une interruption permanente du système vasculaire. De plus, cette méthode a été utilisée uniquement sur des rongeurs adultes et son application aux nouveaux-nés est techniquement extrêmement difficile. Dans cette optique, nous avons développé une méthode dans laquelle 20 à 30 % de l’apex du lobe gauche est enlevé dans une souris nouveau-née de P0 (Figure 1 a-1 b). Cette méthode est par chirurgie conservatrice, peu invasive, pas techniquement difficile et mène au brut perte de morphologie sans la ligature des vaisseaux, laissant la place à la régénération se produisent. Le protocole étape par étape qui en résulte, décrit ci-dessous, permet pour tout chercheur d’effectuer une hépatectomie partielle lobulaire sur souris néonatales afin d’étudier les mammifères régénération néonatale dans les premiers stades de la vie après l’accouchement. Cette méthode a également des applications claires pour des études comparatives en médecine régénératrice et de la biologie des cellules souches, comme il peut être utilisé dans le foie pendant les derniers stades de la vie.
Les études d’atteinte hépatique aiguë plus courantes sont lésion induite chimiquement, amputation du foie adulte ou 70 % une hépatectomie partielle. Dommages chimiques souvent consiste en une administration par voie intraveineuse, intrapéritonéale ou orale d’acétaminophène, tétrachlorure de carbone ou d’éthanol et sont un modèle relativement simple et non invasif des blessures. Tel que déjà mentionné, les résultats de dommages chimiques dans la mort des cellules hépatocytes, mais souvent les feuilles stroma et parenchyme structures intactes, rendant difficile de faire des revendications sur régénération morphologique. Dommages chimiques souvent se concentre sur les vaisseaux hépatiques, ce qui en fait une technique utile pour étudier le site et blessures spécifiques des cellules, mais rend également difficile à interroger, au niveau des organes entiers, autres populations qui peut être situé plus loin de navires, et qui peut contribuer à la régénération. Malgré ces limites, dommages chimiques reste un modèle de blessures très physiologiquement pertinentes et utiles.
Adulte 70 % une hépatectomie partielle consiste à enlever le lobe gauche et médian après ligature des vaisseaux hépatique. La réponse à une hépatectomie a été bien caractérisée : le foie amputé 14 jours post 70 % une hépatectomie partielle développe une architecture nettement différente de celle du lobe original intact, comme les hépatocytes des lobes restants droite et noyau caudés subir une hypertrophie et quelques cycles de division cellulaire4,5. Cela représente la masse perdue et fonction, mais ne parvient pas à se régénérer les deux lobes amputés et donc ne remplace pas la morphologie générale. En conséquence, la réponse de blessure à 70 % une hépatectomie partielle est utile pour étudier les mécanismes de croissance compensatoire avec régénération limitée.
Nous décrivons ici pleinement un protocole pour une hépatectomie lobulaire partielle néonatale. La procédure implique une sélection animale appropriée et préparation, préparation du champ opératoire, chirurgie et la récupération. Optimisation et adaptation de chacune de ces étapes peuvent être nécessaires pour différentes applications du protocole.
Nous avons largement réalisé et optimisé ce protocole sur les chiots de C57BL/6J de type sauvage (JAX 000664), cependant, afin d’étudier les mécanismes de régénération et les différentes populations cellulaires, nous avons également utilisé divers animaux transgéniques y compris souris associées Cre diverses et CreERT2 transgènes ou knock-ins (JAXAxin2CreERT2 018867, et JAX Sox9CreERT2 018829) en combinaison avec des journalistes fluorescents, telles que l’arc-en-ciel et mTmG (R26VT2/GK3, R26 mT/mG) 22 , 23. nous avons ne trouvé aucun besoin de changer cette méthodologie pour les souches de souris différente, car aucune différence dans les résultats de survie ou potentiel de régénération ont été observés.
En plus d’utiliser des souches animales différentes, nous avons effectué également partielle hepatectomies lobulaire sur souris néonatales traitées avec petites molécules, telles que la 4-hydroxy-tamoxifen et 5-éthynyl-2′-désoxyuridine (EdU). Le diméthylsulfoxyde (DMSO) et éthanol ont été utilisés comme solvants, comme il a été constaté que l’huile de maïs a été une cause importante de morbidité. Dans le cas contraire, nous avons constaté que l’administration intrapéritonéale de petites molécules n’affecte pas la survie ou résultats régénératrices. Nous prédisons que ce protocole sera adapté pour une utilisation avec d’autres petites molécules pour interroger les différents aspects de la régénération.
Chirurgies de souris néonatale peuvent être techniquement difficiles et peuvent nécessiter une expertise particulière en gestion d’animaux et de dissection microscopique. Expertise de l’élevage est nécessaire pour éviter le cannibalisme maternels après une intervention chirurgicale et durant la période de récupération immédiate.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surrogate mother and surrogate litter (optional)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Serum (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providine-iodine or equivalent antiseptic solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mm straight spring micro scissors</td>
			<td>Vannas</td>
			<td>72932-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5SF Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Kelly forceps</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>17-050G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Sunbeam</td>
			<td>000771-810-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott Labs</td>
			<td>0044-5260-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Anesthesia System</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>1205S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze, 10.16 x 10.16cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-761-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 monocryl sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>MCP489G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;S35839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid, Plain, 110V</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4-000-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-912-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Cost Induction Chamber</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SOMNO-0730</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

partial lobular hepatectomy: a surgical model for morphologic liver regeneration

Régénération d’orgue morphologiques suite à la perte de tissu aiguë est fréquente chez les vertébrés inférieurs, mais est rarement observée dans la vie postnatale chez les mammifères. Régénération du foie adulte après hépatectomie partielle de 70 % se traduit par hypertrophie des hépatocytes avec une réplication dans des lobes restants avec la restauration de l’activité métabolique, mais avec une perte permanente de la morphologie et l’architecture de la lobe blessé. Ici, nous détaillons une nouvelle méthode chirurgicale chez le nouveau-né qui laisse un environnement physiologique propice à la régénération. Ce modèle implique l’amputation de l’apex du lobe gauche et un régime de gestion conservatrice subséquente et n’a pas la nécessité d’une ligature des principaux vaisseaux hépatiques ou des lésions chimiques, laissant un environnement physiologique où la régénération peut se produire. Nous étendons ce protocole à des amputations sur des souris (P7-14) juvéniles, au cours de laquelle le foie blessé passe de régénération d’organes à croissance compensatoire par l’hypertrophie. Le protocole présenté, bref 30 min fournit un cadre pour étudier les mécanismes de régénération, son déclin âge-associé chez les mammifères et la caractérisation des souches hépatiques putatif ou progéniteurs.

Figure 1 a détaille une chronologie générale de l’hépatectomie partielle lobulaire néonatale (schématique à la Figure 1 b) et la durée prévue de la période d’attente jusqu'à ce que la régénération est observée. Régénération subtile du lobe gauche peut être observée 7-14 jours post chirurgie. La régénération complète a souvent été observée après que 56 jours après l’intervention chirurgicale. Sou...

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Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Une hépatectomie partielle lobulaire : Un modèle chirurgical pour la régénération du foie morphologique

Nous présentons ici une nouvelle méthode pour la résection partielle du lobe hépatique gauche chez les souris néonatales (jour 0). Ce nouveau protocole est convenable pour l’étude d’atteinte hépatique aiguë et réponse de blessures dans le cadre néonatal.

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Régénération rénale à l&#39;âge adulte poisson zèbre par gentamicine blessures induites

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Recherche

Biologie du développement

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Découlant épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à partir de souches pluripotentes induites (iPS) de différentes tailles de corps embryoïdes

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Ablation spécifique des hépatocytes chez le poisson zèbre pour étudier conduit biliaire-Régénération hépatique

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Évaluation simultanée de cardiomyocytes synthèse de l&#39;ADN et Ploïdie: Une méthode pour aider Quantification de cardiomyocytes Régénération et Chiffre d&#39;affaires

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Développement d&#39;un fibrotique du foie Modèle induite de l&#39;éthanol en Zebrafish pour étudier de cellules souches médiée hépatocytes Régénération

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

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