Name: characterization of immune cells in human adipose tissue by using flow cytometry
Uploaded: 2018-03-06T15:00:00
Duration: 7 min 32 s
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हम जे वान डी गार और एम Vroomen (Maastricht विश्वविद्यालय, नीदरलैंड) उनके तकनीकी समर्थन के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इसके अलावा, हम रक्त और ऊतक बायोप्सी इस प्रोटोकॉल और बाद के प्रयोगों की स्थापना के लिए इस्तेमाल किया प्रदान करने के लिए K Verboven, डी Hansen, जे Jocken, और ई. Blaak शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

आंत और चमड़े के नीचे के नमूनों में मेडिकल एथिकल कमेटी रखती अस्पताल, Hasselt, और Hasselt विश्वविद्यालय, बेल्जियम, हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार द्वारा अनुमोदित अध्ययन में नामांकित विषयों से लिया गया ।
1. रिएजेंट्स की तैयारी
<ol><li>Collagenase समाधान<ol>
<li>Collagenase के 1 जी भंग मैं फास्फेट के 10 मिलीलीटर में खारा (पंजाब, कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना) एक 100 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान बनाने के लिए । 200 µ l aliquots और स्टोर पर-20 ° c तैयार करें ।</li>
		<li>पंजाब के 10 मिलीलीटर में Collagenase इलेवन के 1 जी भंग एक 100 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान बनाने के लिए । 200 µ l aliquots और स्टोर पर-20 ° c तैयार करें ।</li>
		<li>भंग 10 पंजाब के 10 मिलीलीटर में DNase मैं की मिलीग्राम एक 10 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान बनाने के लिए । तैयार 180 µ एल aliquots और स्टोर-20 डिग्री सेल्सियस पर ।</li>
		<li>जोड़ें 100 µ एल Collagenase मैं (100 मिलीग्राम/एमएल), 100 µ एल Collagenase ग्यारहवीं (100 मिलीग्राम/एमएल), और 90 µ एल DNase मैं (10 मिलीग्राम/एमएल) DMEM हैम के F12 के 10 मिलीलीटर । प्रत्येक अलगाव के लिए ताजा collagenase समाधान बनाओ ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>एरिथ्रोसाइट lysis बफर<ol>
<li>ultrapure पानी के 100 मिलीलीटर में ०.८४ जी एनएच4सीएल भंग ।</li>
		<li>उपयोग करने से पहले पीएच 7.4 पर सेट करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर एक गिलास कुप्पी में स्टोर ।</li>
		<li>उपयोग करने से पहले बर्फ पर एरिथ्रोसाइट lysis बफर रखें ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>FACS बफर<ol>
<li>पंजाब के 100 मिलीलीटर में 0.5 ग्राम गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) को भंग कर 0.5% BSA पंजाबियों को प्राप्त करने के लिए ।</li>
		<li>भंग 65 को 100 एमएल में3 मिलीग्राम 0.5% BSA पंजाब के 10 mM नण3 0.5% BSA पंजाब प्राप्त करने के लिए । एक गिलास कुप्पी में 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान ।</li>
		<li>उपयोग करने से पहले बर्फ पर FACS बफर रखें । सावधानी: नण य3 अत्यधिक विषाक्त है । एक धुएं डाकू में काम करते है और सुरक्षा के लिए चश्मा और दस्ताने पहनते हैं, जबकि संभाल3नण ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>ह्यूमन आईजीजी ब्लॉक<ol>
<li>भंग 10 मिलीलीटर पंजाब में मानव आईजीजी के १० मिलीग्राम 1 मिलीग्राम/एमएल प्राप्त करने के लिए । 100 µ l aliquots और स्टोर पर-20 ° c तैयार करें ।</li>
		<li>उपयोग करने से पहले बर्फ पर मानव आईजीजी ब्लॉक रखें ।</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. पर से SVF का अलगाव
<ol><li>छोटे टुकड़ों में बायोप्सी में से 1 जी कट (2 मिमी2) एक स्केलपेल के साथ और एक 50 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण (उदा, फाल्कन ट्यूब) । प्रत्येक नमूना में collagenase समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें । नोट: पूरी तरह से ट्यूब के ढक्कन बंद और ढक्कन बारी ¼ वापस बारी.</li>
	<li>एक जल-स्नान में 37 ° c में 60 मिनट के लिए मशीन कोमल मिलाते हुए (60 चक्र/</li>
	<li>एक 200 µ मीटर फिल्टर के साथ परिणामी निलंबन फ़िल्टर और एक नया 50 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में नमूना इकट्ठा । फ़िल्टर कुल्ला और सभी कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए फिल्टर के शीर्ष पर 7 मिलीलीटर पंजाबियों जोड़ें ।</li>
	<li>4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 280 x g पर नमूना केंद्रापसारक ।</li>
	<li>pipetting द्वारा फ़्लोटिंग adipocyte अंश निकालें । सेल गोली SVF है । नोट: SVF प्राप्त करने के लिए adipocyte अंश को निकालें । नमूने में संपूर्ण टिप को उपविलयन से बचें क्योंकि इससे केवल पंजाबियों को ही नहीं बल्कि फ्लोटिंग adipocytes भी दूर होगी ।</li>
	<li>collagenase को हटाने के लिए पंजाब के 5 एमएल में SVF को फिर से सस्पेंड, एक 70 µ मीटर फिल्टर के साथ निलंबन फिल्टर, 5 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ फिल्टर कुल्ला, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 280 x g पर नमूना केंद्रापसारक ।</li>
	<li>supernatant निकालें और एरिथ्रोसाइट lysis बफर के 3 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड ।</li>
	<li>बर्फ पर 5 मिनट के लिए मशीन । मशीन के बाद पंजाब के 7 मिलीलीटर जोड़ें ।</li>
	<li>4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 280 x g पर नमूना केंद्रापसारक ।</li>
</ol>3. प्रवाह Cytometry विश्लेषण के लिए SVF के दाग
<ol><li>90 µ l 4 ° c FACS बफर में सेल गोली को भंग और 1 मिलीग्राम/एमएल मानव आईजीजी ब्लॉक के 10 µ एल जोड़ें । सेल सस्पेंशन को 96 वी-शेप वेल प्लेट के 2 कुओं में बांट लें । बर्फ पर प्लेट रखें और 15 मिनट के लिए मानव आईजीजी ब्लॉक मशीन चलो ।</li>
	<li>100 µ एल FACS बफर प्रत्येक नमूने को धोने और 4 डिग्री सेल्सियस पर 280 x g के साथ 5 मिनट के लिए थाली केंद्रापसारक जोड़ें । थाली दोहन के बिना प्लेट उल्टा एक चिकनी आंदोलन में नीचे tipping द्वारा supernatant निकालें । नोट: प्लेट को उल्टा रखते हुए एक ऊतक के ऊपर से किसी भी बचे हुए लिक्विड को हटाने के लिए सुनिश्चित करें ।</li>
	<li>मैक्रोफेज और डीसी सबसेट के लिए एंटीबॉडी कॉकटेल तैयार (FACS पैनल 1) और टी के लिए और बी-सेल उपसमुच्चय (FACS पैनल 2) के रूप में तालिका 1 और तालिका 2में वर्णित है । तालिका 1 और तालिका 2 में वर्णित वॉल्यूम एंटीबॉडी सांद्रता ऑप्टिमाइज़ करने के बाद चयनित होते हैं और एक vAT या सैट नमूना के लिए पर्याप्त होते हैं. नोट: FACS कक्ष 1 में, मार्करों CD303 और CD141 कि CD11C+ CD11Bकम कक्ष dc हैं, यह पुष्टि करने के लिए उपयोग करें । हालांकि, यह पैनल से इन मार्करों को बाहर करने के लिए एक जीवित/ दोनों FACS पैनल 1 और 2 के साथ संयुक्त किया जा सकता है जीना/मृत Fixable लाल मृत सेल दाग किट व्यवहार्यता जब पैनल 1 में CD303 को छोड़कर पीई चैनल के रूप में अप्रयुक्त हो जाएगा । निर्माता के निर्देशों के अनुसार व्यवहार्यता धुंधला प्रदर्शन ।</li>
	<li>२९.५ में गोली reसस्पेंड µ l एंटीबॉडी कॉकटेल के लिए FACS पैनल 1, और 23 µ l एंटीबॉडी कॉकटेल के लिए FACS पैनल 2. बर्फ पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए मशीन ।</li>
	<li>प्रत्येक अच्छी तरह से 150 µ l FACS बफर जोड़ें और एक दूसरे धोने कदम प्रदर्शन करने के लिए सेल गोली reसस्पेंड । 280 x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए थाली केंद्रापसारक । प्लेट को उल्टा ढोने से supernatant को निकाल दें ।</li>
	<li>कोशिकाओं को ठीक करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से 150 µ एल 1% formaldehyde समाधान जोड़ें । एक P200 पिपेट के साथ pipetting द्वारा एक अच्छी तरह से इसी FACS ट्यूब के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण । 7 दिनों तक अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर FACS ट्यूबों की दुकान । नोट: प्रत्यक्ष माप भी संभव है । 1% formaldehyde के बजाय प्रत्येक अच्छी तरह से 150 µ l FACS बफर जोड़ें, pipetting से इसी P200 ट्यूबों के लिए एक पिपेट FACS के साथ कोशिकाओं को हस्तांतरण, और कोशिकाओं का विश्लेषण. सावधानी: Formaldehyde बहुत विषाक्त है । formaldehyde समाधान तैयार करते हुए एक धुएं डाकू में काम करना सांस लेने से बचने के लिए और दस्ताने और सुरक्षा के लिए चश्मा पहनते हैं ।</li>
</ol>4. फ्लो Cytometry एनालिसिस
<ol><li>पहले माप, एक दाग नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करने के लिए आगे तितर बितर (FSC) और साइड स्कैटर (एसएससी) सेट । निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रवाह cytometer की वोल्टेज को समायोजित करें ताकि ब्याज की सभी आबादी FSC और एसएससी ग्राफ में दिखाई दे और मलबे और जीवित कोशिकाओं के बीच एक अंतर बनाया जा सके ।</li>
	<li>निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन एंटीबॉडी कैद मोतियों के साथ बहु रंग क्षतिपूर्ति विश्लेषण करते हैं ।</li>
	<li>एंटीबॉडी मिश्रण बनाने के द्वारा प्रतिदीप्ति ऋण एक (FMO) नियंत्रण तैयार है लेकिन मिश्रण से एक एंटीबॉडी बाहर । हर एंटीबॉडी के लिए यह मत करो, बनाने 8 एंटीबॉडी FACS पैनल 1 के लिए घोला जा सकता है, और 6 एंटीबॉडी FACS पैनल 2 के लिए घोला जा सकता है । इन FMO एंटीबॉडी घोला जा सकता है इस प्रोटोकॉल में पहले वर्णित के रूप में SVF दाग के लिए उपयोग किया जाता है ।</li>
	<li>सभी FMO नियंत्रण को मापने और FMO नियंत्रण के आधार पर गेटिंग रणनीति निर्धारित किया है । कक्षों के संभावित स्वत:-प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए FMO नियंत्रणों का उपयोग करें । नोट: मिश्रण से एक एंटीबॉडी को हटाने के द्वारा, इस चैनल में पाया किसी भी प्रतिदीप्ति स्तर एक पृष्ठभूमि/ इसलिए, विभिंन FMO नियंत्रण FACS परिणामों की तुलना करके, गेट्स विशिष्ट जनसंख्या सुनिश्चित करना है कि gatings सकारात्मक कोशिकाओं पर आधारित है और ऑटो प्रतिदीप्ति पर आधारित नहीं है पर तैयार किया जा सकता है ।</li>
	<li>भंवर 800 rpm पर FACS ट्यूबों उंहें प्रवाह cytometer में रखने और माप शुरू करने से पहले । नोट: लाइव गेट में 50,000 से कम घटनाओं की एक ंयूनतम प्रत्येक उपजनसंख्या से मापा जाता है सुनिश्चित करने के लिए अनुशंसित है ।</li>
</ol>

<ol>
	<li>McNelis, J. C., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+immunity,+and+metabolic+disease.">Macrophages, immunity, and metabolic disease.</a> Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).</li><li>Makki, K., Froguel, P., Wolowczuk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+in+obesity-related+inflammation+and+insulin+resistance:+cells,+cytokines,+and+chemokines.">Adipose tissue in obesity-related inflammation and insulin resistance: cells, cytokines, and chemokines.</a> ISRN Inflamm. 2013, 139239 (2013).</li><li>DeFuria, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+promote+inflammation+in+obesity+and+type+2+diabetes+through+regulation+of+T-cell+function+and+an+inflammatory+cytokine+profile.">B cells promote inflammation in obesity and type 2 diabetes through regulation of T-cell function and an inflammatory cytokine profile.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (13), 5133-5138 (2013).</li><li>Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+transiently+infiltrate+intra-abdominal+fat+early+in+the+course+of+high-fat+feeding.">Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding.</a> J Lipid Res. 49 (9), 1894-1903 (2008).</li><li>Han, J. M., Levings, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+regulation+in+obesity-associated+adipose+inflammation.">Immune regulation in obesity-associated adipose inflammation.</a> J Immunol. 191 (2), 527-532 (2013).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+deficiency+and+pharmacological+stabilization+of+mast+cells+reduce+diet-induced+obesity+and+diabetes+in+mice.">Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice.</a> Nat Med. 15 (8), 940-945 (2009).</li><li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++effector+T+cells+contribute+to+macrophage+recruitment+and+adipose+tissue+inflammation+in+obesity.">CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity.</a> Nat Med. 15 (8), 914-920 (2009).</li><li>Koh, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+vascular+fraction+from+adipose+tissue+forms+profound+vascular+network+through+the+dynamic+reassembly+of+blood+endothelial+cells.">Stromal vascular fraction from adipose tissue forms profound vascular network through the dynamic reassembly of blood endothelial cells.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (5), 1141-1150 (2011).</li><li>Peinado, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stromal-vascular+fraction+of+adipose+tissue+contributes+to+major+differences+between+subcutaneous+and+visceral+fat+depots.">The stromal-vascular fraction of adipose tissue contributes to major differences between subcutaneous and visceral fat depots.</a> Proteomics. 10 (18), 3356-3366 (2010).</li><li>Leggate, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+inflammatory+and+prominent+proteomic+changes+in+plasma+and+adipose+tissue+after+high-intensity+intermittent+training+in+overweight+and+obese+males.">Determination of inflammatory and prominent proteomic changes in plasma and adipose tissue after high-intensity intermittent training in overweight and obese males.</a> Journal of Applied Physiology. 112 (8), 1353-1360 (2012).</li><li>Divoux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+in+human+adipose+tissue:+link+with+morbid+obesity,+inflammatory+status,+and+diabetes.">Mast cells in human adipose tissue: link with morbid obesity, inflammatory status, and diabetes.</a> J Clin Endocrinol Metab. 97 (9), E1677-E1685 (2012).</li><li>Harford, K. A., Reynolds, C. M., McGillicuddy, F. C., Roche, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fats,+inflammation+and+insulin+resistance:+insights+to+the+role+of+macrophage+and+T-cell+accumulation+in+adipose+tissue.">Fats, inflammation and insulin resistance: insights to the role of macrophage and T-cell accumulation in adipose tissue.</a> Proc Nutr Soc. 70 (4), 408-417 (2011).</li><li>Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+induces+a+phenotypic+switch+in+adipose+tissue+macrophage+polarization.">Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization.</a> J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).</li><li>Morris, D. L., Singer, K., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+macrophages:+phenotypic+plasticity+and+diversity+in+lean+and+obese+states.">Adipose tissue macrophages: phenotypic plasticity and diversity in lean and obese states.</a> Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14 (4), 341-346 (2011).</li><li>Wentworth, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+CD11c+CD206++adipose+tissue+macrophages+are+associated+with+insulin+resistance+in+human+obesity.">Pro-inflammatory CD11c+CD206+ adipose tissue macrophages are associated with insulin resistance in human obesity.</a> Diabetes. 59 (7), 1648-1656 (2010).</li><li>Wouters, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+classical+monocytes+are+associated+with+CD11c++macrophages+in+human+visceral+adipose+tissue.">Circulating classical monocytes are associated with CD11c+ macrophages in human visceral adipose tissue.</a> Sci Rep. 7, 42665 (2017).</li><li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+subpopulations+characterize+acute+infection+and+chronic+inflammatory+lung+disease.">Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease.</a> J Immunol. 189 (2), 946-955 (2012).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+contributes+to+false-positive+intracellular+Foxp3+staining+in+macrophages:+a+lesson+learned+from+flow+cytometry.">Autofluorescence contributes to false-positive intracellular Foxp3 staining in macrophages: a lesson learned from flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 386 (1-2), 101-107 (2012).</li></ol>

लेखकों के हितों का कोई टकराव की घोषणा ।

इन विधियों का वर्णन कैसे SVF को अलग करने के लिए vAT और सैट और इन ऊतकों के भीतर प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सापेक्ष मात्रा को बढ़ाता है । इसके अलावा, तरीकों राज्य कैसे विशिष्ट कोशिका प्रकार पर मार्करों की अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए ।
ऊतक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रवाह cytometry ऊतकों की प्रतिरक्षा राज्य phenotype करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है । ऊतक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के ठहराव कई आवेदन कर सकते हैं । परिणामों में वर्णित के रूप में, यह रोगियों के समूहों के बीच विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाओं की उपस्थिति की तुलना करने के लिए संभव है (उदा., दुबला बनाम मोटापे से ग्रस्त) । इसके अलावा, भी एक ही रोगियों के रक्त पर प्रवाह cytometry प्रदर्शन करके, परिचालित कोशिकाओं और ऊतक कोशिकाओं के बीच संघों की जांच की जा सकती है. इस आवेदन के साथ हम परिचालित monocytes का एक विशिष्ट सबसेट समर्थक भड़काऊ CD11C+ वसा ऊतक मैक्रोफेज16के साथ जुड़ा हुआ है कि यह निर्धारित करने में सक्षम थे.
वर्णित प्रोटोकॉल के लिए समायोजन कई उपलब्ध फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के रूप में अपने आवेदन का विस्तार होगा प्रवाह cytometry बहुत बहुमुखी बनाते हैं । विभिंन एंटीबॉडी के साथ लगभग सभी प्रकार के सेल प्रतिष्ठित किया जा सकता है और कई मार्करों की अभिव्यक्ति का पता लगाया जा सकता है । इसके अलावा, यह सेल झिल्ली permeabilizing द्वारा intracellularly दाग मार्करों के लिए संभव है फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के intracellular बंधन की अनुमति है । इन विशेषताओं पीढ़ी सरलीकृत एम 1 और M2 मैक्रोफेज उपप्रकार से परे बहुत विविध मैक्रोफेज आबादी के भेद की अनुमति है । सतह मार्कर अभिव्यक्ति की माप के अलावा, प्रोटीन (यानी, साइटोकिंस) मैक्रोफेज कार्यक्षमता के बारे में जानकारी प्रदान intracellularly दाग हो सकता है । इसके अलावा, Ki67 जैसे प्रसार मार्करों प्रसार दर यों तो इस्तेमाल किया जाता है । के रूप में वर्णित है, मैक्रोफेज और dc के बीच भेद डीसी मार्कर के MFI स्तर पर आधारित था । एक जनरल मैक्रोफेज मार्कर, जैसे CD68 मैक्रोफेज पैनल (FACS पैनल 1) में शामिल किया जा सकता है । हालांकि, CD68 के लिए जो बेहतर और प्रोटोकॉल का विस्तार होता नहीं है कोशिका झिल्ली के permeabilization की आवश्यकता intracellularly दाग की जरूरत है । अंय मैक्रोफेज मार्करों ऐसे CD163 और CD206 या CD11c, बाद मैक्रोफेज पैनल में एकीकृत किया जा रहा है यहां प्रस्तुत के रूप में सबसेट मार्करों हैं ।
हमारे FACS पैनलों में, लाइव और मृत कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक मार्कर शामिल नहीं किया गया था, जो बेहतर होगा, क्योंकि यह FSC और एसएससी के उपयोग से मृत कोशिकाओं का एक और सटीक अपवर्जन की अनुमति देता है । अक्सर इस्तेमाल किया डीएनए धुंधला व्यवहार्यता रंजक propidium आयोडाइड (PI) या 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के रूप में अच्छी तरह के रूप में नि: शुल्क अमीन इस तरह के जीवित/मृत Fixable मृत सेल दाग किट, जो अलग डाई रंग में उपलब्ध है के रूप में रंजक प्रतिक्रिया कर रहे हैं । हालांकि, PI और DAPI उपयोग नहीं किया जा सकता जब कक्ष फिक्सिंग । के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित है, जीवित/मृत Fixable लाल मृत कोशिका व्यवहार्यता धुंधला समग्र FACS गेटिंग रणनीति को प्रभावित किए बिना दोनों पैनलों में एकीकृत किया जा सकता है ।
इसके अलावा, डेटा सभी डेटा रिश्तेदार हैं अर्थ जीवित कोशिकाओं के एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. केवल प्रवाह cytometer में एक सटीक, कोशिकाओं की ज्ञात संख्या दर्ज करके, यह प्रत्येक कोशिका प्रकार की सही संख्या निर्धारित करने के लिए संभव होगा. कक्षों की अनुमानित संख्या गणना कक्ष का उपयोग कर SVF अंश में कक्षों को गिनना के बाद परिकलित की जा सकती है । हालांकि, इस संख्या के लिए SVF को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया बायोप्सी ऊतक की राशि के लिए समायोजित किया जाना होगा, लेकिन इस पर मोटापे से ग्रस्त करने के लिए दुबला तुलना जब सीमाओं की है. मोटापे से ग्रस्त के एक समान द्रव्यमान कम adipocytes के होते है के रूप में वे लिपिड से भर रहे है और बहुत विस्तार किया है । यह प्रतिरक्षा कोशिका संख्या का एक आकलन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं अगर प्रति ग्राम या प्रति adipocyte प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्या के रूप में प्रस्तुत.
मानव अध्ययन में, रोगियों का समावेश आम तौर पर बहुत महत्व की प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का मानकीकरण कर समय की एक लंबी अवधि में किया जाता है. रोगियों के बीच प्रवाह cytometry डेटा की तुलना के लिए, वहां कई विकल्प हैं । के रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, कोशिकाओं को एक ही दिन में कई नमूनों के विश्लेषण की अनुमति माप से पहले तय किया जा सकता है । यह भी उंहें धुंधला से पहले SVF ठंड से प्राप्त किया जा सकता है, जो धुंधला प्रक्रिया सभी नमूनों के बीच बराबर होने की अनुमति देता है, लेकिन कोशिकाओं की व्यवहार्यता प्रभावित हो सकता है । अंत में, भी इस अध्ययन में कार्यरत हैं, मुआवजा स्तर स्थापित करने के लिए फ्लोरोसेंट मोती हैं, और cytometer ट्रैकिंग मोती द्वि-साप्ताहिक cytometer के दैनिक माप के मानक के लिए इस्तेमाल किया गया । यह अंतिम विकल्प सबसे कुशल है जब समय की एक लंबी अवधि में फैले एक अध्ययन से नमूनों को मापने ।
सामांय में प्रवाह cytometry के लिए एक सीमित कारक प्रतिदीप्ति का उपयोग है । फ्लोरोसेंट लेबल की संख्या है कि एक साथ पता लगाया जा सकता है उत्सर्जन स्पेक्ट्रा में ओवरलैप के कारण सीमित है । हालांकि, स्मार्ट FACS पैनल विकास और वैट या सैट नमूना प्रति कई एंटीबॉडी कॉकटेल के उपयोग के साथ, इस समस्या को इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में दूर किया जा सकता है । FACS पैनल विकास का एक महत्वपूर्ण पहलू FMO नियंत्रण है । एक के लिए छोड़कर पैनल के सभी एंटीबॉडी का उपयोग करके, संभावित autofluorescence स्तर की सराहना की जा सकता है जब पूर्ण पैनल के साथ FMO की तुलना. यह आबादी के सटीक गेटिंग और इन प्रक्रियाओं की अनुमति देता है जब एक नया FACS पैनल की स्थापना की जानी चाहिए । इसके अलावा, FACS उपकरणों की नई पीढ़ियों के लिए 50 सेल प्रति कई विशेषताओं का एक साथ पता लगाने की अनुमति मापदंडों का पता लगा सकते हैं । प्रतिदीप्ति पहलू से संबंधित एक अन्य मुद्दा कक्षों की autofluorescence, विशेष रूप से मैक्रोफेज है. FACS लेजर के साथ कोशिकाओं के उत्तेजना के बाद (मुख्य रूप से 488 एनएम तरंग दैर्ध्य उत्तेजना के साथ), इन कोशिकाओं को एक फ्लोरोसेंट संकेत (मुख्य रूप से < 640 एनएम) कि एंटीबॉडी लेबल के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ ओवरलैप कर सकते है फेंकना17,18। इस के लिए खाते के लिए, unधुंधला कोशिकाओं प्रत्येक चैनल में autofluorescence निर्धारित करने के लिए मापा जाना चाहिए । इस ज्ञान के साथ, fluorochromes कि एक संकेत शक्ति है कि फ्लोरोसेंट संकेत से अधिक प्रदर्शन का चयन किया जाना चाहिए । इस फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि संकेत ध्यान में रखा जाना चाहिए जब आबादी के गेटिंग रणनीति का निर्धारण । इसलिए, इस प्रोटोकॉल और इंटेलिजेंट FACS पैनल डिजाइन के आवेदन के द्वारा यह गहराई में phenotype मैक्रोफेज उपप्रकार के लिए संभव है । मैक्रोफेज में नई अलग और उनके समारोह विशेषता हो सकती है ।

मोटापा सूजन में कम ग्रेड के साथ विशेषता है1 और दोनों आंत और चमड़े के नीचे (वैट, सैट) में समर्थक भड़काऊ प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ । वैट में प्रो भड़काऊ प्रतिरक्षा कोशिकाओं के संचय इंसुलिन प्रतिरोध की ओर जाता है जो प्रकार के विकास के लिए एक प्राथमिक जोखिम कारक है 2 मधुमेह2. दोनों सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर मोटापे में पाए जाते हैं, जैसे मैक्रोफेज, मास्ट सेल, न्यूट्रोफिल, CD4+ और सीडी 8 + टी-कोशिकाओं, और बी-सेल 3, 4, 5, 6 ,7. इन प्रतिरक्षा कोशिकाओं, endothelial कोशिकाओं, stromal कोशिकाओं, adipocyte progenitors, fibroblasts, और pericytes के साथ साथ, SVF8 का गठन और में समर्थक भड़काऊ पदार्थों का मुख्य स्रोत हैं9.
पर भड़काऊ स्थिति सामांयतः पश्चिमी दाग10, qPCR11, और immunohistochemistry11सहित तकनीक द्वारा जांच की है । हालांकि, जब इन तकनीकों का उपयोग करते हुए, संपूर्ण AT, adipocytes, और SVF, का उपयोग किया जाता है । यह यह मुश्किल राशि और में मौजूद प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सबसेट का निर्धारण करने के लिए बनाता है । प्रतिरक्षा कोशिकाओं को परिभाषित करने और उन्हें वर्गीकृत, जैसे मैक्रोफेज के रूप में विभिन्न सेल मार्करों है. मैक्रोफेज फ़ंक्शन और कक्ष सरफ़ेस मार्कर व्यंजक12में महत्वपूर्ण विविधता दिखाएं । M1 और M2: इसलिए, वे अक्सर दो मैक्रोफेज आबादी में वर्गीकृत कर रहे हैं । M2 मैक्रोफेज आम तौर पर कहा जाता है वैकल्पिक रूप से सक्रिय मैक्रोफेज12,13 और दुबला के एटी में रहते हैं, चयापचय सामान्य मनुष्यों14. हालांकि, मोटापे के दौरान, एक phenotypic स्विच M2 मैक्रोफेज से M1 मैक्रोफेज के लिए होता है । ये प्रतिष्ठित M1 मैक्रोफेज एक्सप्रेस CD11C12 सक्रिय और मृत adipocytes के आसपास जमा करने के लिए मुकुट की तरह संरचनाओं13। इसमें दिखाया गया है कि CD11C+ में मैक्रोफेज इंसुलिन क्रिया को बाधित करता है और मोटापे से ग्रस्त मनुष्यों में इंसुलिन प्रतिरोध के साथ जुड़े होते हैं15. M1 और M2 मैक्रोफेज में एटी की पहचान करने के लिए, immunohistochemistry एक विकल्प है । यह तकनीक टिशू में मैक्रोफेज के स्थान के बारे में जानकारी देती है । हालांकि, यह मार्कर कि एक धुंधला में इस्तेमाल किया जा सकता है की संख्या को सीमित करेगा । इसके अलावा इसका अंदाजा लगाना भी मुश्किल है । इसलिए, विभिंन प्रतिरक्षा सेल सबसेट में वैट और sAT जमा की जांच करने के लिए, हम एक प्रवाह cytometry दृष्टिकोण विकसित की है । इस दृष्टिकोण से हमें सेल उपसमुच्चय को परिभाषित करने के लिए एक प्रवाह cytometry विश्लेषण के साथ प्रति सेल एकाधिक मार्करों का उपयोग करने का अवसर मिलता है और AT जमाओं में मौजूद प्रत्येक सबसेट की संख्या की गणना करता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich Rotanta 460R</td>
			<td>5660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)-Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Gibco ThermoFisher</td>
			<td>31330-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7657-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0130-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01145.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4503-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06688.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;M syringe Filcons</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M filter</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>542070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc block / human IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>14506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04003.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>301324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-Fitc</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-Fitc</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD66b-Fitc</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56-Fitc</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c-APC-Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>337218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-PE-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-V500</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56-APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>318310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4-PerCP-Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>300528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8-APC-H7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>641400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD303-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>354204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD141-APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS-Canto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 v-shape well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>651101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS PH 7.4</td>
			<td>Gibco ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG from human serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rat Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>L23102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IKA&#160;MS 3 basic shaker</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z645028-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of immune cells in human adipose tissue by using flow cytometry

चमड़े के नीचे और आंत वसा ऊतक में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ (एटी) जमा मोटापा के विकास में योगदान करने के लिए एक कम ग्रेड सूजन की ओर जाता है जैसे प्रकार 2 मधुमेह-जुड़े जटिलताओं । मात्रात्मक और गुणात्मक रूप से मानव जमाव में प्रतिरक्षा कोशिका उपसमुच्चय की जांच करने के लिए, हमने एक प्रवाह cytometry दृष्टिकोण विकसित किया है । stromal संवहनी अंश (SVF), प्रतिरक्षा कोशिकाओं युक्त, collagenase पाचन द्वारा चमड़े के नीचे और आंत से बायोप्सी पर अलग है । Adipocytes केंद्रापसारक के बाद हटा रहे हैं । SVF कोशिकाओं को कई झिल्ली बाध्य मार्करों प्रतिरक्षा सेल उपसमुच्चय के बीच अंतर करने के लिए चयनित और प्रवाह cytometry का उपयोग कर विश्लेषण के लिए दाग रहे हैं । इस दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप, समर्थक और विरोधी भड़काऊ मैक्रोफेज सबसेट, वृक्ष कोशिकाओं (dc), बी-कोशिकाओं, CD4+ और सीडी 8 + टी कोशिकाओं, और NK कोशिकाओं का पता लगाया जा सकता है और quantified. इस विधि में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बारे में विस्तृत जानकारी देता है और प्रत्येक विशिष्ट सबसेट की मात्रा । के बाद से वहां कई फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी उपलब्ध हैं, हमारे प्रवाह cytometry दृष्टिकोण को मापने के विभिंन अंय सेलुलर और ब्याज की intracellular मार्करों समायोजित किया जा सकता है ।

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Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

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