Name: adapting 3' rapid amplification of cdna ends to map transcripts in cancer
Uploaded: 2018-03-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer at JoVE.com

ברצוננו להודות Bettine גיבס עזרה טכנית.

ללבוש חלוק מעבדה, כפפות בטיחות משקפיים בכל עת בזמן ביצוע כל ההליכים ב פרוטוקול זה. ודא כי מכולות/צינורות המכיל הכימית isothiocyanate פנול ו guanidine נפתחים רק מוסמך הוד, ולאחר השלך פסולת פנול במיכל ייעודי. השתמש DNAse/RNAse ללא צינורות סטרילי, טיפים, ריאגנטים.
1. תרבית תאים
<ol><li>לגדול הלה תא ?...

<ol>
	<li>Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+factors+in+pre-mRNA+3'-end+processing.">Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing.</a> Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).</li><li>Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'+end+mRNA+processing:+Molecular+mechanisms+and+implications+for+health+and+disease.">3' end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease.</a> EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).</li><li>Derti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+atlas+of+polyadenylation+in+five+mammals.">A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals.</a> Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+amplification+of+3&#8242;+cDNA+ends+(3&#8242;-RACE).">Rapid amplification of 3&#8242; cDNA ends (3&#8242;-RACE).</a> Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).</li><li>Masamha, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFIm25+regulates+glutaminase+alternative+terminal+exon+definition+to+modulate+miR-23+function.">CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function.</a> RNA. 22 (6), 830-838 (2016).</li><li>Rodu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Biology+in+Medicine:+The+polymerase+chain+reaction:+the+revolution+within.">Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within.</a> Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).</li><li>Bertioli, D., White, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+amplification+of+cDNA+ends.">Rapid amplification of cDNA ends.</a> PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. 67, 233-238 (1997).</li><li>Freeman, L. A., Freeman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+full-length+transcripts+and+transcript+variants+using+5'+and+3'+RACE.">Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5' and 3' RACE.</a> Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1027, 3-17 (2013).</li><li>Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+characterization+of+a+novel+CCND1/MRCK+gene+fusion+in+mantle+cell+lymphoma.">Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma.</a> J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).</li><li>Parker, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumorigenic+FGFR3-TACC3+gene+fusion+escapes+miR-99a+regulation+in+glioblastoma.">The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma.</a> J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).</li><li>Prakash, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+conjoined+genes:+Another+mechanism+for+gene+regulation+in+eukaryotes.">Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes.</a> PLOS ONE. 5 (10), e13284 (2010).</li><li>Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+complexity+of+gene+fusions+in+cancer.">The emerging complexity of gene fusions in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).</li><li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+biological+roles+of+alternative+3'UTRs.">Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs.</a> Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).</li><li>International Committee For Standardization In, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+evaluation+of+automated+blood+cell+counters.">Protocol for evaluation of automated blood cell counters.</a> Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).</li><li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids.">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> J Vis Exp. (45), e2565 (2010).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+Basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. (63), e3998 (2012).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923 (2012).</li><li>Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+primer+specific+filter+metrics+for+the+assessment+of+mitochondrial+DNA+sequence+data.">Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data.</a> Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).</li><li>Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+better+probes:+Effect+of+probe+size,+mismatch+position+and+number+on+hybridization+in+DNA+oligonucleotide+microarrays.">Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays.</a> J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).</li><li>Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleotide+polymorphisms+and+other+mismatches+reduce+performance+of+quantitative+PCR+assays.">Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays.</a> Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).</li><li>Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hairpin+structure+on+PCR+amplification+efficiency.">The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency.</a> Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).</li><li>Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-template+polymerase+chain+reaction.">Multi-template polymerase chain reaction.</a> Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).</li><li>Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+kinase+fusions+in+cancer.">The landscape of kinase fusions in cancer.</a> Nat Commun. 5, 4846 (2014).</li></ol>

למרות הופעתו של טכנולוגיות רצף מקביל מסיבית, על בסיס ג'ין-מאת-גן, 3' המירוץ נשאר עדיין השיטה הקלה ביותר וחסכוני ביותר לזהות את PAS נוקלאוטידים סמוכים ועד הזנב poly(A). הסתגלות שתוארו כאן מרחיב באמצעות 3' גזע כדי להגביר והן מפת רצפים הכוללים חלק של ORF על stop codon, את כולה 3' UTR של תמליל mRNA ANKHD1 . היתרו?...

היווצרות של הקצה 3' הוא שלב קריטי ב- mRNA ההבשלה שכוללת את המחשוף של pre-mRNA במורד הזרם של פאס ואחריו התוספת של ~ 250 untemplated adenines, אשר מרכיבים את הזנב poly(A)1,2. החלבון איגוד poly(A) (PABP) נקשר הזנב poly(A), זה מגן על התעתיק mRNA מפני השפלה, ומקלה על תרגום1.
הערכות הנוכחי מראים כי 70% של גנים אנושיים יש מסירה מרובים, ובכך עוברים פוליאדנילציה חלופיים, וכתוצאה מכך מספר 3' קצוות3. לכן, חשוב לזהות איפה הזנב poly(A) מייחסת שארית 3' UTR, כמו גם לזהות את PAS בשימוש על ידי כל תעתיק נתון. כניסתו של הדור הבא רצפי הביא זיהוי בו זמנית של 3' UTRs ואת המעבר של אלפי גנים. עלייה זו יכולת רצף דרש הפיתוח של bioinformatic אלגוריתמים לניתוח נתונים מעורבים פוליאדנילציה חלופית של הסוף 3'. עבור זיהוי דה נובו או אימות של מלון פאס, ומכאן מיפוי של 3' סוף גנים יחידניים מנתונים רצף בקנה מידה גדול, 3' המירוץ נשאר לשיטת הבחירה4,5. רצפי הכלולים במוצרי cDNA של 3' המירוץ בדרך כלל כוללים רק חלק מתוכן 3' UTR המכיל את הזנב poly(A), האתר המחשוף, מלון פאס, רצפי במעלה הזרם PAS. בניגוד PCR, הדורש שימוש של גן מסוים ואחורה תחל ועיצוב, 3' המירוץ רק דורש שני גנים ספציפיים מקוננים קדימה תחל. לפיכך, PCR דורש ידע מפורט יותר של הרצף נוקלאוטיד של אזור גדול של הגן להיות מוגבר4,6. מאז 3' המירוץ משתמשת אותו הפוך פריימר כי מטרות poly(A) זנב עבור כל התרשימים polyadenylated RNA, רק תחל קדימה צריך להיות גנים ספציפיים, לפיכך, רק הדורשים ידע של אזור הקטנה משמעותית mRNA. פעולה זו מאפשרת ההגברה של אזורים רצפים של מי אינם במלואו מאופיין4,7. זו אפשרה 3' גזע כדי לשמש לא רק כדי לקבוע את הקצה 3' של הגן, אבל גם לקבוע לאפיין אזורים גדולים במעלה הזרם של מלון פאס המהווים חלק ניכר 3' UTR. על ידי שילוב 5' המירוץ עם ששונה 3' המירוץ הכולל חלקים גדולים יותר 3' UTR ואזורים איגוף, זה אפשרי לחלוטין רצף או לשכפל התעתיק mRNA כולו מקצה 5' שלה 3' סוף8.
דוגמה של יישום זה של ששונה 3' המירוץ הוא זיהוי האחרונות רומן CCND1-MRCK פיוז'ן ג'ין תעתיק של שורות תאים לימפומה המעטפת התא, חולי סרטן. 3' UTR כללה רצף של גנים הן CCND1 והן MRCK , היה הסרבן miRNA תקנה9. שני מקוננים CCND1 ספציפי לפנים תחל היו משלימים באזור הסמוך מיידי של הזרם של codon להפסיק CCND1 . למרות transcriptome כל רצף יחד עם כלים bioinformatic ספציפי יכול לשמש כדי לזהות גנים fusions בתוך 3' UTR10, מעבדות רבות ייתכן שיחסרו את המשאבים הכספיים או מומחיות bioinformatic לעשות שימוש בטכנולוגיה זו. ומכאן, 3' המירוץ הוא חלופה עבור דה נובו זיהוי ואימות של פיוז'ן הרומן גנים מעורבים של 3' UTR. בהתחשב בכך דרסטי להגדיל את מספר גנים פיוז'ן שדווחה וכן לקרוא דרך תעתיקים, 3' המירוץ הפך להיות כלי רב עוצמה באפיון ג'ין-רצפים-11,-12. בנוסף, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו שכי רצפים שונים בטווח 3' UTR, כמו גם את אורך 3' UTR יכול להשפיע mRNA התעתיק יציבות, לוקליזציה, translatability, הפונקציה13. בחלקו בשל עניין מוגבר במיפוי של transcriptome, חלה עלייה במספר polymerases דנ א שונים שפותחו לשימוש במעבדה. חשוב לקבוע מה סוגי שינויים יכולים להתבצע 3' פרוטוקול המירוץ ב כדי לנצל את הרפרטואר הזמינים של דנ א polymerases.
עבודה זו דוחות התאמה 3' גזע כדי למפות את כל 3' UTR, מלון פאס, ואתר 3' סוף המחשוף של התעתיק ANKHD1 באמצעות מקונן תחל בתוך המקטע ANKHD1 של התעתיק, שני polymerases דנ א שונים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td>Cervical cancer cell line.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jeko-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3006</td>
			<td>Mantle cell lymphoma cell line.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granta-519 cells</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC-342</td>
			<td>Mantle cell lymphoma cell line.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F6178</td>
			<td>Fetal bovine serum for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisherScientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotic and antimycotic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9545</td>
			<td>Coprecipitant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisherScientific</td>
			<td>10569044</td>
			<td>Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free-Water</td>
			<td>ThermoFisherScientific</td>
			<td>AM9938</td>
			<td>Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030</td>
			<td>1X PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma&#160; Aldrich</td>
			<td>C7559-5VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Alcohol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>793175</td>
			<td>Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>ThermoFisherScientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X Extender PCR-to-Gel Master Mix</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>N867</td>
			<td>2X PCR-to-Gel Master Mix&#160; containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mM dNTP</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>N557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 RNase-Free DNase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td>Dnase treatment kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Loading Dye Orange (6X)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7022S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer</td>
			<td>ThermoFisherScientific</td>
			<td>F531S</td>
			<td>2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>600670</td>
			<td>Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>K1691</td>
			<td>Used for&#160; reverse transcription of mRNA into&#160; cDNA synthesis. Kit includes&#160; Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pefect size 1Kb ladder</td>
			<td>5 Prime</td>
			<td>2500360</td>
			<td>Molecular weight DNA ladder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III</td>
			<td>Alpha Innotech</td>
			<td></td>
			<td>Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Molecular Weight Ladder</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N3233L</td>
			<td>Molecular weight DNA ladder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>VM-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Centrifuge</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>C1008-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Bath</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>DB-D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000C</td>
			<td>ThermoFisherScientific</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td>Spectrophotometer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide Mini-Sub&#160;Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704469</td>
			<td>Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645050</td>
			<td>Power supply for gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>AGLE-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler Gradient</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950000015</td>
			<td>PCR thermocycler.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot&#160; TOP10 Chemically Competent E. coli cells</td>
			<td>ThermoFisherScientific</td>
			<td>K280020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyPCR Preparation Station Mystaire</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>MY-PCR24</td>
			<td>Hood dedicated to PCR work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton SafeAire II fume hood</td>
			<td>ThermoFisherScientific</td>
			<td></td>
			<td>Fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Z1&#160;Particle&#160;Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605698</td>
			<td>Particle counter. For counting cells before plating&#160; for RNA extraction.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0</td>
			<td>Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)</td>
			<td></td>
			<td>Software to analyze Sanger sequencing data.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adapting 3' rapid amplification of cdna ends to map transcripts in cancer

ההבשלה של mRNAs האיקריוטים כרוך 3' הקצה למערך, הכוללת התוספת של זנב poly(A). על מנת למפות את קצה 3' של גנים, השיטה המסורתית להתמקד יש 3' הגברה מהירה קצות cDNA (3' גזע). פרוטוקולים עבור 3' המירוץ דורשים תכנון זהיר ומבחר תחל מקוננים בתוך 3' האזור לא מתורגם (3' UTR) של הגן היעד עניין. עם זאת, עם מספר שינויים בפרוטוקול יכול לשמש כדי לכלול את כל 3' UTR רצפים בתוך מסגרת קריאה פתוחה (ORF), מתן תמונה מקיפה יותר של הקשר בין של ORF את 3' UTR. זאת, בנוסף זיהוי של הסימן פוליאדנילציה (PAS), כמו גם המחשוף ואתר פוליאדנילציה שסופקו על-ידי קונבנציונלי 3' המירוץ. המורחב 3' גזע יכולים לזהות יוצא דופן 3' UTRs, כולל גנים fusions בטווח 3' UTR, ואת המידע רצף יכול לשמש כדי לחזות אתרי קישור miRNA פוטנציאליים, כמו גם AU עשיר יציב אלמנטים שעשויים להשפיע על היציבות של התעתיק.

חיפוש מקוננים פריימר לפנים:
הג'ל agarose מ איור 1 מציג שני ברורים PCR ג'ל מוצרים (מסלולים 1 ו- 2) אשר השתמש אותו קדימה פריימר אלא תחל הפוכה שונים. 3 ליין יש מוצר ה-PCR ברורים ויש פריימר ואחורה ברורים. צבעי בסיס אידיאלי לשימוש עב...

Watch this Scientific Journal Video about Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer at JoVE.com

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

התאמת 3' הגברה מהירה של CDNA מסתיים למפות תעתיקים של סרטן

שני שונים 3' מהירה הגברה של הקצוות cDNA (3' מירוץ) פרוטוקולים שתואר כאן הופכים את השימוש של שני polymerases דנ א שונים כדי למפות רצפים הכוללים קטע של מסגרת קריאה פתוחה (ORF) על stop codon, את כולה 3' UTR של תעתיק באמצעות ה-RNA להשיג שורות תאים סרטן שונים.

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

The overall goal of this procedure is to determine the sequences of mRNA transcripts from the three-prime end to regions within the protein coding region by using transcript-specific nested primers in two subsequent PCRs and sequencing the purified PCR products. This method can help answer key questions in the genetic field, such as determining the polyadenylation signal, the stop codon, and the sequence of the three-prime untranslated region of the transcript. The main advantage of this technique is that it can be applied to any transcript if the sequence of the small region of the open reading frame is The implication of this technique extend toward cancer diagnosis, because it can detect tumor specific fusion genes and splice variants.We first had the idea for this method when we identified novel transcripts with previously uncharacterized, three-primed untranslated regions. To begin the protocol, thaw the phenol and guanidine isothiocyanate cell mixture on ice. Once thawed, add 100 microliters of chloroform to the microcentrifuge tube in a PCR hood.Vortex the sample for 10 to 15 seconds until the mixture is pink and opaque. Next, incubate the sample on ice for 15 minutes. After incubation, centrifuge the sample for 15 minutes at 20, 800 g and four degrees Celsius.Carefully remove the upper colorless aqueous phase and transfer it to a new 1.5 milliliter microcentrifuge tube. Then, move on to precipitation and add an equal volume of isopropanol to the sample. Add one microliter of co-precipitant to the sample to act as a carrier for the RNA and to help visualize the RNA in subsequent steps.Incubate the samples at 80 degrees Celsius for at least four hours. After incubation, transfer the sample to a cooled centrifuge and spin for 35 minutes at 20, 800 g and four degrees Celsius. After the spin, the RNA will appear as a blue spec on the bottom of the tube.Carefully remove the isopropanol from the sample. Add 500 microliters of 80%ethanol and resuspend the pellet by briefly vortexing for three seconds. Centrifuge the sample again.Remove all the ethanol from the sample and let the sample air dry for about 10 minutes. Once the sample is dry, resuspend it in 35 microliters of RNase-free water. Then, place the sample on a heat block.Set at 65 degrees Celsius for five minutes to ensure that the RNA is fully in solution. After heating, immediately place the tube on ice. For a final reaction volume of 50 microliters, add four micrograms of total RNA with added water to a total volume of 22 microliters to a new tube.Add two microliters of the Oligo dT 25 primer from the 10 micromolar primer solution. From the reverse transcription kit, add two microliters of the RNase inhibitor, eight microliters of the 5x reaction buffer, four microliters of 10 millimolar dNTPs, and two microliters of the reverse transcriptase. Set up a reaction without reverse transcriptase to act as a negative control.Incubate the tube at 42 degrees Celsius for one hour. After incubation, transfer the tube directly to ice before transporting it to the heating block. Then, heat the tube at 75 degrees Celsius for five minutes.After heating it 75 degrees Celsius, place the tube on ice. Transfer two microliters of the cDNA to a fresh 0.5 milliliter PCR tube. Add one microliter of the forward primer and one microliter of the reverse primer from a 10 millimolar primer solution.Make up to 12.5 microliters by adding 8.5 microliters of nuclease-free water and add 12.5 microliters of the 2x PCR to gel master mix. Then, enter the PCR thermal cycling conditions listed on the screen and run the PCR. After the PCR, prepare a 1%agarose gel stained with ethidium bromide.Dissolve one gram of agarose in 100 milliliters of triacetate or TAE buffer in a 250 milliliter flask. Boil the contents in a microwave. Allow the gel to cool for one minute, and add 7.5 microliters of ethidium bromide solution in a fume hood.Mix well by swirling the flask. Pour the contents into a horizontal gel apparatus and allow the gel to solidify at room temperature in the fume hood for at least 30 minutes. Cover the gel with 1x TAE buffer and load 10 microliters of the PCR product onto the agarose gel together with three to five microliters of the DNA molecular weight ladder.Run the gel at 175 volts for 10 minutes. For the first PCR, transfer one microliter of cDNA to a PCR tube and add five microliters of 10x Pfu reaction buffer. Add one microliter of the first nested forward primer, one microliter of the T7 Oligo dT 25 primer, and one microliter of dNTPs from a 10 millimolar solution.Make up to 49 microliters of total volume by adding 40 microliters of water. Add one microliter of Pfu DNA polymerase and mix well. Then, run the PCR.Next, prepare the second PCR. Transfer two microliters of the products from the first PCR to a new PCR tube and mix it with five microliters of 10x Pfu ultra two reaction buffer. Add one microliter of the second nested PCR primer, one microliter of the T7 primer and one microliter of dNTPs.Make up to 49 microliters total reaction volume by adding 39 microliters of water and add one microliter of Pfu DNA polymerase. Run the PCR using the same PCR profile as the first PCR set up. Alternatively, instead of using Pfu DNA polymerase, a chimeric DNA polymerase can be used in the two different PCRs.Take five to ten microliters of the second PCR product and run it on an agarose gel. Finally, visualize the result on an imager. This agarose gel shows two distinct PCR products which use the same forward primer but different reverse primers and a distinct PCR product that has a distinct forward and reverse primer.The ideal primers to use for the PCR based reaction are those that give one distinct PCR product. Products from the second PCR reaction with Pfu DNA polymerase and chimeric DNA polymerase produced the same sized PCR products despite having different PCR cycling conditions for the three-prime RACE. The reverse transcriptase negative controls showed no genomic contamination of the RNA used in cDNA synthesis as well as in subsequent downstream reactions.Gel-purified PCR products were sent for sequencing. A representative Sanger sequence from a sequence chromatogram identified the location of the stop codon, putative polyadenylation signal and the site as well as the poly A tail in the three-prime RACE product. While attempting this procedure, it's important to remember to wear protective gear and gloves at all time.In addition, use sterile DNase and RNase for your reagents tubes and other disposables. Don't forget that working with phenol and chloroform can be extremely hazardous. And precautions such as using the reagents in a hood and disposing material in a designated waste container should always be taken while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

מיזוג במונחים מוחלטים ובאופן יחסי PCR כמותי נתונים לכמת STAT3 אחוי Variant תעתיקים

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR בתיווך ארגון מחדש של הכרומטין לולאה

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

A Murine Cell Line Based Model of Chronic CDK9 Inhibition to Study Widespread Non-Genetic Transcriptional Elongation Defects (TEdeff) in Cancers

A Murine Cell Line Based Model of Chronic CDK9 Inhibition to Study Widespread Non-Genetic Transcriptional Elongation Defects TEdeff in Cancers

קו תא מורנין מבוסס מודל של עיכוב כרונית CDK9 למחקר נרחב שאינם גנטיים התארכות מומים ליקויים (TEבהחלט) סרטן

We have previously reported that a subset of cancers is defined by global transcriptional deregulations with widespread deficiencies in mRNA transcription ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

דיסקציה ומיפוי של התעתיקים הראשוניים והמעובדים בתירס מיטוכונטריון שימוש באסטרטגיה מעגלית-PCR המבוססת על מעגלי

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

חקירת התפקיד הטרנססאני של משתיק הRUNX1 נית על ידי CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein בתאי לוקמיה מיאלואיד חריפה

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

זיהוי של וירוס הכשל החיסוני האנושי 1 (HIV-1) Antisense חלבון (ASP) תעתיקים בחולים על ידי סטרנד ספציפי-PCR

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

יעיל טראנסקריפט מבוקרת פלמיד ביטוי מערכת לחקירת היציבות של התעתיקים mRNA בתוך הראשי מכתשי אפיתל תאים

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

בדיקת זרע לבידוד מהיר של עריכות נבט בדגי זברה

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...