Name: promoter capture hi-c: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions
Uploaded: 2018-06-28T13:30:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions at JoVE.com

אנו מודים י ולריה Malysheva על קריאה ביקורתית של כתב היד, עזרה ממומחים עם איור 1. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה למחקר רפואי, בריטניה (מר/L007150/1) ואת בריטניה ביוטכנולוגיה מחקר מדעי הביולוגיה המועצה, בריטניה (BB/J004480/1).

לעורכים יש דבר לחשוף.

העיצוב המודולרי של יזם ללכוד Hi-C
יזם ללכוד ויטמינצ'יק מיועדת להעשיר באופן ספציפי ויטמינצ'יק ספריות עבור אינטראקציות מעורבים היזמים. אינטראקציות אלה מהווים רק ערכת משנה של מצדו שהמוצרים בספריה ויטמינצ'יק.
לכידת ויטמינצ'יק בקלות יכול להיות שונה כדי להעשיר את ויטמינצ'יק ספריות עבור כל אזור גנומית או אזורים של עניין על-ידי שינוי שיטת הלכידה. לכידת אזורים יכולים להיות מקטעי גנומית רציף44,45,46,48, משפרי כי כבר זיהו PCHi-C (' הפוך ללכוד Hi-C'35), או DNase אני רגיש אתרי49 . ניתן לכוונן את הגודל של מערכת לכידת בהתאם להיקף ניסיוני. לדוגמה, דריידן ואח. יעד 519 שברי פיתיון במדבריות שלושה גנים הקשורים עם סרטן השד44. מערכת לכידת מאת מרטין ואח. מטרות שני המקטעים גנומית רציפה ('לכידת אזור': 211 אזורים גנומית סה כ; 2,131 שברי ההגבלה) ונבחר היזמים (היזמים ג'ין 3,857)45.
SureSelect ספריות זמינים בטווחי גודל שונה: 1 kb עד 499 kb (5,190 – 4,806), 500 kb ל 2.9 Mb (5,190 – 4,816), ו- 3 Mb ל- 5.9 Mb (5,190 – 4,831). כמו כל לכידת הפרט ביוטין-RNA ארוכה 120 נוקלאוטידים, אלה ללכוד מערכות להכיל לכל היותר 4,158, 24,166 ו- 49,166 בודדים ללכוד הגששים, בהתאמה. זה תואם את 2,079, 12,083, 24,583 הגבלה יישוב שברים, בהתאמה (שימו לב כי המספרים עבור הגבלת קטעים ובכמה מבוסס על ההנחה כי ניתן לעצב שני רגשים לכידת נפרדים עבור כל הגבלה פרגמנט – במציאות עקב רצפים חוזרים, זה לא יהיה המקרה עבור כל הגבלה קטע (ראה גם איור 1B, C), וכתוצאה מכך מספר גבוה יותר של הגבלת targetable קטעים עבור מספר קבוע של הגששים לכידת זמין ).
הפרוטוקול המתואר כאן מבוססת על השימוש באנזים הגבלה עם אתר הכרה bp 6 לחשוף את האינטראקציות ארוכי טווח. שימוש באנזים הגבלה עם אתר הכרה bp 4 עבור רזולוציה גדולה יותר מאינטראקציות מקורב יותר הוא גם אפשרי40,49.
מגבלות של PCHi-C
מגבלה אחת הטבועה של כל כרומוזום קונפורמציה לכידת מבחני היא כי הרזולוציה שלהן נקבע על-ידי האנזים הגבלה בשימוש עבור הדור הספרייה. האינטראקציות המתרחשות בין רכיבי ה-DNA ממוקם על השבר הגבלה זהה הם בלתי נראה מבחני 'C-type'. יתר על כן, PCHi-c, במקרים מסוימים יותר מאשר אתר התחלת תיעתוק אחד יכול להימצא על השבר הגבלה זהה המכילים מקדם, חיישנים בחלק מהמקרים הנמל בשני סימני היסטון דכאניים האקטיביות, ולכן קשה לאתר שבו הרגולציה אלמנטים לתווך את האינטראקציות, וגם כדי לחזות את הפלט הרגולציה של מקדם אינטראקציות. באמצעות אנזימי הגבלה עם ארבעה אתרי זיהוי bp מפחית את הסיכון של בעיה זו אבל בא על חשבון ומעמד ויטמינצ'יק ספריית המורכבות (ויטמינצ'יק ספריות הנוצרת באמצעות אנזימי הגבלה אתר הכרה bp 4 לפחות פי 100 יותר מורכבות Hi-C ספריות שנוצר עם 6 bp זיהוי אתר אנזימי הגבלה), את עלויות עבור רצף הדור הבא.
מגבלה נוספת היא כי פרוטוקול PCHi-C הנוכחי דורש מיליוני תאים כמתחילה חומר, מסלק הניתוח של מקדם אינטראקציות סוגי תאים נדיר. גרסה מותאמת של PCHi-C כדי לאפשר חקירת אנשי קשר יזם אוכלוסיות תאים עם 10,000 עד 100,000 תאים (לדוגמה תאים במהלך התפתחות עוברית מוקדמת או תאי גזע hematopoietic) ולכן יהיה תוספת רבת ערך הלכידה שלום-C בארגז הכלים.
לבסוף, כמו כל שיטות המסתמכות על קיבוע פורמלדהיד, PCHi-C רק רשומות אינטראקציות 'קפואים' בנקודת זמן של קיבעון. לפיכך, כדי ללמוד את קינטיקה ואת הדינמיקה של מקדם אינטראקציות, שיטות כגון רזולוציה סופר תא חי מיקרוסקופ נדרשים לצד PCHi-סי
שיטות לנתח הארגון המרחבי כרומוזום ברזולוציה גבוהה
המורכבות העצום של ספריות אינטראקציה כרומוזומלית אוסר על זיהוי אמין של מוצרים אינטראקציה בין שני קטעים הגבלה ספציפית עם מובהקות סטטיסטית. כדי לעקוף בעיה זו, נעשה שימוש רצף לכידת להעשיר ויטמינצ'יק33,34,40,44 או 3 ג50,51 ספריות עבור אינטראקציות ספציפיות. היתרון העיקרי של שימוש בספריות ספריות מעל 3C ויטמינצ'יק לשלב העשרה הוא כי Hi-C, בניגוד 3C, כולל שלב העשרה למוצרים מקוריים מצדו. כתוצאה מכך, אחוז קריאות חוקיות בספריות PCHi-C הוא כ 10-fold גבוה יותר ב- C-לכידת ספריות50, אשר הכילה בסביבות 5%-8% חוקית קורא לאחר סינון HiCUP. . Sahlen et al. ישירות השוו לכידת-C כדי HiCap, אשר כמו PCHi-C משתמשת ויטמינצ'יק ספריות עבור לכידת העשרה, בניגוד לכידת-C העושה שימוש בספריות 3 ג. בקנה אחד עם הממצאים שלנו, הם מצאו כי לכידת-C ספריות מורכבים בעיקר קטעים משולחים שאינם מחוברים40. בנוסף, ספריות HiCap היה המורכבות גבוהה יותר מאשר ספריות לכידת-C40.
וריאציה של לכידת-C, שנקרא הדור הבא לכידת-C52 (NG לכידת-C) משתמשת oligo אחד בכל קצה קטע הגבלה, כמו שנוצרו קודם לכן ב- PCHi-C33,34, במקום חופפים הגששים בשימוש המקורי פרוטוקול לכידת-C50. פעולה זו מגדילה את אחוז חוקי קריאות בהשוואה לכידת-C בצניעות, אבל NG לכידת-C מעסיקה שני סיבובים רציפים של לכידת העשרה, מספר גבוה יחסית של ה-PCR מחזורי (20 עד 24 מחזורים בסך הכל, לעומת 11 מחזורים בדרך כלל עבור PCHi-C), אשר באופן בלתי נמנע תוצאות במספרים גבוהים יותר של רצף כפילויות והמורכבות ספריה נמוכה יותר. בניסויים הניסיון במהלך אופטימיזציה של PCHi-C, מצאנו כי אחוז ייחודי (קרי, אינם משוכפלים) לקרוא זוגות היה רק בסביבות 15% כאשר השתמשנו מחזורים PCR 19 (13 מחזורים מראש ללכוד + 6 מחזורים שלאחר ללכוד; נתוני לא מוצג), עם זאת אופטימיזציה למספר נמוך יותר של ה-PCR מחזורים, בדרך כלל מניבה 75-90% זוגות קריאה ייחודית. לפיכך, צמצום מספר מחזורים PCR באופן משמעותי מגדיל את כמות נתונים רצף אינפורמטיבי.
שיטה האחרונות משלב שבב עם ויטמינצ'יק להתמקד אינטראקציות כרומוזומלית מתווך על ידי חלבון ספציפי של עניין (HiChIP53). לעומת דשא54, אשר מבוסס על תירוץ דומה, HiChIP נתונים מכיל מספר גדול יותר של קריאות רצף מקיף, המאפשר אינטראקציה גבוהה יותר ביטחון עצמי מתקשר53. יהיה מאוד מעניין להשוות ישירות את HiChIP המתאים, ערכות נתונים ללכוד ויטמינצ'יק פעם הם הופכים לזמינים (לדוגמה HiChIP באמצעות נוגדן נגד Smc1a היחידה cohesin53 עם לכידת Hi-C עבור כל Smc1a מאוגדים הגבלה . שברי) בצד. הטבועה הבדל אחד בין שתי הגישות האלה היא ללכוד ויטמינצ'יק לא להסתמך על immunoprecipitation כרומטין, ולכן הוא מסוגל לחקור את האינטראקציות כרומוזומלית ללא התחשבות תפוסה של חלבון. פעולה זו מאפשרת השוואה של ארגון הגנום 3D ב נוכחות או היעדרות של גורם מסוים הכריכה כפי שימש לזיהוי PRC1 הרגולטור מפתח של העכבר ESC הגנום המרחבי אדריכלות7.
PCHi-C ו- GWAS
הגנום כולו האגודה מחקרים (GWAS) גילו כי גדול מ- 95% של מחלות הקשורות רצף גרסאות ממוקמים באזורים ללא קידוד של הגנום, לעיתים קרובות על מרחקים גדולים כדי חלבונים גנים55. GWAS משתנים לעיתים נמצא בסמיכות DNase אתרי רגיש, אשר מהווה סימן היכר של רצפי עם פוטנציאל לפעילות תקינה. PCHi-C ו- Hi-C ללכוד נעשה שימוש נרחב כדי לקשר היזמים GWAS הסיכון לוקוסים בהפרות סרטן השד44, סרטן המעי הגס48ומחלות אוטואימוניות-35,-45,-46. PCHi-C ללמוד על 17 תא שונים האנושי hematopoietic סוגי נמצאו SNPs הקשורים עם מחלות אוטואימוניות היו מועשר בחיישנים בתאים הלימפה, ואילו רצף משתנים הקשורים עם תכונות מיוחדות טסית דם, תא דם אדום נמצאו בעיקר מקרופאגים, erythroblasts, בהתאמה35,56. לפיכך, רקמות-סוג ספציפי יזם interactomes באמצעות PCHi-C עשוי לעזור להבין את התפקוד ללא קידוד הקשורים למחלה רצף משתנים ולזהות גנים המחלה פוטנציאליים חדשים התערבות טיפולית.
מאפייני האזורים אינטראקציה-יזם
מספר קווי ראיה לקשר מקדם interactomes בקרת ביטוי גנים. ראשית, מספר PCHi-C מחקרים הראו כי אזורים גנומית אינטראקציה עם היזמים של גנים (מאוד) ביטוי מועשרים בסימני המשויך משפר פעילות, כגון H3K27 acetylation p300 איגוד33,34 , 37. מצאנו מתאם חיובי בין רמת ביטוי הגן ואת המספר של משפרי אינטראקציה, רומז ההשפעות מוספים של משפרי תוצאה בביטוי הגנים מוגברת רמות34,35. שנית, שמן הביטוי אתרים (eQTLs) הם מועשרים בחיישנים המחוברים הגנים באותו ביטוי אשר מושפע eQTLs35. שלישית, על ידי שילוב טיול57 ונתונים PCHi-C, קיירנס. et al. מצא כי הטיול כתב גנים מיפוי חיישנים ב העכבר ESCs להראות כתב חזק יותר ביטוי גנים מאשר כתב גנים באתרים אינטגרציה באזורים הלא-יזם-אינטראקציה 58, המציין כי חיישנים בעלי פעילות רגולטורית תעתיק. יחד, ממצאים אלה מראים כי יזם interactomes שנחשפה על-ידי PCHi-C בהעכבר שונים, סוגי תאים אנושיים כולל מפתחות התקינה מודולים עבור בקרת ביטוי גנים.
. זה ראוי לציין כי מוצרי טיפוח טבעיים מייצגים רק חלק קטן (~ 20%) של חיישנים כל באמצעות PCHi-C33,34... . חיישנים אחרים יש תפקידים מבניים או טופולוגי ולא ישירה תעתיק פונקציות רגולטוריות. עם זאת, יש גם ראיות כי PCHi-C עלולה לחשוף את רכיבי ה-DNA עם פונקציית רגולציה לצבור קלאסית משפר סימני. בקו תאי הלימפה אדם, האמרגן BRD7 נמצאה אינטראקציה עם אזור ללא סימני שיפור שהוצג להחזיק משפר פעילות ב כתב ג'ין מבחני33. רכיבים תקינה עם מאפיינים דומים עשויים להיות שופע יותר מאשר כיום מוערך. לדוגמה, מסך מבוססי CRISPR לאלמנטים רגולטוריות DNA אלמנטים מזוהה לא מסומנים רגולטוריות (UREs) לשלוט ביטוי גנים, אבל הם חסרי משפר סימני59.
במקרים אחרים, חיישנים הוכחו הנמל כרומטין סימנים הקשורים עם דיכוי גנים ברמת השעתוק. חיישנים, שמעצבת היזמים מחויב על ידי PRC1 ב ESCs העכבר עסקו רשת מרחבית נרחבת של גנים מודחקים הנושאת שהדיכוי לסמן H3K27me37. בתאים lymphoblastoid האנושי, רכיב מרוחק אינטראקציה עם האמרגן BCL6 מודחקים transgene כתב ג'ין ביטוי33, רומז כי זה אולי מתפקד להדחיק שעתוק BCL6 בהקשרה מקורית.
. חיישנים מועשר עבור תפוסה של החלבון מבודד כרומטין CTCF של ESCs ו- NECs האנושי37 עשוי לייצג מחלקה נוספת של חיישנים באופן קולקטיבי, מראים תוצאות אלה חיישנים הנמל אוסף של פעילויות רגולטוריות ג'ין עדיין כדי להיות מאופיין באופן פונקציונלי.

לצבירת ראיות מרמז כי הארגון תלת מימדי של הגנום ממלא תפקיד פונקציונלי חשוב במגוון תהליכים גרעיניים, כולל גנים הפעלה1,2,3, דיכוי4 ,5,6,7,8, רקומבינציה9,10, תיקון דנ א11,12,שכפול הדנ א13, ו הזדקנות ביולוגית הסלולר14. משפרי מרוחק נמצאים בסמיכות המרחבי היזמים שהם לווסת15,16,17, החיונית לבקרת ביטוי נאות גנים-עתיים. משפר מחיקות להראות כי משפרי דיסטלי הם חיוניים עבור היעד ג'ין שעתוק18,19,20,21,22, והכריח את ' כרומטין לולאה " מדגים כי קשירת מהונדסים בין שיפור של יזם היעד שלה במיקומה Hbb מספיקה לנהוג הפעלת גנים ברמת השעתוק23. עוד יותר, rearrangements הגנום המביאים גנים תחת השליטה של משפרי חוץ רחמי יכול לגרום הפעלת גנים לא הולם, מחלת24,25,26. יחד, דוגמאות אלה ממחישים כי יזם-enhancer אינטראקציות הם חיוניים עבור בקרת גנים, דורשים רגולציה הדוקה כדי להבטיח ביטוי גנים המתאימים. האדם ואת הגנום עכבר אחד מוערך למעגן משפרי מליון. עבור הרוב המכריע של אלה משפרי, היעד גנים אינם ידועים, ויש "חוקי המשחק" בין היזמים משפרי הם הבינו. הקצאת משפרי תעתיק את הגנים היעד שלהם ובכך נשאר אתגר גדול בפענוח בקרת ביטוי גנים יונקים.
ההבנה שלנו של אדריכלות הגנום תלת-ממדי יש כבר מהפכה על ידי המבוא של 3 ג27 (כרומוזום קונפורמציה לכידת) ו שלה משתנים28,29,30,31 . החזקים ביותר של טכניקות אלה, Hi-C (תפוקה גבוהה כרומוזום קונפורמציה לכידת) מיועד לזהות את ההרכב כולו של אינטראקציות כרומוזומלית בתוך אוכלוסיה התא. ספריות-C, בדרך כלל להפיק של מיליוני תאים, מורכבים מאוד במוצרים משוער 1011 מצדו עצמאית בין שברי ~ 4 kb ב הגנום האנושי32. כפי תוצאה, זיהוי לשחזור ואמין של אינטראקציות בין הגבלה בודדים שברים (כגון אלה המכילים של יזם או משפר) ויטמינצ'יק נתונים אינה אפשרית אלא אם ויטמינצ'יק ספריות ותוחלת רצף עמוק במיוחד, אשר אינה פתרון כלכלית עבור מעבדות הכנת ויטמינצ'יק ספריות באופן שגרתי. כדי לעקוף את זה חסרון, פיתחנו יזם ללכוד ויטמינצ'יק להעשיר במיוחד המכיל מקדם מכירות מוצרים מצדו מספריות ויטמינצ'יק. התמקדנו היזמים משתי סיבות. ראשית, יזם-שיפור הקשר הוכחו להיות קריטי עבור רמות ביטוי נאות גנים מחקרים רבים (ראו הפניות לעיל), שנית, כמו היזמים הם במידה רבה הקבועה בין סוגי תאים, באותה מערכת פיתיון לכידת יכול לשמש כדי לחקור המעגלים הרגולציה על פני מספר סוגי תאים והתנאים. הגישה שלנו מסתמך על הכלאה בבית-פתרון של ויטמינצ'יק ספריות עם עשרות אלפי 120mers biotinylated RNA משלים המכילים מקדם מוצרים מצדו של ויטמינצ'יק וללכוד עוקבות על מצופים streptavidin beads מגנטי. התוצאה PCHi-C ספריות עם הרבה מורכבות לעומת הספרייה ויטמינצ'יק המקורי, התמקדות רק הזיהוי של שברי כי מאתרים את היזמים בתדרים הגבוהים באופן משמעותי מופחתת.
השתמשנו PCHi-C מספר של האדם, סוגי תאים העכבר כדי לתרום הבנה טובה יותר של ג'ין בקרת ביטוי על ידי חשיפת יזם דיסטלי ארוכי טווח אזורים אינטראקציה עם פונקציית רגולציה בשם, כמו גם שאינן אקראיות אנשי קשר במרחב תלת-ממדי של הגרעין יזם-יזם. המחקרים מיפוי של מאות אלפי אנשי קשר יזם-משפר על פני רבים תא סוגי33,34,35,36,37,38, 39, זיהה ארגון הגנום המרחבי Polycomb דכאניים מורכבים בתיווך תאי גזע עובריים בעכבר7, הפגינו הטיפולי בקנה מידה גדול של יזם interactomes במהלך התמיינות37, 38 , 39, מקושר ללא קידוד הקשורים למחלה רצף גרסאות ל ג'ין היזמים35.
PCHi-C היא שיטה מתאים באופן אידיאלי כדי למפות את הגנום כולו אנסמבל של רצפי DNA אינטראקציה עם היזמים. גישות קשורים, כגון ללכוד ויטמינצ'יק האזורים גנומית רציפה (ראה דיון) הם השיטה של בחירה כדי להשיג פרופילים אינטראקציה ברזולוציה גבוהה עבור אזורים שנבחרו גנומית. PCHi-C ו- Hi-C ללכוד דומות מאוד ניסיוני נקודת מבט (ההבדל היחידי הוא הבחירה של מערכת לכידת), כך עצות והנחיות אנו מספקים ניתנים ליישום שתי הגישות. כאן, אנו מציגים תיאור מפורט של PCHi-סי אנחנו המתאר את הרציונל ואת העיצוב של ניסוי PCHi-C, מספקים פרוטוקול דור צעד אחר צעד של ספריית PCHi-C, להדגים כיצד ניתן לנטר את האיכות של ספריות PCHi-C-שלבים שונים בפרוטוקול להניב נתונים באיכות גבוהה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1420">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:671px;">16% (vol/vol) paraformaldehyde solution</td>
			<td style="width:140px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:333px;">R1026</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered</td>
			<td style="width:140px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:333px;">F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Low-retention filter tips&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Starlab</td>
			<td style="width:333px;">S1180-3810, S1180-1810, S1180-8810 and S1182-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x PBS pH 7.4</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">70011-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular biology grade water</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:333px;">W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">15568-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IGEPAL CA-630&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:333px;">I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 M NaCl&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">24740-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:333px;">11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Restriction buffer 2 (10x NEBuffer 2)</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">B7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA LoBind tube, 1.5 mL&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:333px;">0030 108.051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA LoBind tube, 2 mL</td>
			<td style="width:140px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:333px;">30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">20% (wt/vol) SDS&#160;&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Bio-Rad Laboratories</td>
			<td style="width:333px;">161-0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20% (vol/vol) Triton X-100&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:333px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HindIII, 100 U/uL</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">R0104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dCTP&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">18253-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dGTP</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">18254-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dTTP&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">18255-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.4 mM Biotin-14-dATP</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">19524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M0210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">10x T4 DNA ligase reaction buffer&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">B0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">100x 10mg/ml Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">B9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA ligase, 1 U/&#956;L&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:333px;">15224-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase A&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Roche</td>
			<td style="width:333px;">10109142001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K, recombinant, PCR grade&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Roche</td>
			<td style="width:333px;">3115836001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 000&#215;g 50 ml centrifuge tube</td>
			<td style="width:140px;">VWR</td>
			<td style="width:333px;">525-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EDTA pH 8.0&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol pH 8.0&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:333px;">P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:333px;">P3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate pH 5.2&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td>S7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quant-iT PicoGreen&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:333px;">P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:140px;">Qiagen</td>
			<td style="width:333px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:140px;">Qiagen</td>
			<td style="width:333px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Restriction buffer 2.1 (10x NEBuffer 2.1)</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">B7202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NheI, 100U/uL</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">R0131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6x16mm vials&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Covaris</td>
			<td style="width:333px;">520045</td>
			<td>For sonication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPRI beads (Agencourt AMPure XP)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:333px;">A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:333px;">65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dATP&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">18252-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">T4 DNA polymerase 3000 units/mL</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">T4 PNK 10000 units/mL</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Klenow exo minus 5000 units/mL&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M0212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Quick ligation reaction buffer&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">B6058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NEB DNA Quick ligase&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE adapter 1.0 (5&#39;-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGC 
			AGGAATGCCGAG-3&#39;)</td>
			<td style="width:140px;">Illumina</td>
			<td style="width:333px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE adapter 2.0 (5&#39;-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT 
			CTTCCGATCT-3&#39;)</td>
			<td style="width:140px;">Illumina</td>
			<td style="width:333px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NEB Phusion PCR kit&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE PCR primer 1.0 (5&#39;-AATGATACGGCGACCACCGA 
			GATCTACACTCTTTCCCTAC 
			ACGACGCTCTTCCGATCT-3&#39;)</td>
			<td style="width:140px;">Illumina</td>
			<td style="width:333px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE PCR primer 2.0 (5&#39;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA 
			GATCGGTCTCGGCATTCCT 
			GCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3&#39;)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Illumina</td>
			<td style="width:333px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PCR strips&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:333px;">410022 and 401425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">SureSelect SSEL TE Reagent ILM PE full adaptor kit&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Agilent Technologies</td>
			<td>931108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">SureSelect custom 3-5.9 Mb library&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:333px;">5190-4831</td>
			<td>custom design mouse or human PCHi-C system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:333px;">65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E220&#160; high-performance focused ultra-sonicator</td>
			<td style="width:140px;">Corvaris</td>
			<td style="width:333px;">E220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

promoter capture hi-c: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions

הארגון תלת מימדי של הגנום הוא מקושר אל תפקידה. לדוגמה, רכיבים רגולטוריות כגון משפרי תעתיק לשלוט התבטאות הגנים היעד שלהם באמצעות מגע פיזי, לעיתים קרובות גישור מרחקים גנומית ניכרת (במקרים מסוימים מאות של kilobases), תוך עקיפת-עתיים גנים הסמוכה. הגנום האנושי בנמלים משפרי מיליון מוערך, הרוב המכריע של אשר יש נודע מטרות הגן. הקצאת אזורים רגולטוריות דיסטלי הגנים שלהם יעד חיוני ובכך להבין בקרת ביטוי גנים. פיתחנו יזם ללכוד Hi-C (PCHi-C) כדי לאפשר זיהוי הגנום כולו אזורים אינטראקציה-יזם הדיסטלי (חיישנים), עבור כל היזמים בניסוי יחיד. PCHi-c, ספריות ויטמינצ'יק מורכב במיוחד מועשר עבור יזם רצפים דרך הבחירה בפתרון היברידית עם אלפי פיתיונות biotinylated RNA משלים הקצוות של כל חלקי של הגבלת המכילים מקדם. המטרה היא ואז נפתחים יזם רצפים זוגם בתדירות גבוהה אינטראקציה כגון משפרי ורכיבים רגולטוריות פוטנציאליים אחרים. לאחר רצף לזווג-end תפוקה גבוהה, מבחן סטטיסטי מוחל על כל שבר ובין אם-לא יזם ההגבלה כדי לזהות חיישנים משמעותית ברמת פרגמנט ההגבלה. השתמשנו PCHi-C כדי ליצור אטלס של אינטראקציות יזם ארוכי טווח עשרות רבות של האדם, סוגי תאים העכבר. מפות interactome אלה יזם תרמו להבנה גדולה יותר של בקרת ביטוי גנים בתרבית של-ידי הקצאת בשם אזורים רגולטוריות הגנים שלהם היעד של חשיפת מועדף המרחבי יזם-יזם אינטראקציה עם רשתות. מידע זה כולל גם רלוונטיות גבוהה להבנת מחלות גנטיות אנושיות וזיהוי של גנים פוטנציאליים מחלה, על-ידי קישור ללא קידוד הקשורים למחלה רצף משתנים או בסמוך שליטה רצפי הגנים היעד שלהם.

Watch this Scientific Journal Video about Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions at JoVE.com

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

רכיבים רגולטוריות דנ א, כגון מוצרי טיפוח טבעיים, לשלוט ביטוי גנים פיזית שעת היעד ג'ין היזמים, לרוב באמצעות אינטראקציות כרומוזומלית ארוכי טווח הנמשכים מרחקים גדולים גנומית. יזם ללכוד Hi-C (PCHi-C) מזהה אינטראקציות משמעותיות בין היזמים ואזורים הדיסטלי, המאפשר את ההקצאה של פוטנציאל רגולטוריות רצפי הגנים היעד שלהם.

יזם לכידת שלום-c: ברזולוציה גבוהה, הגנום כולו פרופיל של אינטראקציות יזם

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

קביעת הגנום כולו של תזמון שכפול יונק ידי מדידת תוכן DNA

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

ניתוח של C-KIT ליגנד האמרגן באמצעות Immunoprecipitation הכרומטין

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

מיפוי הגנום כולו נגיש כרומטין של לימפוציטים מסוג T אנושי ראשוני על ידי האטא ק-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

קביעת הגנום כולו התעתיק הניוון ב Fibroblasts האדם מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

הדור של הגנום כולו כרומטין קונפורמציה לכידת ספריות מעוברים דרוזופילה בחוזקה בשלבים המוקדמים

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

מעקב ברמת הגנום של שגיאות תיעתוק היצורים האיקריוטים

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

השוואה ברזולוציה גבוהה של תדרים קוניוגציה

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

מיפוי גנטי של הבדלי התרמוסבילות בין מינים של שמרים באמצעות הגנום ההופכי לניתוח המייזוליסיטי

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

זיהוי אנשי קשר של משפר-יזם ב Embryoid גופים על-ידי לכידת כרומוזום קונפורמציה כמותית (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...