Name: promoter capture hi-c: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions
Uploaded: 2018-06-28T13:30:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions at JoVE.com

Nous remercions Valeriya Malysheva pour une lecture critique du manuscrit et expert d’aide à la Figure 1. Ce travail a été soutenu par le Medical Research Council, UK (MR/L007150/1) et la biotechnologie UK et Biological Sciences Research Council, UK (BB/J004480/1).

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Conception modulaire du promoteur Capture Hi-C
Promoteur de Capture Hi-C est conçu pour enrichir spécifiquement CIH bibliothèques pour les interactions impliquant des promoteurs. Ces interactions constituent uniquement un sous-ensemble des produits de ligature présents dans une bibliothèque de CIH.
Capture Hi-C peut facilement être modifié pour enrichir les bibliothèques Hi-C pour chaque région génomique ou les régions d’intérêt en changeant le système de capture. Régions de capture peuvent être continu segments génomiques44,45,46,48, rehausseurs qui ont été identifiés à DAPE-C ("inverser la Capture Hi-C"35) ou DNase I sites hypersensibles49 . La taille du système de capture peut être ajustée selon la portée expérimentale. Par exemple, Dryden et al. cibler les 519 fragments d’appât dans trois déserts de gènes associés à breast cancer44. Le système de piégeage par Martin et al. cible les deux segments génomiques continues (« Région de Capture » : 211 régions génomiques au total ; 2 131 fragments de restriction) et sélectionné les promoteurs (3 857 promoteurs de gènes)45.
Bibliothèques de SureSelect sont disponibles dans des gammes de tailles différentes : 1 Ko à 499 Ko (5 190 – 4 806), 500Ko à 2,9 Mo (5 190 – 4 816) et 3 Mo à 5,9 Mo (5 190 – 4 831). Comme chaque capture individuels biotine-ARN est 120 nucléotides de long, ces capturent systèmes accueillir un maximum de 4 158, 24 166 et 49 166 individuels de capture des sondes, respectivement. Cela correspond à 2 079 12 083 et des fragments de restriction ciblée 24 583, respectivement (Notez que les numéros des fragments de restriction sont minorants basées sur l’hypothèse que les deux sondes de capture individuels peuvent être conçus pour chaque restriction fragment — en réalité en raison de séquences répétitives, ce ne sera pas le cas pour chaque restriction fragment (voir aussi Figure 1 b, C), ce qui entraîne un plus grand nombre de fragments de restriction targetable pour un nombre constant de sondes de capture disponibles ).
Le protocole décrit ici est basé sur l’utilisation d’une enzyme de restriction avec un site de reconnaissance bp 6 afin de découvrir les interactions à longue portée. À l’aide d’une enzyme de restriction avec un site de reconnaissance bp 4 pour une plus grande résolution des interactions plus proximales est également possible de40,49.
Limitations de DAPE-C
Une des limitations inhérentes de tous les essais de capture de conformation du chromosome sont que leur résolution est déterminée par l’enzyme de restriction utilisée pour la production de la bibliothèque. Les interactions qui se produisent entre des éléments d’ADN situées sur le même fragment de restriction sont invisibles aux déterminations « type C ». En outre, DAPE-C, dans certains cas plus d’un site d’initiation de transcription peut se trouver sur le même fragment de restriction contenant du promoteur, en SRRJ dans certains cas abritent deux marques d’histone active et répressif, rendant difficile à cerner qui réglementaire éléments de médient les interactions et de prévoir la sortie réglementaire des interactions de promoteur. À l’aide d’enzymes de restriction avec 4 sites de reconnaissance bp atténue cette question mais se fait aux dépens de la complexité de bibliothèque CIH considérablement accrue (bibliothèques de CIH générés avec 4 bp reconnaissance site enzymes de restriction sont au moins 100 fois plus complexes que le CIH bibliothèques, générés avec 6 bp reconnaissance site enzymes de restriction) et les coûts connexes pour l’ordonnancement de la génération suivante.
Une autre limitation est que le protocole actuel de DAPE-C nécessite des millions de cellules comme matière, excluant l’analyse des interactions de promoteur dans les types de cellules rares de départ. Une version modifiée du PCHi-C pour permettre l’interrogatoire des contacts de promoteur dans les populations de cellules avec 10 000 à 100 000 cellules (par exemple pendant le développement embryonnaire ou de cellules souches hématopoïétiques) serait donc un atout précieux pour la Capture Salut-C boîte à outils.
Enfin, comme toutes les méthodes qui s’appuient sur la fixation de formaldéhyde, DAPE-C enregistre seulement des interactions qui sont « gelées » au point de temps de fixation. Ainsi, afin d’étudier la cinétique et la dynamique des interactions du promoteur, des méthodes comme la microscopie des cellules vivantes Super-résolution sont tenus aux côtés de DAPE.-c.
Méthodes de disséquer organisation chromosomique spatiale à haute résolution
La grande complexité des bibliothèques d’interactions chromosomiques interdit l’identification fiable des produits de l’interaction entre deux fragments de restriction spécifique avec une signification statistique. Pour contourner ce problème, capture de la séquence a été utilisé pour enrichir le CIH33,34,40,44 ou 3C50,51 bibliothèques pour des interactions spécifiques. L’avantage majeur de l’utilisation de bibliothèques bibliothèques plus 3C Hi-C pour l’étape d’enrichissement est que Hi-C, à la différence des 3C, comprend une étape d’enrichissement pour les produits authentiques de la ligature. En conséquence, le pourcentage de lectures valides dans les bibliothèques de DAPE-C est environ 10 fois plus élevé que dans la Capture-C bibliothèques50, qui contenait environ 5 à 8 % valide lit après filtrage HiCUP. Samid et coll. ont comparé directement Capture-C à HiCap, qui comme DAPE-C utilise les bibliothèques de la CIH pour l’enrichissement de capture, contrairement à la Capture-C, qui utilise les bibliothèques de 3C. Conformément à nos conclusions, ils ont constaté que les bibliothèques Capture-C sont composées principalement de fragments non ligaturé40. En outre, les bibliothèques HiCap avaient une plus grande complexité que les bibliothèques de Capture-C40.
Une variante de Capture-C, appelée génération Capture-C52 NG Capture-C utilise un oligo par extrémité de fragment de restriction, comme précédemment établies dans le PCHi-C33,34, au lieu de chevauchement des sondes utilisées dans l’original Protocole de capture-C50. Ceci augmente le pourcentage de lectures valides par rapport à la Capture-C modestement, mais NG Capture-C emploie deux séries séquentielles d’enrichissement de la capture, et un nombre relativement élevé de PCR cycles (20 à 24 cycles au total, par rapport aux 11 cycles généralement DAPE-c), qui inévitablement se traduit par un nombre plus élevé de doublons de séquence et moins complexe de la bibliothèque. Dans les expériences du procès lors de l’optimisation du PCHi-C, nous avons constaté que le pourcentage d’unique (c'est-à-dire, ne pas dupliqués) lu paires ne était que d’environ 15 % lorsque nous avons utilisé 19 cycles PCR (13 cycles pré capturent + 6 cycles après capturent ; données non présentées), mais optimisation à un plus faible nombre de cycles PCR, entraîne généralement de 75 à 90 % des paires de lecture uniques. Ainsi, réduire le nombre de cycles PCR sensiblement augmente la quantité de données sur les séquences informatives.
Une méthode récente allie ChIP avec Salut-C mettre l’accent sur les interactions chromosomiques médiées par une protéine spécifique d’intérêt (HiChIP,53). Par rapport à clerbois-PET54, qui repose sur un raisonnement similaire, HiChIP données contient un nombre plus élevé de lectures de séquence informative, permettant une interaction plus de confiance envers l’appel53. Il sera très intéressant de comparer directement le HiChIP correspondant et capturer le CIH des ensembles de données une fois qu’ils seront disponibles (par exemple HiChIP à l’aide d’un anticorps dirigé contre le cohesin unité Smc1a53 avec Capture Hi-C pour tous les Smc1a lié restriction fragments) côte à côte. Une différence inhérente entre ces deux approches est que capturer le CIH ne dépend pas de l’immunoprécipitation de la chromatine et est donc capable d’interroger les interactions chromosomiques indépendamment d’occupation de la protéine. Cela permet la comparaison de l’organisation génomique 3D en présence ou en absence de liaison de facteur spécifique, tel qu’il a été utilisé pour identifier le PRC1 comme un régulateur clé de souris ESC génome spatiale architecture7.
PCHi-C et GWAS
Études d’association pangénomique (GWAS) ont révélé que plus de 95 % des maladies associées à des variantes de séquence sont situés dans des régions non codantes du génome, souvent à de grandes distances de gènes codant pour des protéines55. Variantes GWAS sont souvent trouvés à proximité immédiate de la DNase I sites hypersensibles, qui est une marque de séquences avec l’activité de régulation possible. DAPE et capturer Hi-C ont été utilisés intensivement pour lier les promoteurs à locus risque GWAS impliqués dans breast cancer44, cancer colorectal48et maladie auto-immune35,45,46. Une DAPE-C étude sur 17 des cellules hématopoïétiques humains différents types trouvent SNP associés à des maladies auto-immunes ont été enrichies dans le SRRJ dans les cellules lymphoïdes, tandis que les variantes de séquence associés à plaquettes et les globules rouges des traits spécifiques trouvées principalement dans les macrophages et les érythroblastes, respectivement35,56. Ainsi, type de tissu spécifiques promoteur interactomes découvert par DAPE-C peut aider à comprendre la fonction de non-codage associés à la maladie variantes de séquence et identifier de nouveaux gènes de maladie potentielle pour une intervention thérapeutique.
Caractéristiques des régions promoteur-interaction
Plusieurs lignes d’évidence lien promoteur interactomes au contrôle d’expression de gène. Tout d’abord, plusieurs études de DAPE-C ont montré que les régions génomiques interagissant avec les promoteurs de gènes à (très) sont enrichies en marques associées à l’activité enhancer, tels que H3K27 acétylation et p300 liaison33,34 , 37. nous avons constaté une corrélation positive entre le niveau d’expression de gène et le nombre d’exhausteurs interagissants, ce qui suggère que les effets additifs des résultat exhausteurs dans l’expression génique accrue niveaux34,35. En second lieu, naturellement expression locus de caractères quantitatifs (eQTLs) sont enrichis dans le SRRJ qui est connectés aux mêmes gènes dont l’expression est affectée par le eQTLs35. Troisièmement, en intégrant Voyage57 et données DAPE-C, Cairns et coll. ont découvert que les gènes voyage cartographie au SRRJ dans ces souris montrent journaliste plus forte l’expression génique de gènes rapporteurs au sites d’intégration dans les régions non-promoteur-interacting 58, indiquant que le PIRs possèdent l’activité de régulation transcriptionnelle. Ensemble, ces résultats suggèrent que le promoteur interactomes découverts par DAPE-c dans différentes de souris et de types de cellules humaines incluent principaux modules réglementaires pour le contrôle d’expression de gène.
Il est à noter que les rehausseurs représentent seulement une petite fraction (~ 20 %) de tous les détecteurs infrarouge passifs, découverts par DAPE-C33,34. Autres détecteurs infrarouge passifs pourraient avoir des rôles structurels ou topologiques plutôt que des fonctions de régulation transcriptionnelles directes. Toutefois, il semble également que DAPE-C peut-être découvrir des éléments d’ADN avec fonction de régulation qui ne pas abriter des marques rehausseur classique. Dans une ligne de cellules lymphoïdes humaines, le promoteur de la BRD7 a été trouvé pour interagir avec une région dépourvue de marques enhancer qui s’est avérée posséder une activité enhancer journaliste gène dosages33. Éléments de régulation ayant des caractéristiques similaires peuvent être plus abondants qu’actuellement apprécié. Par exemple, un écran CRISPR pour ADN éléments identifiés non marquées réglementaires éléments régulateurs (UREs) qui contrôlent l’expression des gènes, mais sont dépourvues de renforceur de marque59.
Dans d’autres cas, détecteurs infrarouge passifs ont démontré pour héberger les marques de la chromatine associées à une répression transcriptionnelle. Détecteurs infrarouge passifs et interactions promoteurs liés par PRC1 dans ces souris étaient engagés dans un vaste réseau spatial de gènes réprimés portant que le répressif marque H3K27me37. Dans les cellules lymphoblastoïdes humaines, un élément lointain interagissant avec le promoteur BCL6 réprimée transgène journaliste gene expression33, ce qui suggère qu’il pourrait fonctionner pour réprimer la transcription BCL6 dans son contexte natif.
Pesi enrichis pour l’occupation de la protéine d’isolateur de chromatine FCCT humaine ESCs et NECs37 peut représenter une nouvelle classe de détecteurs infrarouge passifs. Collectivement, ces résultats suggèrent que le SRRJ abritent une collection d’activités réglementaires de gène qui doit encore être caractérisée sur le plan fonctionnel.

Accumulation de preuves suggère que l’organisation en trois dimensions du génome joue un rôle fonctionnel important dans une gamme de processus nucléaires, y compris les gènes d’activation1,2,3,4 la répression ,5,6,7,8, recombinaison9,10, ADN réparation11, réplication de l’ADN12,13, et sénescence cellulaire14. Exhausteurs de lointains sont trouvent à proximité spatiale aux promoteurs qu’ils réglementent15,16,17, qui est essentiel pour le contrôle d’expression de gène spatio-temporelle approprié. Destructions de renforceur montrent qu’exhausteurs distales sont essentiels pour cible génétique transcription18,19,20,21,22et « forcé la chromatine en boucle » démontre que le tethering machiné entre un renforceur et son promoteur de cible dans le locus de l’hexabromobiphényle est suffisant pour entraîner l’activation transcriptionnelle23. En outre, réarrangements génomiques qui apportent des gènes sous le contrôle d’exhausteurs ectopiques peuvent entraîner activation de gènes inappropriés et maladie24,25,26. Ensemble, ces exemples montrent que les interactions de promoteur-enhancer sont essentielles pour le contrôle de gènes et exigent le règlement serré afin d’assurer l’expression des gènes appropriés. L’homme et génomes de souris sont chacun estimées à environ 1 million d’exhausteurs de port. Pour la grande majorité de ces rehausseurs, gènes cibles sont inconnues, et les « règles d’engagement » entre promoteurs et exhausteurs sont mal compris. Affectation d’exhausteurs de transcriptionnelles à leurs gènes cibles ainsi demeure un défi majeur en déchiffrant contrôle d’expression génique chez les mammifères.
Notre compréhension de l’architecture en trois dimensions de génome a été révolutionnée par l’introduction de 3C27 (capture de conformation de chromosome) et ses variantes28,29,30,31 . Le plus puissant de ces techniques, le CIH (capture de conformation du chromosome à haut débit) est destiné à identifier l’ensemble entier des interactions chromosomiques au sein d’une population cellulaire. Salut-C bibliothèques, typiquement générés à partir des millions de cellules, sont très complexes avec une estimée 1011 produits de ligature indépendante entre les fragments de ~ 4 Ko dans le génome humain32. Comme une conséquence, une identification fiable et reproductible des interactions entre restriction individuelle des fragments (tels que ceux contenant un promoteur ou un rehausseur) de données Hi-C ne soient pas possibles à moins que le CIH bibliothèques sont soumis au séquençage ultra profond, qui n’est pas une solution économiquement viable pour les laboratoires préparant Hi-C bibliothèques régulièrement. Afin de contourner cette lacune, nous avons développé promoteur capturer CIH pour enrichir spécifiquement promoteur contenant des produits de ligature de bibliothèques Hi-C. Nous nous sommes concentrés sur les promoteurs pour deux raisons. Tout d’abord, contacts de promoteur-renforceur montrent très importante pour les niveaux d’expression de gène approprié dans de nombreuses études (voir références ci-dessus), et en second lieu, que les promoteurs sont en grande partie invariantes entre les types de cellules, le même système d’appât de capture peut servir à interroger les circuits réglementaires sur plusieurs types de cellules et conditions. Notre approche s’appuie sur l’hybridation solution de bibliothèques Hi-C avec des dizaines de milliers de 120mers biotinylé RNA complémentaires aux produits contenant du promoteur de la ligature de CIH et capture ultérieure sur streptavidine des billes magnétiques. Il en résulte dans les bibliothèques de DAPE-C avec beaucoup moins de complexité par rapport à la bibliothèque de CIH originale, en se concentrant uniquement sur l’identification de fragments qui sont ligaturées aux promoteurs à beaucoup de hautes fréquences.
Nous avons utilisé le PCHi-C dans un certain nombre de l’homme et les types de cellules de souris de contribuer à une meilleure compréhension du contrôle d’expression de gène de découvrir à longue distance distale interaction régions promotrices avec fonction réglementaire, ainsi que non aléatoire contacts de promoteur-promoteur dans l’espace en trois dimensions du noyau. Les études ont cartographié des centaines de milliers de contacts de promoteur-renforceur à travers de nombreuses cellules types33,34,35,36,37,38, 39, identifié Polycomb répressif complexe-mediated spatiale organisation du génome dans les cellules souches embryonnaires de souris7, a démontré un recâblage à grande échelle du promoteur interactomes au cours de la différenciation cellulaire37, 38 , 39et lié non codantes associés à la maladie de séquences variantes de gènes promoteurs35.
PCHi-C est une méthode idéale pour cartographier l’ensemble du génome de séquences d’ADN interagit avec les promoteurs. Approches connexes, tels que capturer Hi-C des régions génomiques discontinues (voir Discussion) sont la méthode de choix pour obtenir les profils d’interaction à haute résolution pour certaines régions génomiques. DAPE et capturer Hi-C sont extrêmement semblables d’un point de vue expérimental (la seule différence est le choix du système de capture), afin que les conseils et les directives que nous fournissons sont applicables à ces deux approches. Nous présentons ici une description détaillée du PCHi.-c. Nous exposer brièvement les raisons et la conception d’une expérience de DAPE-C, fournir un protocole étape par étape de la génération du bibliothèque DAPE-C et illustrer comment la qualité des bibliothèques DAPE-C peut être étudiée à différentes étapes du protocole pour obtenir des données de haute qualité.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1420">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:671px;">16% (vol/vol) paraformaldehyde solution</td>
			<td style="width:140px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:333px;">R1026</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered</td>
			<td style="width:140px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:333px;">F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Low-retention filter tips&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Starlab</td>
			<td style="width:333px;">S1180-3810, S1180-1810, S1180-8810 and S1182-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x PBS pH 7.4</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">70011-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular biology grade water</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:333px;">W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">15568-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IGEPAL CA-630&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:333px;">I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 M NaCl&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">24740-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:333px;">11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Restriction buffer 2 (10x NEBuffer 2)</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">B7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA LoBind tube, 1.5 mL&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:333px;">0030 108.051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA LoBind tube, 2 mL</td>
			<td style="width:140px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:333px;">30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">20% (wt/vol) SDS&#160;&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Bio-Rad Laboratories</td>
			<td style="width:333px;">161-0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20% (vol/vol) Triton X-100&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:333px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HindIII, 100 U/uL</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">R0104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dCTP&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">18253-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dGTP</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">18254-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dTTP&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">18255-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.4 mM Biotin-14-dATP</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">19524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M0210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">10x T4 DNA ligase reaction buffer&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">B0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">100x 10mg/ml Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">B9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA ligase, 1 U/&#956;L&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:333px;">15224-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase A&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Roche</td>
			<td style="width:333px;">10109142001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K, recombinant, PCR grade&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Roche</td>
			<td style="width:333px;">3115836001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 000&#215;g 50 ml centrifuge tube</td>
			<td style="width:140px;">VWR</td>
			<td style="width:333px;">525-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EDTA pH 8.0&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol pH 8.0&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:333px;">P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:333px;">P3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate pH 5.2&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td>S7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quant-iT PicoGreen&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:333px;">P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:140px;">Qiagen</td>
			<td style="width:333px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:140px;">Qiagen</td>
			<td style="width:333px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Restriction buffer 2.1 (10x NEBuffer 2.1)</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">B7202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NheI, 100U/uL</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">R0131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6x16mm vials&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Covaris</td>
			<td style="width:333px;">520045</td>
			<td>For sonication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPRI beads (Agencourt AMPure XP)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:333px;">A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:333px;">65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dATP&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">18252-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">T4 DNA polymerase 3000 units/mL</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">T4 PNK 10000 units/mL</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Klenow exo minus 5000 units/mL&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M0212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Quick ligation reaction buffer&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">B6058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NEB DNA Quick ligase&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE adapter 1.0 (5&#39;-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGC 
			AGGAATGCCGAG-3&#39;)</td>
			<td style="width:140px;">Illumina</td>
			<td style="width:333px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE adapter 2.0 (5&#39;-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT 
			CTTCCGATCT-3&#39;)</td>
			<td style="width:140px;">Illumina</td>
			<td style="width:333px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NEB Phusion PCR kit&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE PCR primer 1.0 (5&#39;-AATGATACGGCGACCACCGA 
			GATCTACACTCTTTCCCTAC 
			ACGACGCTCTTCCGATCT-3&#39;)</td>
			<td style="width:140px;">Illumina</td>
			<td style="width:333px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE PCR primer 2.0 (5&#39;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA 
			GATCGGTCTCGGCATTCCT 
			GCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3&#39;)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Illumina</td>
			<td style="width:333px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PCR strips&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:333px;">410022 and 401425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">SureSelect SSEL TE Reagent ILM PE full adaptor kit&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Agilent Technologies</td>
			<td>931108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">SureSelect custom 3-5.9 Mb library&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:333px;">5190-4831</td>
			<td>custom design mouse or human PCHi-C system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:333px;">65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E220&#160; high-performance focused ultra-sonicator</td>
			<td style="width:140px;">Corvaris</td>
			<td style="width:333px;">E220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

promoter capture hi-c: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions

L’organisation en trois dimensions du génome est liée à sa fonction. Par exemple, des éléments de régulation comme exhausteurs de transcriptional contrôlent l’expression spatio-temporelle de leurs gènes cibles par le biais de contacts physiques, souvent des liens relationnels considérable (dans certains cas des centaines de kilobases) génomique et contournant gènes voisins. Le génome humain recèle un exhausteurs de 1 million environ, la majorité dont est inconnu gènes cibles. Affectation des régions régulatrices distales à leurs gènes cibles est donc crucial de comprendre le contrôle d’expression de gène. Nous avons développé promoteur Capture Hi-C (DAPE-C) pour permettre la détection du génome des régions distales de promoteur-interaction (PIRs), pour tous les promoteurs dans une expérience simple. PCHi-c, hautement complexe CIH bibliothèques sont spécifiquement enrichis de séquences promotrices par le biais de sélection dans la solution hybride avec des milliers d’appâts biotinylé RNA complémentaires jusqu’aux extrémités de tous les fragments de restriction contenant du promoteur. Le but est de séquences promotrices puis menu déroulant et leurs partenaires d’interaction fréquente comme exhausteurs et d’autres éléments réglementaires potentielles. Après le séquençage haut débit jumelé-fin, un test statistique est appliqué à chaque fragment de restriction ligaturé au promoteur d’identifier les détecteurs infrarouge passifs significatifs au niveau du fragment de restriction. Nous avons utilisé le PCHi-C à produire un atlas des interactions à longue portée de promoteur en des dizaines d’homme et types de cellules de souris. Ces cartes d’interactome promoteur ont contribué à une meilleure compréhension du contrôle d’expression de gène mammifère en affectant les régions régulatrices putatives à leurs gènes cibles et révélant les réseaux d’interaction spatiale préférentiel de promoteur-promoteur. Cette information a aussi haute importance à la compréhension des maladies génétiques humaines et l’identification des gènes de maladies potentielles, en liant non codantes associés à la maladie variantes dans ou près des séquences de contrôle de leurs gènes cibles de la séquence.

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Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Éléments de régulation de l’ADN, comme améliorateurs, contrôlent l’expression des gènes en contactant physiquement les promoteurs de gènes cibles, souvent par le biais des interactions chromosomiques à longue portée, s’étendant sur grandes distances de génomiques. Promoteur de Capture Hi-C (DAPE-C) identifie des interactions significatives entre les promoteurs et les régions distales, permettant l’attribution des séquences régulatrices potentiels de leurs gènes cibles.

Capture promoteur Salut-c : Haute résolution, Genome-wide profilage des Interactions de promoteur

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Détermination de l&#39;échelle du génome de Timing de réplication mammalienne par l&#39;ADN Mesure Contenu

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Recherche

Génétique

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Analyse du promoteur du ligand c-KIT utilisant l&#39;immunoprécipitation de la chromatine

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Cartographie génomique des interactions protéine-ADN avec ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Cartographie de tout le génome de chromatine Accessible dans les Lymphocytes T humains primaires par ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Déterminer le taux de décroissance de Genome-wide transcription dans les fibroblastes humains proliférantes et repos

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Génération de chromatine Genome-wide Conformation Capture bibliothèques d’embryons de drosophile début étroitement mise en scène

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Surveillance de Génome-large d’erreurs de Transcription dans les organismes eucaryotes

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

Haute résolution comparaison des fréquences de la conjugaison bactérienne

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Cartographie génétique des différences de thermotolérance entre les espèces de levure saccharomyces via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Identification des contacts Enhancer-Promoteur dans les corps embryonnaires par capture quantitative de conformation des chromosomes (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...