Name: partial lobular hepatectomy: a surgical model for morphologic liver regeneration
Uploaded: 2018-05-31T13:30:00
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Agradecemos Chu P. para a realização de H & E e histologia; e C. Wang e r. McCarty para debates úteis. Pesquisa foi apoiada através de financiamento da Virgínia e D. K. Ludwig fundos para pesquisa do câncer; Nacional coração, pulmão e Instituto de sangue (R01HL058770 e U01HL099999); e o Instituto de Califórnia a medicina regenerativa (RC1 00354) subvenções I.W. Y.R. foi apoiado pelo humano Frontier Science programa carreira desenvolvimento Award (CDA00017), Fundação alemã de pesquisa (RI 2787/1), o Instituto de células-tronco de Siebel e o Thomas e Stacey Siebel Foundation (GHBJI-1119368-104). JMT foi apoiado pelo NIH (T32GM007365), o Prêmio Nacional de serviço de pesquisa (1F30DK108561) e Paul e Daisy Soros Fellowship para Nova americanos.

Todos os animais foram realizados experimentos em estrita conformidade com as directrizes estabelecidas pela Associação de avaliação e acreditação do laboratório Animal conta internacional (AAALAC) e da Universidade de Stanford painel administrativo em animais de laboratório Cuidados (APLAC), (número de protocolo #10266) e nos Estados Unidos, ou o Europeu Animal Welfare Act, Directiva 2010/63/UE. O protocolo foi aprovado pelo Comité de ética de experimentos Animal do governo da Baviera, Alemanha e recebeu a pe...

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Lesão hepática aguda tem sido tradicionalmente estudado usando química (paracetamol, etanol, tetracloreto de carbono), ou modelos cirúrgicos (70% hepatectomy parcial). A resposta regenerativa após hepatectomy parcial 70% tem sido caracterizada a participação global hepatócito hipertrofia e várias rodadas de divisão celular4,5. Para parar a hemorragia, no entanto, este modelo é limitado, como os principais vasos devem ser ligados, deixando um ambiente a...

A capacidade de regenerar um órgão, ou para restaurar a forma e função, foi pensada para ser principalmente perdido ao longo do tempo evolutivo. O potencial regenerativo do fígado dos mamíferos adulto após lesão aguda de química ou física foi encontrado para envolver a mobilização de todos os hepatócitos restantes, resultando em ondas de hipertrofia e algumas rodadas de divisão celular, resultando em um funcional, mas arquitetonicamente diferente órgão1,2,3,4,5. Recentemente, estudos começaram a caracterizar a resposta regenerativa dos órgãos de mamíferos neonatais a lesão na primeira semana de vida6,7,8. Estes estudos têm mostrado que, quando feridos durante o desenvolvimento neonatal, certos órgãos de mamíferos respondem com regeneração morfológica em vez de compensação crescimento ou fibrose7,8.
Estudos recentes demonstraram que a regeneração da estrutura global e a função ocorre durante o início período neonatal6,7,8. Lesão hepática estabelecidos protocolos envolvem lesão química ou administração de etanol9,10,11, paracetamol12,13,14,15 , tetracloreto de carbono16,17,18,19, 70% hepatectomy parcial4,20,21ou remoção da esquerda e lóbulos medianos. Administração química leva à morte de células do hepatócito, mas muitas vezes deixa o micro e macroestruturas intactas. Regeneração morfológica não pode prontamente ser estudada neste contexto, como a arquitetura hepática em geral não se extinguiu. A hepatectomy parcial 70% envolve a ligadura da sutura dos vasos grandes, que é necessária para parar o sangramento, mas deixa um ambiente não-fisiológica com interrupção permanente da vasculatura. Além disso, esse método só tem sido utilizado em roedores adultos, e sua aplicação para neonatos tecnicamente é extremamente difícil. Com isto em mente, desenvolvemos um método em que 20-30% do ápice do lobo esquerdo é removido em um recém-nascido mouse P0 (figura 1A-1B). Este método é cirurgicamente conservador, minimamente invasivo, não tecnicamente desafiador e leva à perda da morfologia sem a ligadura da vasculatura, deixando espaço para a regeneração ocorra de efectivação. O protocolo resultante do passo a passo, descrito abaixo, permite a qualquer pesquisador realizar uma hepatectomy parcial lobular em ratos neonatais para estudar mamíferos regeneração neonatal nas fases iniciais de vida pós-natal. Esse método também tem aplicações claras para estudos comparativos em medicina regenerativa e biologia de células-tronco, como ele pode ser usado no fígado durante as fases posteriores da vida.
Os estudos mais comuns de lesão hepática aguda são quimicamente induzida dano, amputação de fígado adulta ou hepatectomy parcial de 70%. Dano químico muitas vezes envolve a administração intravenosa, intraperitoneal ou oral de paracetamol, tetracloreto de carbono ou etanol e é um modelo de lesão relativamente fácil e não-invasiva. Como já discutido, resultados de dano químico na morte de celular do hepatócito, mas muitas vezes folhas estroma e parênquima estruturas intactas, tornando-se difícil fazer afirmações sobre regeneração morfológica. Dano químico muitas vezes gira em torno dos vasos hepáticos, tornando-se uma técnica útil para estudar o local e a lesão de células específicas, mas também dificulta a interrogar, no nível do órgão inteiro, outras populações que pode situar-se longe dos navios e que podem contribui para a regeneração. Apesar dessas limitações, dano químico continua a ser um modelo de lesão altamente fisiologicamente relevantes e úteis.
Adulto hepatectomy parcial de 70% envolve a remoção dos lobos esquerdos e medianos após ligadura da vascularização hepática. A resposta a hepatectomy tem sido bem caracterizada: o fígado amputado 14 dias pós 70% hepatectomy parcial desenvolve uma arquitetura grosseiramente diferente do lobo original intacto, como os hepatócitos dos lobos direito e caudados restantes submeter-se hipertrofia e algumas rodadas de divisão celular4,5. Isto torna-se massa perdida e função, mas falha regenerar os dois lobos amputados e, portanto, não substitui a morfologia bruta. Como resultado, a resposta da lesão a hepatectomy parcial 70% é útil para estudar os mecanismos de crescimento compensatório com regeneração limitada.
Aqui, descrevemos totalmente um protocolo para um hepatectomy lobular parcial neonatal. O procedimento envolve a seleção apropriada de animais e preparação, preparação do campo cirúrgico, cirurgia e recuperação. Otimização e adaptação de cada uma dessas etapas podem ser necessárias para diferentes aplicações do protocolo.
Temos amplamente realizada e otimizado este protocolo sobre filhotes de C57BL/6J de tipo selvagem (JAX 000664), no entanto, para estudar populações de células diferentes e mecanismos de regeneração, também usamos vários animais transgénicos, incluindo ratos, abrigando diversos Cre e CreERT2 transgenes e/ou bater-ins (JAXAxin2CreERT2 018867, e Sox9CreERT2 JAX 018829) em combinação com repórteres fluorescentes, tais como sistemas de arco-íris e mTmG (R26VT2/GK3, R26 mT/mG) 22 , 23. não encontramos nenhuma necessidade de mudar esta metodologia para as estirpes de mouse diferente, como não nos resultados de sobrevivência ou potencial regenerativo foram observadas diferenças.
Além de usar diferentes estirpes animais, realizamos também parcial hepatectomies lobular em neonatais ratos tratados com pequenas moléculas, tais como 4-hidroxi-tamoxifeno e 5-ethynyl-2-desoxiuridina (EdU). Dimetilsulfóxido (DMSO) e etanol foram usados como solventes, como verificou que o óleo de milho era uma importante causa de morbidade. Caso contrário encontramos que a administração intraperitoneal de pequenas moléculas não afetou sobrevivência ou resultados regenerativos. Podemos prever que o presente protocolo será adaptado para uso com outras moléculas pequenas para interrogar os vários aspectos da regeneração.
Cirurgias de rato neonatal podem ser tecnicamente desafiadoras e podem exigir conhecimentos especiais na manipulação de animais e de dissecação microscópica. Experiência de criação de animais é necessária para evitar o canibalismo materno após a cirurgia e durante o período de recuperação imediata.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surrogate mother and surrogate litter (optional)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Serum (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providine-iodine or equivalent antiseptic solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mm straight spring micro scissors</td>
			<td>Vannas</td>
			<td>72932-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5SF Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Kelly forceps</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>17-050G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Sunbeam</td>
			<td>000771-810-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott Labs</td>
			<td>0044-5260-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Anesthesia System</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>1205S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze, 10.16 x 10.16cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-761-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 monocryl sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>MCP489G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;S35839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid, Plain, 110V</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4-000-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-912-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Cost Induction Chamber</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SOMNO-0730</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

partial lobular hepatectomy: a surgical model for morphologic liver regeneration

Regeneração morfológica do órgão após perda de tecido aguda é comum entre vertebrados inferiores, mas é raramente observada em mamíferos vida pós-natal. Regeneração hepática adulta após hepatectomy parcial 70% resulta em hipertrofia do hepatócito com alguns replicação em lóbulos remanescentes com a restauração da atividade metabólica, mas com perda permanente de lóbulo ferido morfologia e arquitetura. Aqui, detalhamos um novo método cirúrgico no recém-nascido que deixa um ambiente fisiológico conducente à regeneração. Este modelo envolve a amputação do ápice do lobo esquerdo e um regime de tratamento conservador subsequentes e não possui a necessidade de ligadura dos vasos sanguíneos do fígado ou lesão química, deixando um ambiente fisiológico onde regeneração pode ocorrer. Estendemos este protocolo para amputações no juvenis ratos (P7-14), durante o qual o fígado lesionado transita de regeneração do órgão para crescimento compensatório por hipertrofia. O protocolo apresentado, breve 30 min fornece uma estrutura para estudar os mecanismos de regeneração, seu declínio idade-associadas em mamíferos e a caracterização dos putativo hepático tronco ou progenitoras.

Figura 1A detalha um cronograma geral da hepatectomy lobular parcial neonatal (esquemática na figura 1B) e a duração prevista do tempo de espera até a regeneração é observada. Regeneração sutil do lobo esquerdo pode ser observada 7-14 dias pós-cirurgia. Regeneração total observou-se muitas vezes após 56 dias pós cirurgia. Os ratos devem não mostra sinais de anormalidade fisiológica após a cirurgia.
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Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Hepatectomy parcial de Lobular: Um modelo cirúrgico para regeneração hepática morfológica

Aqui, apresentamos um novo método para ressecção parcial do lobo esquerdo hepático em camundongos neonatais (dia 0). Este novo protocolo é apropriado para estudar a resposta de lesão no cenário neonatal e lesão hepática aguda.

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

A regeneração renal em Zebrafish Adulto por lesão induzida pela gentamicina

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Biologia do Desenvolvimento

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Derivando Retinal Pigment Epithelium (RPE) de pluripotentes induzidas (iPS) Stem Cells por diferentes tamanhos de corpos embrióides

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Ablação específicas do hepatócito em Zebrafish para estudar a regeneração do fígado-driven biliar

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Avaliação simultânea de Cardiomyocyte DNA Síntese e Ploidia: Um Método de Assistência Quantificação dos cardiomiócitos Regeneração e volume de negócios

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Desenvolvimento de um modelo de fígado fibrótica induzida por etanol no peixe-zebra para estudar Progenitor mediada por células de regeneração de hepatócitos

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Surgical Ablation Ensaio para Estudar Eye Regeneração em Planárias

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Química amputação e regeneração da faringe nos Turbellaria mediterranea Schmidtea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Um modelo de Mouse quimérico fígado humano de hipercolesterolemia familiar usando hepatócitos de derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

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Métodos para o estudo da regeneração em Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

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Um método simplificado e eficiente para isolar os queratinócitos humanos primários do tecido da pele de adultos

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