Name: partial lobular hepatectomy: a surgical model for morphologic liver regeneration
Uploaded: 2018-05-31T13:30:00
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Agradecemos a P. Chu para realizar H & E y la histología; y C. Wang y A. McCarty para discusiones útiles. Investigación fue apoyada con fondos de la Virginia y D. K. Ludwig Fund para investigación del cáncer; el National Heart, Lung and Blood Institute (R01HL058770 y U01HL099999); y el Instituto de California de medicina regenerativa (RC1 00354) subvenciones a I.W. Y.R. fue apoyado por el humano frontera programa carrera desarrollo Premio de Ciencias (CDA00017), la Fundación alemana de investigación (RI 2787/1), el Instituto de células madre de Siebel y la Thomas y Stacey Siebel Foundation (1119368-104-GHBJI). J.M.T. fue apoyado por el NIH (T32GM007365), el Premio Nacional de servicio de investigación (1F30DK108561) y Paul y Daisy Soros Fellowship para nuevos americanos.

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las directrices establecidas por la Asociación para la evaluación y acreditación de laboratorio Animal Care Internacional (AAALAC) y la Universidad de Stanford Panel administrativo en Animal de laboratorio Cuidado (APLAC), (número de protocolo #10266) y en los Estados Unidos, o el Acta de Bienestar Animal Europea, Directiva 2010/63/UE. El protocolo fue aprobado por la Comisión de ética de los experimentos del Animal del gobierno de B...

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Lesión hepática aguda tradicionalmente se ha estudiado usando químico (acetaminofen, etanol, tetracloruro de carbono), o modelos quirúrgicos (hepatectomía parcial del 70%). La respuesta regenerativa después de hepatectomy parcial 70% se ha caracterizado para implicar hipertrofia de hepatocitos global y múltiples rondas de división celular4,5. Para detener la hemorragia, sin embargo, este modelo es limitado, como los vasos principales se deben ligarse deja...

La capacidad de regenerar un órgano, o para restaurar la forma y función, se ha pensado sobre todo se pierden en el tiempo evolutivo. Se ha encontrado el potencial regenerativo del hígado mamífero adultos después de lesión aguda del químico o físico que implica la movilización de todos los hepatocitos restantes dando lugar a olas de hipertrofia y rondas de división celular, resultando en un funcional pero órgano arquitectónicamente diferentes1,2,3,4,5. Recientemente, estudios han empezado a caracterizar la respuesta regenerativa de órganos mamíferos neonatales lesiones dentro de la primera semana de vida6,7,8. Estos estudios han demostrado que cuando se lesionó durante el desarrollo neonatal, ciertos órganos mamíferos responden con regeneración morfológica en vez de compensatoria crecimiento o fibrosis7,8.
Estudios recientes han demostrado que la regeneración de la estructura global y la función se produce durante el temprano período neonatal6,7,8. Lesión hepática establecido protocolos involucran daño químico o la administración de etanol9,10,11, acetaminophen12,13,14,15 , tetracloruro de carbono16,17,18,19, 70% hepatectomía parcial4,20,21o retirada de la izquierda y lóbulos medianos. Administración química conduce a la muerte celular de hepatocitos, pero a menudo deja intactas las estructuras micro y macro. Regeneración morfológica no puede estudiarse fácilmente en este contexto, como la arquitectura en general hepática no fue borrada. La hepatectomía parcial 70% consiste en la ligadura de sutura de los vasos principales, que es necesaria para detener el sangrado, pero deja un ambiente no-fisiológica con la interrupción permanente de la vasculatura. Además, este método ha sido utilizado sólo en roedores adultos y su aplicación a los recién nacidos es técnicamente muy difícil. Con esto en mente, hemos desarrollado un método en el que 20-30% del ápice del lóbulo izquierdo se quita en un ratón recién nacido de P0 (figura 1A-1B). Este método es quirúrgico conservador, mínimamente invasivo, no técnicamente difícil y conduce a pérdida de la morfología sin la ligadura de vasos, dejando espacio para que se produzca la regeneración. El resultante protocolo paso a paso, que se describe a continuación, permite para que cualquier investigador realizar una hepatectomía parcial lobulada en ratones neonatales para estudiar mamífera regeneración neonatal en las primeras etapas de la vida post-natal. Este método también tiene claras aplicaciones a los estudios comparativos en medicina regenerativa y biología de células madre, ya que puede ser utilizado en el hígado durante fases más posteriores de la vida.
Los estudios más comunes de lesión del higado aguda son daños inducida químicamente, amputación de hígado adulto o hepatectomía parcial 70%. Daño químico a menudo implica la administración intravenosa, intraperitoneal u oral de paracetamol, tetracloruro de carbono y etanol y es un modelo relativamente fácil y no invasivo de la lesión. Como anteriormente analizados, resultados de daños químicos en la muerte celular de hepatocitos, pero a menudo hojas de estroma y parénquima estructuras intactas, lo que es difícil hacer afirmaciones sobre regeneración morfológica. Daños químicos a menudo se centra en los vasos hepáticos, lo que es una técnica útil para estudiar el sitio y lesión de la célula-específica, pero también hace que sea difícil de interrogar, en el nivel de órgano entero, otras poblaciones que puede estar situado más lejos de los vasos y que puede contribuir a la regeneración. A pesar de estas limitaciones, daño químico sigue siendo un modelo útil y altamente fisiológicamente relevantes de la lesión.
Adultos 70% hepatectomía parcial consiste en la extirpación de los lóbulos izquierdos y mediales después de la ligadura de la vasculatura hepática. La respuesta a la hepatectomía ha sido bien caracterizada: el hígado amputado 14 días post 70% hepatectomía parcial desarrolla una arquitectura muy diferente de la del lóbulo intacto original, como los hepatocitos de los restantes lóbulos derecho y caudados sufren hipertrofia y unas cuantas rondas de división celular4,5. Esto hace masa perdida y la función, pero es incapaz de regenerar los dos lóbulos amputados y por lo tanto no reemplaza la morfología gruesa. Como resultado, la respuesta de la lesión a hepatectomía parcial 70% es útil para estudiar mecanismos de crecimiento compensatorio con la regeneración limitada.
Aquí, describimos completamente un protocolo para una neonatal hepatectomía parcial de lobulado. El procedimiento implica la selección adecuada del animal y preparación, preparación del campo quirúrgico, cirugía y recuperación. Optimización y adaptación de cada uno de estos pasos pueden requerir para diferentes aplicaciones del protocolo.
Hemos realizado extensivamente y este protocolo en cachorros de C57BL/6J de tipo salvaje (JAX 000664), sin embargo, para el estudio de diferentes poblaciones celulares y los mecanismos de regeneración, también utilizamos varios animales transgénicos incluyendo ratones albergar varios Cre y CreERT2 transgenes o knock-ins (JAXAxin2CreERT2 018867, y Sox9CreERT2 JAX 018829) en combinación con los reporteros fluorescentes, tales como los sistemas de arco iris y mTmG (R26VT2/GK3, R26 mT/mG) 22 , 23. hemos encontrado necesario cambiar esta metodología para las cepas de ratón diferente, como se observó ninguna diferencia en los resultados de supervivencia o potencial regenerativo.
Además del uso de diferentes cepas animales, también realizamos hepatectomías parciales de lobulado en ratones neonatales tratados con moléculas pequeñas, como la 4-hidroxi-tamoxifeno y 5-ethynyl-2 '-desoxiuridina (EdU). Dimetil sulfóxido (DMSO) y el etanol fueron utilizados como disolventes, como se encontró que el aceite de maíz fue una causa importante de morbilidad. De lo contrario nos encontramos con que la administración intraperitoneal de pequeñas moléculas no afectó la supervivencia o los resultados de regeneración. Predecimos que este Protocolo será adaptado para su uso con otras moléculas pequeñas a interrogar a diversos aspectos de la regeneración.
Cirugías de ratón neonatal pueden ser técnicamente difíciles y pueden requerir especiales conocimientos en manejo de animales y la disección microscópica. Experiencia de cría de animales es necesaria para evitar canibalismo maternal después de la cirugía y durante el período de recuperación inmediata.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surrogate mother and surrogate litter (optional)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Serum (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providine-iodine or equivalent antiseptic solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mm straight spring micro scissors</td>
			<td>Vannas</td>
			<td>72932-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5SF Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Kelly forceps</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>17-050G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Sunbeam</td>
			<td>000771-810-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott Labs</td>
			<td>0044-5260-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Anesthesia System</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>1205S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze, 10.16 x 10.16cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-761-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 monocryl sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>MCP489G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;S35839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid, Plain, 110V</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4-000-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-912-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Cost Induction Chamber</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SOMNO-0730</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

partial lobular hepatectomy: a surgical model for morphologic liver regeneration

Regeneración de órganos morfológicos después de una pérdida aguda de tejido es común entre los vertebrados inferiores, pero se observa raramente en vida postnatal mamífera. Adultos regeneración hepática después de hepatectomy parcial 70% resulta en hipertrofia de hepatocitos con algunos replicación en lóbulos restantes con la restauración de la actividad metabólica, pero con pérdida permanente de la morfología del lóbulo lesionado y la arquitectura. Aquí detallamos un nuevo método quirúrgico en el recién nacido que sale de un ambiente fisiológico propicias a la regeneración. Este modelo implica la amputación del ápice del lóbulo izquierdo y un régimen de tratamiento conservador posterior y carece de la necesidad de ligadura de grandes vasos sanguíneos hígados o lesión química, dejando un ambiente fisiológico donde puede ocurrir la regeneración. Extendemos este protocolo amputaciones en juveniles ratones (P7-14), durante el cual el hígado lesionado transiciones de regeneración del órgano al crecimiento compensatorio por hipertrofia. El protocolo presentado, breve 30 minutos proporciona un marco para estudiar los mecanismos de regeneración, su declive asociado a la edad en mamíferos y la caracterización de la supuesta madre hepática o progenitores.

Figura 1A detalla una cronología general de la hepatectomía lobulado parcial neonatal (esquemática en la figura 1B) y la duración prevista de tiempo de espera hasta que se observa regeneración. Regeneración sutil del lóbulo izquierdo puede ser observado entre 7 y 14 días post cirugía. Regeneración completa se observa a menudo después de 56 días post cirugía. Ratones no deben mostrar ningún signo de anormalidades fis...

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Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Hepatectomía parcial lobulado: Un modelo quirúrgico para regeneración hepática morfológico

Aquí, presentamos un nuevo método para la resección parcial del lóbulo izquierdo hepático en ratones neonatales (día 0). Este nuevo protocolo es adecuado para el estudio de la lesión del higado aguda y la respuesta de lesiones en el ámbito neonatal.

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

La regeneración renal en adultos de pez cebra por gentamicina lesión inducida

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Derivadas del epitelio pigmentario de la retina (EPR) de madre pluripotentes inducidas (iPS) células de diferentes tamaños de cuerpos embrionarios

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Ablación específico de hepatocitos en pez cebra para estudiar biliar impulsada regeneración hepática

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

La evaluación simultánea de los cardiomiocitos de síntesis de ADN y la ploidía: Un Método de Ayuda a la cuantificación de los cardiomiocitos Regeneración y Facturación

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Desarrollo de un Modelo de hígado fibrótico inducida por etanol en el pez cebra para el Estudio de células progenitoras mediada por la regeneración de hepatocitos

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

La ablación quirúrgica de ensayo para estudio de la regeneración de los ojos en planarias

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Química la amputación y la regeneración de la faringe en el Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Un modelo de ratón quimérico hígado humano de hipercolesterolemia familiar con hepatocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Métodos para el estudio de la regeneración en Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Un método simplificado y eficiente para aislar Keratinocytes humanos primarios de tejido adulto de la piel

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...