Name: promoter capture hi-c: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions
Uploaded: 2018-06-28T13:30:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions at JoVE.com

Vi takker Valeriya Malysheva for kritisk læsning af manuskript og eksperthjælp med figur 1. Dette arbejde blev støttet af den medicinske Forskningsråd, UK (hr./L007150/1) og UK bioteknologi og biologiske Sciences Research Council, UK (BB/J004480/1).

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Modulære design af promotor fange Hi-C
Promotor fange Hi-C er designet til specifikt berige Hi-C biblioteker for interaktioner, der vedrører projektledere. Disse interaktioner omfatter kun en delmængde af ligatur produkter findes i en Hi-C-biblioteket.
Capture Hi-C kan let ændres til at berige Hi-C biblioteker for genomisk region eller regioner af interesse ved at ændre capture-system. Capture regioner kan være kontinuerlig genomisk segmenter44,45,46,48, smagsforstærkere, der er blevet identificeret i PCHi-C (Reverse fange Hi-C-35), eller DNase overfølsomme sites49 . Størrelse ordningens capture kan justeres alt efter de eksperimentelle anvendelsesområde. For eksempel, Dryden mfl. målrette 519 agn fragmenter i tre gen ørkener forbundet med bryst kræft44. Capture-system af Martin mfl. mål begge kontinuerlig genomisk segmenter ("Region Capture": 211 genomisk regioner i alt, 2,131 begrænsning fragmenter) og valgt initiativtagere (3,857 gen initiativtagere)45.
SureSelect biblioteker er tilgængelige i forskellige intervaller: 1 kb til 499 kb (5.190 – 4,806), 500 kb til 2,9 Mb (5.190 – 4,816), og 3 Mb til 5,9 Mb (5.190 – 4,831). Som hver enkelte fange biotin-RNA er 120 nukleotider lange, disse erobre systemer rumme et maksimum af 4,158, 24,166 og 49,166 individuelle fange sonder, henholdsvis. Dette svarer til 2,079, 12,083 og 24,583 målrettede begrænsninger småstykker, henholdsvis (Bemærk, at tallene for begrænsning fragmenter er nedre grænser baseret på den antagelse, at to individuelle capture sonder kan være konstrueret til enhver begrænsning Fragmentet — i virkeligheden på grund af gentagne sekvenser vil dette ikke være tilfældet for hver begrænsning fragment (Se også figur 1B, C), hvilket resulterer i et højere antal markedssegment begrænsning fragmenter for et konstant antal tilgængelige capture sonder ).
Protokollen beskrevet her er baseret på anvendelse af en restriktion enzym med et 6 bp anerkendelse websted at afdække langtrækkende interaktioner. Ved hjælp af en begrænsning enzym med en 4 bp anerkendelse websted for større opløsning af mere proksimale interaktioner er også mulige40,49.
Begrænsninger af PCHi-C
En iboende begrænsning af alle kromosom kropsbygning capture assays er, at deres beslutning bestemmes af begrænsning enzym brugt til biblioteket generation. Samspil, der opstår mellem DNA elementer placeret på den samme begrænsning fragment er usynlige for 'C-type' assays. Yderligere, i PCHi-C, i nogle tilfælde mere end én transskription startstedet kan være placeret på det samme promotor-holdige begrænsning fragment, og PIRs i nogle tilfælde havnen både aktive og undertrykkende Histon mærker, hvilket gør det vanskeligt at lokalisere som regulerende elementer mægle samspillet, og at forudsige den regulerende output af promotor interaktioner. Ved hjælp af restriktionsenzymer med 4 bp genkendelsessekvenser afbøder problemet men kommer på bekostning af voldsomt forøgede Hi-C bibliotek kompleksitet (Hi-C biblioteker genereret med 4 bp anerkendelse websted restriktionsenzymer er mindst 100 gange mere komplekse end Hi-C biblioteker genereret med 6 bp anerkendelse websted restriktionsenzymer), og de dermed forbundne omkostninger for næste generation sequencing.
En anden begrænsning er, at den nuværende PCHi-C protokollen kræver millioner af celler som udgangspunkt materiale, udelukker analyse af promotor interaktioner i sjældne celletyper. En modificeret version af PCHi-C hen til muliggøre afhøring af initiativtageren kontakter i cellepopulationer med 10.000 til 100.000 celler (f.eks celler under tidlige embryonale udvikling eller hæmatopoietisk stamceller) ville derfor være en værdifuld tilføjelse til fange Hej-C værktøjskasse.
Endelig, ligesom alle metoder, der er afhængige af formaldehyd fiksering, PCHi-C kun registrerer interaktioner, der er» frosset» for tidspunkt af fiksering. Således, for at studere kinetik og dynamik af promotor interaktioner, metoder såsom super-resolution levende celle mikroskopi er kræves sammen med PCHi-C.
Metoder til at dissekere rumlige kromosom organisation med høj opløsning
Den enorme kompleksitet kromosomale interaktion biblioteker forbyder den pålidelige Materielidentifikationen interaktion mellem to specifikke begrænsning fragmenter med Statistisk signifikans. For at omgå dette problem, er sekvens capture blevet brugt til at berige enten Hi-C33,34,40,44 eller 3 C50,51 biblioteker for specifikke interaktioner. Den store fordel ved at bruge Hi-C-biblioteker over 3C for berigelse skridt er, at Hi-C, i modsætning til 3C, omfatter en berigelse skridt for ægte ligatur produkter. Som en konsekvens, er procentdelen af gyldig læser i PCHi-C biblioteker ca 10-fold højere end i Capture-C biblioteker50, som indeholdt omkring 5-8% gyldig læser efter HiCUP filtrering. Sahlen et al. har direkte sammenlignet Capture-C til HiCap, der ligesom PCHi-C bruger Hi-C biblioteker til fange berigelse, i modsætning til Capture-C, som bruger 3 C-biblioteker. I overensstemmelse med vores resultater, de fandt at opsamling-C biblioteker er hovedsageligt komponeret af un-sammenskrevne fragmenter40. Derudover havde HiCap biblioteker en højere kompleksitet end Capture-C biblioteker40.
En variant af Capture-C, kaldes næste generation Capture-C52 (NG Capture-C) bruger en oligo pr. begrænsning fragment slutningen, som tidligere etableret i PCHi-C33,34, i stedet for overlappende sonder anvendes i oprindelige Capture-C protokollen50. Dette øger procentdelen af gyldig læsninger i forhold til Capture-C beskedent, men NG Capture-C beskæftiger to sekventielle runder af capture berigelse og et relativt højt antal PCR-cykler (20-24 cyklusser i alt, sammenlignet med 11 cyklusser typisk for PCHi-C), som uundgåeligt medfører højere antal sekvens dubletter og lavere bibliotek kompleksitet. I retssag eksperimenter under optimering af PCHi-C, fandt vi, at den procentvise andel af unikke (dvs. ikke duplikeres) læse par var omkring kun 15% når vi brugte 19 PCR cyklusser (13 cyklusser pre fange + 6 cyklusser post capture; data ikke vist), men Optimering til et lavere antal PCR cyklusser, udbytter typisk 75-90% unikke Læs par. Således, at reducere antallet af PCR cyklusser betydeligt øger mængden af informative sekvens data.
En nyere metode kombinerer ChIP med Hi-C at fokusere på kromosom vekselvirkninger medieret af et specifikt protein af interesse (HiChIP53). I forhold til ChIA-PET54, som er baseret på en lignende rationale, indeholder HiChIP data et større antal informative sekvens læser, giver mulighed for højere tillid interaktion kræver53. Det vil være meget interessant at direkte sammenligne de tilsvarende HiChIP og fange Hi-C datasæt de bliver når tilgængelige (for eksempel HiChIP ved hjælp af en antistof mod cohesin enhed Smc1a53 med fange Hi-C for alle Smc1a bundet begrænsning fragmenter) side om side. En iboende forskel mellem disse to tilgange er at fange Hi-C ikke stole på kromatin immunoprecipitation, og derfor er i stand til at afhøre kromosom vekselvirkninger uanset protein belægning. Dette giver mulighed for sammenligning af 3D genom organisation i tilstedeværelse eller fravær af specifik faktor binding, som er blevet brugt til at identificere PRC1 som et centralt regulator af musen ESC rumlige genom arkitektur7.
PCHi-C og GWAS
Genome-wide association studier (GWAS) har afsløret, at mere end 95% af sygdom-associerede sekvens varianter er beliggende i ikke-kodende regioner i genomet, ofte på store afstande til protein-kodning gener55. GWAS varianter er ofte fundet i umiddelbar nærhed af DNase jeg overfølsom websteder, som er kendetegnende for sekvenser med potentielle regulerende aktivitet. PCHi- og fange Hi-C har været brugt flittigt at linke initiativtagere til GWAS risiko loci impliceret i bryst kræft44, kolorektal cancer48og autoimmun sygdom35,45,46. En PCHi-C undersøgelse af 17 forskellige menneskelige hæmatopoietisk celle typer fundet SNPs forbundet med autoimmun sygdom blev beriget med PIRs i lymfoide celler, hvorimod sekvens varianter tilknyttet trombocyttal og røde blodlegemer specifikke træk fandtes overvejende de makrofager og erythroblasts, henholdsvis35,56. Således vævstype specifikke promotor interactomes afsløret af PCHi-C kan bidrage til at forstå funktionen af ikke-kodende sygdom-associerede sekvens varianter og identificere nye potentielle sygdomsgener for terapeutisk intervention.
Karakteristik af promotor-interagere regioner
Flere linjer af beviser link promotor interactomes gen expression kontrol. Først, flere PCHi-C undersøgelser har vist, at genomisk regioner interagere med initiativtagere til (meget) udtrykte gener er beriget med marks tilknyttet enhancer aktivitet, som H3K27 acetylation og p300 bindende33,34 , 37. vi fandt en positiv korrelation mellem gen expression niveau og antallet af interagerende smagsforstærkere, tyder på, at tilsætningsstoffet effekter af smagsforstærkere resultere i øget genekspression niveauer34,35. For det andet naturligt forekommende udtryk kvantitative træk loci (eQTLs) er beriget med PIRs, der er forbundet med de samme gener, hvis udtryk påvirkes af eQTLs35. For det tredje ved at integrere tur57 og PCHi-C data, fandt Cairns et al. tur reporter gener kortlægning til PIRs i mus sektorrådene viser stærkere reporter genekspression end reporter gener på integration websteder, i ikke-promotor-interagere regioner 58, der angiver, at PIRs besidder transkriptionel regulering aktivitet. Sammen, tyder disse resultater på, at initiativtageren interactomes afsløret af PCHi-C i forskellige mus og menneskelige celletyper omfatte centrale lovgivningsmæssige moduler til gen expression kontrol.
Det er værd at bemærke, at smagsforstærkere udgør kun en lille brøkdel (~ 20%) af alle PIRs afdækket ved PCHi-C33,34. Andre PIRs kunne have strukturelle eller topologiske roller snarere end direkte transcriptional regulerende funktioner. Men der er også beviser for at PCHi-C kan afdække DNA elementer med regulerende funktion, der ikke havnen klassisk enhancer mærker. I en menneskelig lymfoide cellelinie, blev BRD7 selskabet fundet til at interagere med en region forstærker mærker, der blev vist sig at besidde enhancer aktivitet i reporter gen assays33. Regulerende elementer med lignende karakteristika kan være mere rigelig end i øjeblikket værdsat. For eksempel, markerer en CRISPR-baseret skærm for regulerende DNA elementer identificerede umarkerede regulerende elementer (foranstaltninger), kontrollerer genekspression, men er forstærker59.
I andre tilfælde har PIRs vist sig at havnen kromatin marks tilknyttet transcriptional undertrykkelse. PIRs og interagerende initiativtagere bundet af PRC1 i mus sektorrådene var involveret i et omfattende fysisk netværk af undertrykt gener forsynet med de repressive mark H3K27me37. I humane lymphoblastoid celler, en fjern element interagere med BCL6 promotor undertrykt transgen reporter gen expression33, tyder på, at det kan fungere for at undertrykke BCL6 transskription i sin oprindelige kontekst.
PIRs beriget for belægning af kromatin isolator protein CTCF i menneskelige og sociale råd og NECs37 kan udgøre endnu en klasse af PIRs. Kollektivt, tyder disse resultater på, at PIRs havnen en samling af genet reguleringsvirksomhed endnu at karakteriseres funktionelt.

Akkumulere beviser tyder på, at den tredimensionale organisation af genomet spiller en vigtig funktionelle rolle i en række nukleare processer, herunder gen aktivering1,2,3, undertrykkelse4 ,5,6,7,8, rekombination9,10, DNA reparation11, DNA replikation12,13, og cellulære gulne14. Fjern smagsforstærkere er fundet i geografisk nærhed til initiativtagerne de regulerer15,16,17, som er afgørende for korrekt spatio-temporale gen expression kontrol. Forstærker sletninger vis at distale smagsforstærkere er afgørende for target gen transskription18,19,20,21,22, og "tvungen kromatin looping" viser, manipuleret tethering mellem en forstærker og dens mål initiativtager i Ulla locus er tilstrækkelig til at drive transcriptional aktivering23. Yderligere, genome rearrangementer, der bringer gener under kontrol af ektopiske smagsforstærkere kan resultere i uhensigtsmæssige genaktivering og sygdom24,25,26. Sammen, illustrerer disse eksempler at promoter-forstærker interaktioner er afgørende for gen kontrol og kræver stram regulering at sikre relevant genekspression. Menneskelige og mus genomer skønnes hver havnen omkring en million smagsforstærkere. For langt de fleste af disse smagsforstærkere, target gener er ukendt, og 'regler for magtanvendelse' mellem projektledere og smagsforstærkere er dårligt forstået. Tildele transcriptional smagsforstærkere til deres mål gener således fortsat en stor udfordring i afkodningen pattedyr gen expression kontrol.
Blevet revolutioneret vores forståelse af tre-dimensionelle genom arkitektur af indførelsen af 3C27 (kromosom kropsbygning capture) og dens varianter28,29,30,31 . Den mest magtfulde af disse teknikker, Hi-C (høj overførselshastighed kromosom kropsbygning capture) er designet til at identificere den hele ensemble af kromosom vekselvirkninger i en celle population. Hej-C biblioteker, typisk genereres fra millioner af celler, er yderst komplekse med en anslået 1011 uafhængige ligatur produkter mellem ~ 4 kb fragmenter i det menneskelige genom32. Som en konsekvens, pålidelig og reproducerbar identifikation af interaktioner mellem individuelle begrænsning fragmenter (f.eks. dem, der indeholder en promotor eller forstærker) fra er Hi-C data ikke mulig, medmindre Hi-C biblioteker udsættes for ultra-dybe sekventering, der er ikke en økonomisk levedygtig løsning for laboratorier forbereder Hi-C biblioteker rutinemæssigt. For at omgå denne mangel, udviklet vi promotor fange Hi-C for at specifikt berige promotor-holdige ligatur produkter fra Hi-C biblioteker. Vi fokuserede på initiativtagerne af to grunde. Først, promoter-forstærker kontakter har vist sig at være afgørende for ordentlig gen expression niveauer i talrige undersøgelser (Se henvisninger ovenfor), og for det andet, som initiativtagere er i vid udstrækning invariant mellem celletyper, det samme fange agn system kan bruges til at forhøre den lovgivningsmæssige kredsløb på tværs af flere celletyper og betingelser. Vores tilgang bygger på-løsning hybridisering af Hi-C biblioteker med titusinder af biotinylated RNA 120mers supplerer promotor-holdige Hi-C ligatur produkter og efterfølgende opsamling på streptavidin-belagt magnetiske perler. Dette resulterer i PCHi-C biblioteker med meget reduceret kompleksitet i forhold til den oprindelige Hi-C library, fokuserer kun på identifikation af fragmenter, der er forbundet til projektledere på betydeligt høje frekvenser.
Vi har brugt PCHi-C i en række menneskelige og mus celletyper til at bidrage til en bedre forståelse af gen expression kontrol af afsløring langtrækkende distale promotor interagerende regioner med formodede regulativfunktionen, såvel som ikke-tilfældige promotor-initiativtageren kontakter i de tre-dimensionelle rum af kernen. Undersøgelserne har kortlagt hundredtusindvis af promoter-forstærker kontakter på tværs af adskillige celle typer33,34,35,36,37,38, 39, identificeret Polycomb Repressive komplekse-medieret rumlige genom organisation i mus embryonale stamceller7, påvist store rewiring af promotor interactomes under Celledifferentiering37, 38 , 39og sammenkædet ikke-kodende sygdom-associerede sekvens varianter til gen initiativtagere35.
PCHi-C er en velegnet metode til at knytte genome-wide ensemble af DNA-sekvenser interagere med initiativtagere. Relaterede tilgange, såsom fange Hi-C af kontinuerlig genomisk områder (Se diskussion) er metoden for valget mellem at få høj opløsning interaktion profiler for valgte genomisk regioner. PCHi- og fange Hi-C er meget lignende fra en eksperimentel synspunkt (den eneste forskel er valget af capture system), således at de råd og retningslinjer vi leverer er gældende for begge tilgange. Vi præsenterer her, en detaljeret beskrivelse af PCHi-C. Vi skitsere rationale og design af et PCHi-C eksperiment, giver en trinvis PCHi-C bibliotek generation protokol og illustrere, hvordan kvaliteten af PCHi-C biblioteker kan kontrolleres på forskellige trin i protokollen til udbytte data af høj kvalitet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1420">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:671px;">16% (vol/vol) paraformaldehyde solution</td>
			<td style="width:140px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:333px;">R1026</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered</td>
			<td style="width:140px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:333px;">F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Low-retention filter tips&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Starlab</td>
			<td style="width:333px;">S1180-3810, S1180-1810, S1180-8810 and S1182-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x PBS pH 7.4</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">70011-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular biology grade water</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:333px;">W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">15568-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IGEPAL CA-630&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:333px;">I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 M NaCl&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">24740-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:333px;">11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Restriction buffer 2 (10x NEBuffer 2)</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">B7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA LoBind tube, 1.5 mL&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:333px;">0030 108.051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA LoBind tube, 2 mL</td>
			<td style="width:140px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:333px;">30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">20% (wt/vol) SDS&#160;&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Bio-Rad Laboratories</td>
			<td style="width:333px;">161-0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20% (vol/vol) Triton X-100&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:333px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HindIII, 100 U/uL</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">R0104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dCTP&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">18253-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dGTP</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">18254-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dTTP&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">18255-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.4 mM Biotin-14-dATP</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">19524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M0210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">10x T4 DNA ligase reaction buffer&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">B0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">100x 10mg/ml Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">B9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA ligase, 1 U/&#956;L&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:333px;">15224-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase A&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Roche</td>
			<td style="width:333px;">10109142001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K, recombinant, PCR grade&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Roche</td>
			<td style="width:333px;">3115836001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 000&#215;g 50 ml centrifuge tube</td>
			<td style="width:140px;">VWR</td>
			<td style="width:333px;">525-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EDTA pH 8.0&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol pH 8.0&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:333px;">P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:333px;">P3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate pH 5.2&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td>S7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quant-iT PicoGreen&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:333px;">P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:140px;">Qiagen</td>
			<td style="width:333px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:140px;">Qiagen</td>
			<td style="width:333px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Restriction buffer 2.1 (10x NEBuffer 2.1)</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">B7202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NheI, 100U/uL</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">R0131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6x16mm vials&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Covaris</td>
			<td style="width:333px;">520045</td>
			<td>For sonication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPRI beads (Agencourt AMPure XP)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:333px;">A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:333px;">65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dATP&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">18252-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">T4 DNA polymerase 3000 units/mL</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">T4 PNK 10000 units/mL</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Klenow exo minus 5000 units/mL&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M0212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Quick ligation reaction buffer&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">B6058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NEB DNA Quick ligase&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE adapter 1.0 (5&#39;-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGC 
			AGGAATGCCGAG-3&#39;)</td>
			<td style="width:140px;">Illumina</td>
			<td style="width:333px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE adapter 2.0 (5&#39;-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT 
			CTTCCGATCT-3&#39;)</td>
			<td style="width:140px;">Illumina</td>
			<td style="width:333px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NEB Phusion PCR kit&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE PCR primer 1.0 (5&#39;-AATGATACGGCGACCACCGA 
			GATCTACACTCTTTCCCTAC 
			ACGACGCTCTTCCGATCT-3&#39;)</td>
			<td style="width:140px;">Illumina</td>
			<td style="width:333px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE PCR primer 2.0 (5&#39;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA 
			GATCGGTCTCGGCATTCCT 
			GCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3&#39;)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Illumina</td>
			<td style="width:333px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PCR strips&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:333px;">410022 and 401425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">SureSelect SSEL TE Reagent ILM PE full adaptor kit&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Agilent Technologies</td>
			<td>931108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">SureSelect custom 3-5.9 Mb library&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:333px;">5190-4831</td>
			<td>custom design mouse or human PCHi-C system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:333px;">65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E220&#160; high-performance focused ultra-sonicator</td>
			<td style="width:140px;">Corvaris</td>
			<td style="width:333px;">E220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

promoter capture hi-c: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions

Den tredimensionale organisation af genomet er knyttet til dens funktion. For eksempel, styre regulerende elementer såsom transcriptional smagsforstærkere den spatio-temporale udtryk for deres mål gener gennem fysisk kontakt, ofte bridging betydeligt (i nogle tilfælde hundredvis af kilobases) genomisk afstande og omgåelse nærliggende gener. Det menneskelige genom havne en anslået en million smagsforstærkere, hvoraf langt størstedelen har ukendte gen mål. Tildele distale lovgivningsmæssige områder til deres mål gener er således afgørende at forstå gen expression kontrol. Vi udviklede promotor fange Hi-C (PCHi-C) til at aktivere genome-wide påvisning af distale promotor-interagere regioner (PIRs), for alle projektledere i et enkelt eksperiment. I PCHi-C, er meget komplekse Hi-C biblioteker specifikt beriget til promotor sekvenser gennem i løsning hybrid udvalg med tusinder af biotinylated RNA lokkemad supplement til enderne af alle promotor-holdige begrænsning fragmenter. Formålet er at derefter pull-down promotor sekvenser og deres hyppig interaktion partnere såsom smagsforstærkere og andre potentielle regulerende elementer. Efter høj overførselshastighed parret ende sekventering påføres en statistisk test hver promotor-forbundet begrænsning fragment at identificere væsentlige PIRs på fragment begrænsningsniveau. Vi har brugt PCHi-C til at generere en atlas af langtrækkende promotor interaktioner i snesevis af mennesker og mus celletyper. Disse promotor interactome kort har bidraget til en større forståelse af pattedyr gen expression kontrol ved at tildele formodede lovgivningsmæssige områder til deres mål gener og afslørende præferentielle rumlige promotor-promotor interaktion netværk. Denne information også har høj relevans til forståelsen af menneskets genetiske sygdom og identifikation af potentielle sygdomsgener, ved at sammenkæde ikke-kodende sygdom-associerede sekvens varianter i eller i nærheden af styringsforløb til deres mål gener.

Promotor fange Hi-C er blevet brugt til at berige mus7,34,36,39 og menneskelige33,35,37,38 Hi-C biblioteker for promotor interaktioner. En lignende protokol (opkaldt HiCap) er blevet beskrevet af Sandberg gruppe40. Figur 1A viser skematisk arbejdsprocessen for promotor fange Hi-C. I protokollen beskrevet her, er Hi-C biblioteker genereret ved hjælp af i-nucleus ligatur41, hvilket resulterer i en betydeligt reduceret antallet af falske ligatur produkter42. For PCHi-C, yderst komplekse mus eller menneskelige Hi-C biblioteker udsættes for-løsning hybridisering og fange ved hjælp af 39,021 biotinylated RNA'er supplerende til 22,225 mus promotor-holdige HindIII begrænsninger småstykker, eller 37,608 biotinylated RNA'er målretning 22,076 menneskelige promotor-holdige HindIII begrænsning fragmenter, henholdsvis. Promotor indeholdende begrænsning fragmenter kan være rettet mod en eller begge ender af individuelle biotinylated RNA'er (figur 1B). Vi fandt, at erobringen af begge ender bedre dækning af enkelte projektledere (figur 1 c, rå sekvens lyder) næsten to-fold, som forventet. Således, når muligt (dvs. i ikke-gentagne regioner), vi anbefaler for at bruge biotinylated RNA'er supplement til begge ender af en restriktion fragment at blive fanget.
For at vurdere PCHi-C bibliotek kvalitet på et tidligt tidspunkt under bibliotek forberedelse, udføre vi to kontrolelementer efter DNA ligatur og rensning, som tidligere beskrevet31. Først er at bruge specifikke primer par til at forstærke ligatur produkter som 3 C27. Vi bruger primer par (tabel 1) til at forstærke celletype invariante langtrækkende ligatur produkter, f.eks Myc -genet og dets kendte smagsforstærkere beliggende ca 2 Mb væk (figur 2A) eller mellem gener af Hist1 locus ( adskilt af 1,5 Mb), og mellem to regioner, der ligger i nærheden af lineære ('kortrækkende control').
Den anden kvalitetskontrol er gennemført til at bestemme effektiviteten af biotin indarbejdelse under Klenow-medieret udfyldning af begrænsning site markiser med biotin-dATP. Vellykket Klenow fill-in og efterfølgende blunt-ende ligatur resultater i forsvinden af den oprindelige begrænsning sted mellem DNA-molekyler af en ligatur produkt og for HindIII i dannelsen af et nyt NheI anerkendelse websted (figur 2B ). Forholdet mellem HindIII NheI fordøjet ligatur produkt er en direkte udlæsning af biotin indarbejdelse effektivitet. En dårlig kvalitet Hi-C bibliotek vil vise et højt niveau af HindIII fordøjelsen, mens høj kvalitet biblioteker har næsten fuldstændig NheI fordøjelse af ligatur produkter (figur 2B).
Efter Hi-C bibliotek forberedelse (dvs. efter biotin-streptavidin trække ned af størrelsen valgt Hi-C ligatur produkter, adapter ligatur og før fange PCR), er integritet og størrelse fordelingen af Hi-C-biblioteket vurderet af Bioanalyzer (figur 2 C). det samme kontrol udføres i slutningen af PCHi-C bibliotek forberedelse (dvs. efter hybridisering erobringen af promotor-holdige ligatur produkter og efter opsamling PCR). Sammenligning af Hi-C og PCHi C Bioanalyzer profiler viser, som forventet, Hi-C biblioteker er langt mere koncentreret end de tilsvarende PCHi-C biblioteker, men størrelse distribution af biblioteker er meget lignende, hvilket indikerer, at fange trin i PCHi-C indfører ikke en størrelse bias (figur 2 c, D).
Efter parret ende sekventering, PCHi-C læser er kortlagt, kvalitet kontrolleres og filtreres ved hjælp af HiCUP pipeline43. Høj kvalitet PCHi-C biblioteker indeholder mellem 70-90% 'gyldig par' (dvs., parret-afslutning sekvens læser mellem to begrænsning fragmenter, der ikke tilstødende på den lineære genomisk kort; Figur 3A, B). Bruger i nucleus ligatur protokol41,42, læse procentdelen af trans par (dvs., parret-afslutning sekvens læser mellem to begrænsning fragmenter, der er placeret på forskellige kromosomer) er normalt lav, mellem 5 og 25%, hvilket afspejler eksistensen af kromosom territorier, og med angivelse af god bibliotek kvalitet. Direkte sammenligning af procentdelen af gyldig par mellem Hi-C biblioteker og deres tilsvarende PCHi-C biblioteker35, viser, at i alle tilfælde procentdelen af gyldig par er højere i PCHi-C biblioteker (figur 3B). Dette ledsages af en reduktion i andelen af ikke-gyldig 'samme fragment indre' læser i PCHi-C (figur 3 c). Dette forventes, da fange skridt ikke kun beriger for promotor-holdige ligatur produkter, men også for begrænsning fragment udløber, på grund af placeringen af capture oligos om begrænsning fragmenter (Se figur 1B).
Efter HiCUP filtrering, bestemmer vi fange effektivitet. PCHi-C biblioteker indeholder tre typer af gyldig rækkefølge læser efter HiCUP filtrering: 1.) promotor: genom læser (dvs. læsninger mellem en erobrede promotor fragment og en ikke-promotor HindIII begrænsning fragment overalt i genomet) 2.) promotor: promotor læser (læsninger mellem to erobrede promotor fragmenter) 3.) genom: genom læser (baggrund Hi-C ligatur produkter hvor ingen af ligatur produkt partnere tilknyttes en erobrede promotor). Disse er kasseret før downstream analyser.
Høj kvalitet PCHi-C biblioteker har capture effektivitetsfordele (summen af kategori 1 og 2 ovenfor) mellem 65-90% (figur 3D). En direkte sammenligning med Hi-C biblioteker viser, at PCHi-C resulterer i en ~ 15-fold berigelse for promotor-holdige ligatur produkter (figur 3D), i nogle tilfælde 17-fold. Det er tæt på det hypotetiske maksimale (19.6-fold) berigelse for PCHi-C, som er afhængige af procentdelen af genom begrænsning fragmenter er omfattet af capture-system. Større berigelse kan opnås ved at designe capture systemer målretning færre begrænsning fragmenter44,45,46.
Analyse af selskabet interactomes viser celle type og afstamning-specificitet33,34,35, med udtalt ændringer under Celledifferentiering37,38,39 . Tal 4 og 5 viser eksempler på lineage specificitet og differentiering dynamik på specifikke initiativtagere. For eksempel ALAD udtrykkes constitutively i alle celler, men dens udtryk er upregulated i erythroblasts47. ALAD initiativtageren kontakter flere distale fragmenter i alle hæmatopoietisk celler og engagerer sig i ekstra interaktioner specifikt i erythroblasts (figur 4). IL-8 viser ingen statistisk signifikante interaktioner i B-celler, meget få interaktioner i T-celler, men snesevis af interaktioner i celler af myeloide slægt, herunder celletype specifikke interaktioner i () monocytter, neutrofiler og megakaryocytes Figur 5). Disse eksempler viser, hvordan PCHi-C kan bruges til at optrævle celletype specifikke interactomes og identificere promotor-interagere regioner med lovgivningsmæssige potentiale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig1.jpg"> Figur 1 : Promotor fange Hi-C rationale og fange agn design. (A) skematisk arbejdsproces for PCHi-C. I kernen ligatur Hi-C41,42 (I) er efterfulgt af-løsning hybridisering med biotinylated RNA lokkemad (II) rettet mod restriktion fragmenterne af alle menneskelige (afbildet her) eller mus gen initiativtagere (III). (B) agn design til PCHi-C. Biotinylated RNA capture lokkemad (røde buede linjer) er designet mod enderne af promotor-holdige begrænsning fragmenter (grå, Bemærk at promotor sekvenser, selv (rød) målrettes kun af RNA capture lokkemad, hvis de er placeret på begrænsning fragment ender). Ligatur produkter bestående af promotor-holdige begrænsning fragmenter (grå) og deres interagerende begrænsning fragmenter (gul og grøn) er isoleret gennem sekvens-komplementaritet hybridisering mellem RNA agn og DNA mål, og efterfølgende Biotin-streptavidin pulldown, som vist i (A. C) sammenligning af PCHi-C opsamling effektivitet for promotor-holdige begrænsning fragmenter målrettet efter én RNA agn capture sonde vs to RNA agn capture sonder (Se skematisk i B). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig2.jpg"> Figur 2 : PCHi-C før sekventering kvalitetskontroller. (A) venstre, skematisk af rumlige sammenstilling mellem arrangøren og PIR, hvilket resulterer i en Hi-C ligatur produkt bestående af en promotor-holdige begrænsning fragment, (grå, promoter sekvens i rød) og en PIR begrænsning fragment (gul). Højre, DNA gel elektroforese viser eksempler på Hi-C ligatur produkter forstærkes ved hjælp af specifikke primer par (som afbildet i skematisk til venstre). (B) venstre, repræsentative eksempler på HindIII, NheI og HindIII/NheI begrænsning fordøjer af Hi-C ligatur produkter (PCR produkter vist i A). Højre, skematisk af DNA sekvens efter Hi-C ligatur efter mislykket (øverst) eller succesfulde (nederst) dNTP Klenow fill-in begrænsning vejkryds og efterfølgende ligatur. (C) repræsentant Hi-C bibliotek bioanalyzer profil (1/5 fortynding). (D) repræsentant PCHi-C bibliotek bioanalyzer profil (ingen fortynding). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig3.jpg"> Figur 3 : PCHi-C post sekventering kvalitetskontrol. (A) sammenligning af procent gyldig rækkefølge Læs par efter HiCUP43 forarbejdning i PCHi-C vs svarende Hi-C biblioteker (data fra Javierre et al., 201635). (B) repræsentant HiCUP PCHi-C resultatet viser gyldig læse par og andre rækkefølge kategorier, der er kasseret før downstream analyser (data fra Javierre et al., 201635). (C) sammenligning af procentdel 'samme fragment indre' læser efter HiCUP behandling i PCHi-C vs svarende Hi-C biblioteker (data fra Javierre et al., 201635). (D) sammenligning procentdelen sekvenstype læser med madding promotor fragmenter (capture effektivitet) i PCHi-C vs svarende Hi-C biblioteker (data fra Javierre et al., 201635). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig4.jpg"> Figur 4: ALAD PCHi-C profil i hæmatopoietisk menneskeceller. Promotor interaktioner af myeloide celletyper er vist som blå buer, og promotor interaktioner af lymfoide celletyper er vist som lilla buer. Erythroblast-specifikke interaktioner er markeret med røde pile (data fra Javierre et al., 201635). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig5.jpg"> Figur 5 : IL8 PCHi-C profil i hæmatopoietisk menneskeceller. Promotor interaktioner af myeloide celletyper er vist som blå buer, og promotor interaktioner af lymfoide celletyper er vist som lilla buer. Monocyt-specifikke interaktioner er markeret med grønne pile, neutrofile-specifikke interaktioner er markeret med røde pile og en megakaryocyte-specifik interaktion er angivet med en brun pil (data fra Javierre et al., 201635). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="9">Menneskelige</td>
		</tr>
<tr>
<td>Navn</td>
			<td colspan="3">Sekvens</td>
			<td>Kromosom</td>
			<td>Strand</td>
			<td>Start GRCh38/hg38</td>
			<td>Slutningen GRCh38/hg38</td>
			<td>Primer kombinationer at afprøve 3C interaktioner og biotin indarbejdelse</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS AHF64 Dekker</td>
			<td colspan="3">GCATGCATTAGCCTCTGCTGTTCTCTGAAATC</td>
			<td>11</td>
			<td>+</td>
			<td>116803960</td>
			<td>116803991</td>
			<td>brug i kombination med hs AHF66 Dekker</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS AHF66 Dekker</td>
			<td colspan="3">CTGTCCAAGTACATTCCTGTTCACAAACCC</td>
			<td>11</td>
			<td>+</td>
			<td>116810219</td>
			<td>116810248</td>
			<td>brug i kombination med hs AHF64 Dekker</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS MYC locus</td>
			<td colspan="3">GGAGAACCGGTAATGGCAAA</td>
			<td>8</td>
			<td>-</td>
			<td>127733814</td>
			<td>127733833</td>
			<td>brug i kombination med hs MYC +1820 eller hs MYC-538</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS MYC +1820</td>
			<td colspan="3">AAAATGCCCATTTCCTTCTCC</td>
			<td>8</td>
			<td>+</td>
			<td>129554527</td>
			<td>129554547</td>
			<td>brug i kombination med hs MYC locus</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS MYC-538</td>
			<td colspan="3">TGCCTGATGGATAGTGCTTTC</td>
			<td>8</td>
			<td>-</td>
			<td>127195696</td>
			<td>127195716</td>
			<td>brug i kombination med hs MYC locus</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS HIST1 F</td>
			<td colspan="3">AAGCAGGAAAAGGCATAGCA</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>26207174</td>
			<td>26207193</td>
			<td>brug i kombination med hs HIST1 Rasmussen</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS HIST1 Rasmussen</td>
			<td colspan="3">TCTTGGGTTGTGGGACTTTC</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>27771575</td>
			<td>27771594</td>
			<td>brug i kombination med hs HIST1 F</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="9">Mus</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">Sekvens</td>
			<td>Kromosom</td>
			<td>Strand</td>
			<td>Start GRCm38/mm10</td>
			<td>Slutningen GRCm38/mm10</td>
			<td>Primer kombinationer at afprøve 3C interaktioner og biotin indarbejdelse</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">TCATGAGTTCCCCACATCTTTG</td>
			<td>8</td>
			<td>+</td>
			<td>84841090</td>
			<td>84841111</td>
			<td>brug i kombination med mm Calr2</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">CTGTGGGCACCAGATGTGTAAAT</td>
			<td>8</td>
			<td>+</td>
			<td>84848519</td>
			<td>84848541</td>
			<td>brug i kombination med mm Calr1</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">TATCAAGGGTGCCCGTCACCTTCAGC</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>125163098</td>
			<td>125163123</td>
			<td>brug i kombination med Gapdh4 Dekker</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGGCTTTTATAGCACGGTTATAAAGT</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>125163774</td>
			<td>125163799</td>
			<td>brug i kombination med Gapdh3 Dekker</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGAGGAGGGAAAAGGAGTGATT</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>52212829</td>
			<td>52212850</td>
			<td>brug i kombination med mm Hoxa13</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">CAGGCATTATTTGCTGAGAACG</td>
			<td>6</td>
			<td>-</td>
			<td>52253490</td>
			<td>52253511</td>
			<td>brug i kombination med mm Hoxa7</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGGTAATGGTGTCACTAACTGG</td>
			<td>13</td>
			<td>+</td>
			<td>23571284</td>
			<td>23571305</td>
			<td>brug i kombination med Hist1h3e eller mm Hist1h4i</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGGTTTGATGAGTTGGTGAAG</td>
			<td>13</td>
			<td>+</td>
			<td>23566541</td>
			<td>23566561</td>
			<td>brug i kombination med mm Hist1h2ae</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">TTGGGCCAAAGCCTATATGA</td>
			<td>13</td>
			<td>+</td>
			<td>22043085</td>
			<td>22043104</td>
			<td>brug i kombination med mm Hist1h2ae</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Primer sekvenser for kvalitetskontrol af menneskelige og mus Hi-C biblioteker.

Watch this Scientific Journal Video about Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions at JoVE.com

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

DNA regulerende elementer, såsom smagsforstærkere, kontrollerer genekspression ved fysisk at kontakte target gen initiativtagere, ofte gennem langtrækkende kromosom vekselvirkninger der spænder over stor genomisk afstande. Promotor fange Hi-C (PCHi-C) identificerer betydningsfulde vekselvirkninger mellem projektledere og distale regioner, gør det muligt for tildelingen af potentielle regulerende sekvenser til deres mål gener.

Promotor Capture Hej-C: Høj opløsning, Genome-wide profilering af promotor interaktioner

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genom-dækkende Bestemmelse af pattedyr Replication Timing ved DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Analyse af c-KIT ligand-promotoren ved anvendelse af chromatinimmunpræcipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genom-bred kortlægning af protein-DNA-interaktioner med ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Kortlægning Genome-wide tilgængelige kromatin i primære humane T lymfocytter af ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Bestemmelse af Genome-wide udskrift henfald priser i prolifererende og inaktiv humane fibroblaster

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation af Genome-wide kromatin kropsbygning Capture biblioteker fra stramt iscenesatte tidlige Drosophila embryoner

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genom-dækkende overvågning af transskription fejl i Eukaryote organismer

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

Høj opløsning sammenligning af bakteriel konjugation frekvenser

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetisk kortlægning af termo Toleranceforskelle mellem arter af Saccharomyces gær via Genome-Wide gensidig Hemizygosity analyse

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Identifikation af forstærker-promotor kontakter i embryolede organer ved kvantitative kromosom kropsbygning Capture (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...