Name: promoter capture hi-c: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions
Uploaded: 2018-06-28T13:30:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions at JoVE.com

Vi takker Valeriya Malysheva for kritisk lesing av manuskriptet og eksperthjelp med figur 1. Dette arbeidet ble støttet av i Medical Research Council, UK (MR/L007150/1) og UK bioteknologi og Biological Sciences Research Council, UK (BB/J004480/1).

Forfatterne ikke avsløre.

Modulær utforming av arrangøren fange Hi-C
Arrangøren fange Hi-C er utformet for å berike spesielt Hi-C biblioteker for samhandlinger med arrangører. Denne samhandlingen omfatter bare et delsett av hemorroider produkter i et Hi-C-bibliotek.
Fange Hi-C kan enkelt endres for å berike Hi-C biblioteker for genomisk regionen eller regioner av interesse ved å endre fange system. Fange regioner kan være kontinuerlig genomisk segmenter44,45,46,48, enhancers som har blitt identifisert i PCHi-C (omvendt fange Hi-C35) og DNase jeg overfølsom nettsteder49 . Størrelsen på systemet kan justeres avhengig av eksperimentelle området. For eksempel Dryden et al. målrette 519 agn fragmenter i tre genet ørkener tilknyttet bryst kreft44. Fange systemet av Martin et al. mål både kontinuerlig genomisk segmenter ('Regionen fange': 211 genomisk regioner totalt; 2,131 begrensning fragmenter) og valgt arrangører (3,857 gen arrangører)45.
SureSelect bibliotek er tilgjengelig i forskjellige størrelse områder: 1 kb 499 KB (5 190-4,806), 500 kb 2.9 MB (5 190-4,816), og 3 Mb til 5,9 Mb (5 190-4,831). Hver enkelt fange biotin-RNA er 120 nukleotider lang, disse fange systemer innkvartere maksimalt 4,158, 24,166 og 49,166 personlige fange sonder, henholdsvis. Dette tilsvarer 2,079, 12,083 og 24,583 målrettet begrensning fragmenter, henholdsvis (Merk at tallene for begrensning fragmenter er nedre basert på antagelsen at to individuelle fange sonder kan være konstruert for hver begrensning fragment — i virkeligheten på grunn av gjentatte sekvenser vil dette ikke være tilfelle for hver begrensning fragmentere (se også figur 1B, C), som resulterer i mange av targetable begrensning for et konstant antall tilgjengelige fange sonder ).
Protokollen beskrevet her er basert på bruk av en begrensning enzym med en 6 bp anerkjennelse webområdet å avdekke langtrekkende interaksjoner. Bruke en begrensning enzym med en 4 bp anerkjennelse webområdet for høyere oppløsning på mer proksimale interaksjoner er også mulig40,49.
Begrensningene for PCHi-C
En iboende begrensning av alle kromosom konformasjon fange analyser er at oppløsningen bestemmes av begrensning enzymet brukes til generering av biblioteket. Samhandlinger som oppstår mellom DNA elementer på samme begrensning fragmentet er usynlige for 'C-type-analyser. Videre, i PCHi-C, i noen tilfeller flere transkripsjon startwebstedet kan være plassert på samme promoter inneholder begrensning fragmentet og PIRs i noen tilfeller havn både aktive og undertrykkende histone merker, gjør det vanskelig å finne som regulatoriske elementer megle interaksjoner, og forutsi regulatoriske utdataene for arrangøren interaksjoner. Bruker begrensningen enzymer med 4 bp anerkjennelse nettsteder dette problemet men kommer på bekostning av vesentlig økt Hi-C biblioteket kompleksitet (Hi-C biblioteker generert med 4 bp anerkjennelse området begrensning enzymer er minst 100 ganger mer komplekse enn Hi-C biblioteker generert med 6 bp anerkjennelse området begrensning enzymer) og tilhørende kostnader for neste generasjons sekvensering.
En annen begrensning er at den nåværende PCHi-C-protokollen krever millioner av celler som starter materiale, slik at analyse av arrangøren interaksjoner i sjeldne celletyper. En modifisert versjon av PCHi-C for å aktivere avhør av arrangøren kontakter i celle populasjoner med 10 000 til 100.000 celler (for eksempel celler under embryonale utviklingen eller blodkreft stamceller) vil derfor være et verdifullt tillegg til fange Hei-C verktøykasse.
Til slutt, som alle metoder som er avhengige av formaldehyd fiksering, PCHi-C bare registrerer interaksjoner som er "frosset" på tidspunktet for fiksering. Dermed for å studere kinetics og dynamikken i Promotoren samhandling, er metoder som Super-oppløsning levende celle mikroskopi nødvendig sammen med PCHi-C.
Metoder for å analysere romlige kromosom organisasjon med høy oppløsning
Store kompleksiteten av chromosomal samhandling biblioteker forbyr pålitelig identifikasjon av samspillet mellom to spesifikk begrensning fragmenter med statistiske betydning. For å omgå dette problemet, har sekvens fangst blitt brukt til å berike Hi-C33,34,40,44 eller 3 C50,51 biblioteker for spesifikke interaksjoner. Den største fordelen ved hjelp Hi-C biblioteker over 3C biblioteker for berikelse trinn er at Hi-C, i motsetning til 3C, inneholder en berikelse trinn for ekte ligation produkter. Som en konsekvens, er ønsket gyldig leser i PCHi-C biblioteker ca 10-fold høyere enn i fangst-C biblioteker50, som inneholdt rundt 5-8% gyldig leser etter HiCUP filtrering. Sahlen et al. sammenlignet direkte fangst-C for å HiCap, som i likhet PCHi-C bruker Hi-C biblioteker for fangst berikelse, i motsetning Capture-C som bruker 3 C-biblioteker. I samsvar med våre funn, fant de at fange-C biblioteker er hovedsakelig sammensatt av un ligated fragmenter40. I tillegg hadde HiCap biblioteker en høyere kompleksitet enn fangst-C biblioteker40.
En variant av fangst-C, kalt neste generasjons fangst-C52 (NG fangst-C) bruker en oligo per begrensning fragment slutten, tidligere etablert i PCHi-C33,34, i stedet for overlappende sonder brukes i opprinnelige Fange-C protokoll50. Dette øker andelen gyldig leser forhold til fange-C beskjedent, men NG fangst-C sysselsetter sekvensiell budrundene fange berikelse, og et relativt høyt antall PCR sykluser (20-24 sykluser totalt sammenlignet 11 sykluser vanligvis PCHi-c), som uunngåelig resulterer i høyere antall sekvens duplikater og lavere biblioteket kompleksitet. I rettssaken eksperimenter i optimalisering av PCHi-C, fant vi at prosentandelen av unike (dvs. ikke dupliseres) lese par var rundt bare 15% når vi brukte 19 PCR sykluser (13 sykluser før fange + 6 sykluser etter fange; dataene ikke), men optimalisering til et lavere antall PCR sykluser, vanligvis gir 75 – 90% unike Les par. Dermed øker reduserer PCR sykluser vesentlig mengden informativ sekvens data.
En nyere metode kombinerer ChIP med Hi-C for å fokusere på chromosomal interaksjoner formidlet av et bestemt protein av interesse (HiChIP53). Sammenlignet med ChIA-PET54, som er basert på en lignende begrunnelse, inneholder HiChIP dataene mange informative sekvens lyder, slik at høyere interaksjon ringer53. Det vil være svært interessant for direkte sammenligne de tilsvarende HiChIP og fange Hi-C datasett de blir når tilgjengelig (for eksempel HiChIP bruke et antistoff mot cohesin enhet Smc1a53 med fange Hi-C for alle Smc1a bundet begrensning fragmenter) side ved side. En iboende forskjellen mellom disse to tilnærmingene er at fange Hi-C ikke er avhengig av chromatin immunoprecipitation, og derfor er i stand til å forhøre chromosomal interaksjoner uansett protein innkvartering. Dette gjør sammenligning av 3D genomet organisasjon på tilstedeværelse eller fravær av momentet bindende som er brukt til å identifisere PRC1 som en viktig regulator av musen ESC romlige genomet arkitektur7.
PCHi-C og GWAS
Genomet hele association studier (GWAS) har avdekket at mer enn 95% av sykdomsassosierte sekvens varianter finnes i ikke-koding regioner i genomet, ofte på store avstander til protein-koding gener55. GWAS varianter er ofte funnet i nærheten DNase jeg overfølsom områder, som er et kjennetegn på sekvenser med potensielle regulatoriske aktivitet. PCHi-C og fange Hi-C har blitt brukt mye koble arrangører til GWAS risiko loci innblandet i brystkreft kreft44, tykktarmskreft48og autoimmune sykdommer35,45,46. En PCHi-C studier på 17 ulike menneskelige blodkreft celle typer funnet SNPs tilknyttet autoimmun sykdom ble anriket på PIRs i lymfoide celler, mens sekvens varianter tilknyttet blodplater og røde blodlegemer særtrekk fant hovedsakelig i makrofager og erythroblasts, henholdsvis35,56. Dermed vev-type bestemt arrangøren interactomes avdekket ved PCHi-C kan bidra til å forstå funksjonen av ikke-koding sykdomsassosierte sekvens varianter og identifisere nye potensielle sykdom gener for terapeutisk intervensjon.
Egenskapene til arrangøren-samspill regioner
Flere linjer av bevis link arrangøren interactomes gene expression kontroll. Først flere PCHi-C studier har vist at genomisk regioner samarbeidsstil arrangører av (svært) uttrykt gener er beriket i merker tilknyttet enhancer aktivitet, for eksempel H3K27 acetylation og p300 bindende33,34 , 37. vi fant en positiv korrelasjon mellom gene expression nivå og antall samspill enhancers, antyder at additiv effekter av enhancers resultere i økt genuttrykk nivåer34,35. Andre naturlig forekommende uttrykk kvantitative egenskap loci (eQTLs) er beriket i PIRs som er koblet til samme gener som uttrykk er påvirket av eQTLs35. Tredje ved å integrere tur57 og PCHi-C data, funnet Cairns et al. at turen reporter gener tilordning til PIRs i musen ESCs vise sterkere reporter genuttrykk enn reporter gener på integrering steder i ikke-arrangøren-samspill regioner 58, som angir at PIRs har transcriptional regulatoriske aktivitet. Sammen tyder disse funnene på at selskapet interactomes avdekket ved PCHi-C i forskjellige mus og menneskelige celletyper inkluderer viktige forskrifter moduler for gene expression kontroll.
Det er verdt å merke seg at enhancers representerer bare en liten brøkdel (~ 20%) av alle PIRs avdekket ved PCHi-C33,34. Andre PIRs kan ha strukturelle eller topologisk roller i stedet for direkte transcriptional regulatoriske funksjoner. Men er det også bevis for at PCHi-C kan avdekke DNA elementer med regelverket som ikke havn klassisk enhancer merker. I en human lymfoide celle linje, ble BRD7 selskapet funnet for å samhandle med et område uten enhancer merker som ble vist å ha enhancer aktivitet reporter genet analyser33. Regulatoriske elementer med lignende egenskaper kan være mer rikelig enn er verdsatt. For eksempel markerer en CRISPR-basert skjerm for regulatoriske DNA elementer identifisert umerkede regulatoriske elementer (utfall) kontrollere genuttrykk er blottet for enhancer59.
I andre tilfeller har PIRs vist å havn chromatin merker knyttet transcriptional undertrykkelse. PIRs og samspill arrangører bundet av PRC1 i musen ESCs var engasjert i et omfattende romlige nettverk av fortrengte gener bærer det undertrykkende merke H3K27me37. I menneskelig lymphoblastoid celler, en Fjern element samspill med BCL6 arrangøren undertrykt transgene reporter gene expression33, tyder på at det kan fungere for å undertrykke BCL6 transkripsjon i sin opprinnelige sammenheng.
PIRs beriket for bruk av chromatin isolator protein CTCF i menneskelig ESCs og NECs37 kan representere enda en klasse av PIRs. Samlet tyder disse resultatene på at PIRs havn samling genet regulatoriske aktiviteter ennå å være funksjonelt preget.

Samler bevis antyder at tredimensjonale organiseringen av genomet spiller en viktig funksjonelle rolle i en rekke kjernefysisk prosessene, inkludert gene aktivisering1,2,3, undertrykkelse4 ,5,6,7,8, rekombinasjon9,10, DNA reparasjon11, DNA replikering12,13, og mobilnettet senescence14. Fjern enhancers finnes i romlig nærhet til arrangørene de regulerer15,16,17, som er avgjørende for riktig spatio-temporale gene expression kontroll. Enhancer slettinger viser at distale enhancers er avgjørende for målet genet transkripsjon18,19,20,21,22og "tvunget chromatin looper" viser at utviklet deling mellom en enhancer og dens mål formidler i Hbb locus er tilstrekkelig til å kjøre transcriptional aktivisering23. Videre kan genomet rearrangements som bringer gener under kontroll av ektopisk enhancers resultere i upassende genet aktivisering og sykdom24,25,26. Sammen viser disse eksemplene at arrangøren-enhancer interaksjoner er avgjørende for gen kontroll og krever tett forskrift for å sikre riktig genuttrykk. Menneskelige og mus genomer hver anslås for å havn rundt en million enhancers. De aller fleste av disse enhancers, målet gener er ukjent og 'engasjementsreglene' mellom arrangørene og enhancers er dårlig forstått. Tilordne transcriptional enhancers til sine mål gener dermed fortsatt en stor utfordring i tyde pattedyr gene expression kontroll.
Vår forståelse av tredimensjonale genomet arkitektur er blitt revolusjonert av innføring av 3C27 (kromosom konformasjon fange) og dens varianter28,29,30,31 . Den mektigste av disse teknikkene, Hi-C (høy gjennomstrømning kromosom konformasjon fange) er utformet for å identifisere hele ensemblet av chromosomal interaksjoner i cellen innbyggere. Hei-C biblioteker, vanligvis genereres fra millioner av celler, er svært kompleks med en beregnede 1011 uavhengige ligation produkter mellom ~ 4 kb fragmenter i det menneskelige genom32. Som en konsekvens, pålitelig og reproduserbar identifikasjon av samspillet mellom individuelle begrensning fragmenter (som de som inneholder en formidler eller enhancer) fra er Hi-C data ikke mulig med mindre Hi-C biblioteker er utsatt for ultra-dypt sekvensering, som er ikke en økonomisk løsning for laboratorier forbereder Hi-C biblioteker rutinemessig. For å omgå dette brist, utviklet vi Promoter fange Hi-C for å berike spesielt promoter inneholder ligation produkter fra Hi-C biblioteker. Vi fokusert på arrangører av to grunner. Først selskapet-enhancer kontakter har vist seg å være avgjørende for riktig gene expression nivåer i en rekke studier (se referanser ovenfor), og andre som arrangører er i stor grad invariant mellom celletyper, samme fange agn system kan brukes til å forhøre det regulatoriske kretsløpet over flere celletyper og betingelser. Vår tilnærming er avhengig av-løsning hybridisering Hi-C biblioteker med titusenvis av biotinylated RNA 120mers utfyllende til arrangøren inneholder Hi-C ligation produkter og påfølgende fangst streptavidin-belagt magnetiske perler. Dette resulterer i PCHi-C biblioteker med mye redusert kompleksitet i forhold til den opprinnelige Hi-C biblioteket, fokuserer bare på identifisering av fragmenter som er samskrevet til arrangører ved betydelig høye frekvenser.
Vi har brukt PCHi-C i en rekke menneskelige og mus celletyper å bidra til en bedre forståelse av gene expression kontroll av avdekke langtrekkende distale promoter samspill regioner med antatte regulatoriske funksjonen, samt ikke tilfeldig Promotoren-arrangøren kontakter i tredimensjonale løpet av kjernen. Studier har kartlagt hundretusener av arrangøren-enhancer kontakter over mange celle typer33,34,35,36,37,38, 39, identifisert Polycomb undertrykkende komplekse-mediert romlige genomet organisasjon i mus embryonale stamceller7, viste store rewiring av arrangøren interactomes under differensiering37, 38 , 39og koblet ikke-koding sykdomsassosierte sekvens varianter til genet arrangører35.
PCHi-C er en godt egnet metode for å tilordne genomet hele ensemblet av DNA-sekvenser samarbeidsstil arrangører. Relaterte tilnærminger, som fange Hi-C kontinuerlig genomisk regioner (se diskusjon) er metoden for valg å få høyoppløselige samhandling profiler for utvalgte genomisk regioner. PCHi-C og fange Hi-C er svært like fra en eksperimentelle synspunkt (den eneste forskjellen er valg av systemet), slik at råd og retningslinjer tilbyr gjelder for begge tilnærminger. Her presenterer vi en detaljert beskrivelse av PCHi-C. Vi skissere begrunnelsen og utformingen av en PCHi-C eksperiment, gi en trinnvis PCHi-C biblioteket generasjon protokoll, og illustrerer hvordan kvaliteten på PCHi-C biblioteker kan overvåkes på ulike trinn i protokollen for å gi høy kvalitet dataene.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1420">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:671px;">16% (vol/vol) paraformaldehyde solution</td>
			<td style="width:140px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:333px;">R1026</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered</td>
			<td style="width:140px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:333px;">F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Low-retention filter tips&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Starlab</td>
			<td style="width:333px;">S1180-3810, S1180-1810, S1180-8810 and S1182-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x PBS pH 7.4</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">70011-036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular biology grade water</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:333px;">W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">15568-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IGEPAL CA-630&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:333px;">I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 M NaCl&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">24740-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:333px;">11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Restriction buffer 2 (10x NEBuffer 2)</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">B7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA LoBind tube, 1.5 mL&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:333px;">0030 108.051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA LoBind tube, 2 mL</td>
			<td style="width:140px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:333px;">30108078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">20% (wt/vol) SDS&#160;&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Bio-Rad Laboratories</td>
			<td style="width:333px;">161-0418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20% (vol/vol) Triton X-100&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:333px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HindIII, 100 U/uL</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">R0104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dCTP&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">18253-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dGTP</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">18254-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dTTP&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">18255-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.4 mM Biotin-14-dATP</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">19524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M0210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">10x T4 DNA ligase reaction buffer&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">B0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">100x 10mg/ml Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">B9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA ligase, 1 U/&#956;L&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:333px;">15224-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase A&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Roche</td>
			<td style="width:333px;">10109142001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K, recombinant, PCR grade&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Roche</td>
			<td style="width:333px;">3115836001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 000&#215;g 50 ml centrifuge tube</td>
			<td style="width:140px;">VWR</td>
			<td style="width:333px;">525-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EDTA pH 8.0&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol pH 8.0&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:333px;">P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:333px;">P3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate pH 5.2&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td>S7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quant-iT PicoGreen&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:333px;">P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:140px;">Qiagen</td>
			<td style="width:333px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:140px;">Qiagen</td>
			<td style="width:333px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Restriction buffer 2.1 (10x NEBuffer 2.1)</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">B7202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NheI, 100U/uL</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">R0131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6x16mm vials&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Covaris</td>
			<td style="width:333px;">520045</td>
			<td>For sonication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPRI beads (Agencourt AMPure XP)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:333px;">A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:333px;">65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dATP&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:333px;">18252-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">T4 DNA polymerase 3000 units/mL</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">T4 PNK 10000 units/mL</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Klenow exo minus 5000 units/mL&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M0212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Quick ligation reaction buffer&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">B6058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NEB DNA Quick ligase&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE adapter 1.0 (5&#39;-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGC 
			AGGAATGCCGAG-3&#39;)</td>
			<td style="width:140px;">Illumina</td>
			<td style="width:333px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE adapter 2.0 (5&#39;-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT 
			CTTCCGATCT-3&#39;)</td>
			<td style="width:140px;">Illumina</td>
			<td style="width:333px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NEB Phusion PCR kit&#160;</td>
			<td style="width:140px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:333px;">M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE PCR primer 1.0 (5&#39;-AATGATACGGCGACCACCGA 
			GATCTACACTCTTTCCCTAC 
			ACGACGCTCTTCCGATCT-3&#39;)</td>
			<td style="width:140px;">Illumina</td>
			<td style="width:333px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE PCR primer 2.0 (5&#39;-CAAGCAGAAGACGGCATACGA 
			GATCGGTCTCGGCATTCCT 
			GCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3&#39;)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Illumina</td>
			<td style="width:333px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PCR strips&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:333px;">410022 and 401425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">SureSelect SSEL TE Reagent ILM PE full adaptor kit&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Agilent Technologies</td>
			<td>931108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">SureSelect custom 3-5.9 Mb library&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:333px;">5190-4831</td>
			<td>custom design mouse or human PCHi-C system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:333px;">65601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E220&#160; high-performance focused ultra-sonicator</td>
			<td style="width:140px;">Corvaris</td>
			<td style="width:333px;">E220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

promoter capture hi-c: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions

Tredimensjonale organiseringen av genomet er knyttet til sin funksjon. For eksempel styre regulatoriske elementer som transcriptional enhancers spatio-temporale uttrykk for sine mål gener gjennom fysisk kontakt, ofte bygge bro betydelig (i noen tilfeller hundrevis av kilobases) genomisk avstander og omgåelsen nærliggende gener. Det menneskelige genomet havner en anslagsvis én million enhancers, de aller fleste som har ukjente genet mål. Tilordne distale regulatoriske regioner til sine mål gener er derfor avgjørende å forstå gene expression kontroll. Vi utviklet selskapet fange Hi-C (PCHi-C) for å aktivere genomet hele påvisning av distale promoter-samspill regioner (PIRs), alle arrangører i ett enkelt eksperiment. I PCHi-C, er svært komplekse Hi-C biblioteker spesielt beriket for arrangøren sekvenser gjennom i-løsning hybrid utvalg med tusenvis av biotinylated RNA agn utfyllende til endene av alle promoter inneholder begrensning fragmenter. Målet er å deretter rullegardinmenyen promoter sekvenser og deres hyppige samhandling partnere som enhancers og andre potensielle regulatoriske elementer. Etter høy gjennomstrømming sammen-end sekvensering brukes en statistisk test hver promoter-samskrevet begrensning fragment å identifisere viktige PIRs på fragment begrensningsnivå. PCHi-C har vi brukt til å generere en atlas av langtrekkende Promotoren samhandling i dusinvis av menneskelige og mus celletyper. Disse arrangøren interactome kartene har bidratt til en større forståelse av pattedyr gene expression kontroll av tilordne antatte regulatoriske regioner til sine mål gener og avslørende fortrinnsrett romlige promoter-arrangøren samhandling nettverk. Denne informasjonen også har høy relevans å forstå menneskelig genetisk sykdom og identifisering av potensielle sykdom gener, ved å koble ikke-koding sykdomsassosierte sekvens varianter i eller nær kontroll sekvenser til sine mål gener.

Promotoren fange Hi-C er brukt til å berike musen7,34,36,39 og menneskelige33,35,37,38 Hi-C biblioteker for Promotoren samhandling. En lignende protokoll (kalt HiCap) har blitt beskrevet av Sandberg gruppe40. Figur 1A viser skjematisk arbeidsflyten for arrangøren fange Hi-C. I protokollen beskrevet her, er Hi-C biblioteker generert ved hjelp i kjernen ligation41, som resulterer i en betydelig redusert antall falske ligation produkter42. PCHi-c, svært komplekse musen eller menneskelig Hi-C biblioteker er utsatt for-løsning hybridisering og fange 39,021 biotinylated RNAs utfyllende 22,225 musen promoter inneholder HindIII begrensning fragmenter eller 37,608 biotinylated RNAs målretting 22,076 menneskelige promoter inneholder HindIII begrensning fragmenter, henholdsvis. Arrangøren som inneholder begrensningen fragmenter kan være målrettet på en eller begge sider av personlige biotinylated RNAs (figur 1B). Vi fant at erobringen av begge ender bedre dekning av personlige arrangører (figur 1 c, rå sekvens leser) nesten to ganger, som forventet. Således, når mulig (dvs. i ikke-gjentatte områder), anbefaler vi for å bruke biotinylated RNAs utfyllende til begge ender av en begrensning fragment å bli tatt.
For å vurdere PCHi-C biblioteket kvalitet på et tidlig tidspunkt under bibliotek forberedelse, utfører vi to kontroller etter DNA ligatur og rensing, som beskrevet tidligere31. Først er å bruke bestemte primer par for å forsterke ligation produkter som 3 C27. Vi bruker primer par (tabell 1) for å forsterke celle-type konstant langtrekkende ligation produkter, eksempel mellom Myc genet og de kjente enhancers ligger ca 2 Mb unna (figur 2A) eller mellom gener av Hist1 locus ( atskilt med 1,5 Mb), og mellom to regioner lineær nærhet ('kort rekkevidde control').
Den andre kvalitetskontrollen er gjennomført for å fastslå effektiviteten av biotin innlemmelse under Klenow-mediert utfylling av begrensning området overheng med biotin-dATP. Vellykket Klenow utfylling og påfølgende Butt-end ligation resultatene i forsvinningen av den opprinnelige begrensning området mellom DNA-molekyler ligation produktet, og i tilfelle HindIII i dannelsen av en ny NheI anerkjennelse webområdet (figur 2B ). HindIII NheI fordøyd ligation produktet er en direkte presentasjon av biotin innlemmelse effektivitet. Et dårlig kvalitet Hi-C bibliotek viser høy HindIII fordøyelsen, mens høy kvalitet bibliotekene har nesten fullstendig NheI fordøyelsen av hemorroider produkter (figur 2B).
Etter Hi-C biblioteket forberedelse (dvs. etter biotin-streptavidin trekke ned av størrelse valgt Hi-C ligation produkter, kortet ligatur og før fange PCR), er integritet og størrelse distribusjon av Hi-C biblioteket vurdert ved Bioanalyzer (figur 2 C). den samme kontrollen utføres på slutten av PCHi-C biblioteket forberedelse (dvs. etter hybridisering erobringen av arrangøren inneholder ligation produkter og etter fangst PCR). Sammenligning av Hi-C og PCHi-C Bioanalyzer profiler viser at som forventet, Hi-C bibliotekene er mye mer konsentrert enn tilsvarende PCHi-C bibliotekene, men størrelsesDistribusjon av bibliotekene er svært lik, som angir at fange trinn i PCHi-C innføre ikke en størrelse bias (figur 2C, D).
Etter par-end sekvensering, den PCHi-C lest tilordnes, kontrollert og filtrert bruke HiCUP rørledning43. Høykvalitets PCHi-C biblioteker inneholder mellom 70-90% "gyldig parene" (dvs. sammen-end sekvens leser mellom to begrensning fragmenter som ikke er nabolandet på lineær genomisk kartet; Figur 3A, B). Bruker i kjernen ligation protokoll41,42, lest prosentandelen av trans par (dvs. sammen-end sekvens leser mellom to begrensning fragmenter som er plassert på ulike kromosomer) er vanligvis lav, mellom 5 og 25%, reflekterer kromosom territorier, og viser godt bibliotek kvalitet. Direkte sammenligning av andelen "gyldig parene" mellom Hi-C biblioteker og deres tilsvarende PCHi-C biblioteker35, viser at i alle tilfeller prosentandelen av gyldig parene er høyere i PCHi-C bibliotekene (figur 3B). Dette er ledsaget av en reduksjon i prosent for ugyldig 'samme fragmentere interne"leser i PCHi-C (Figur 3 c). Dette er forventet, fange trinnet ikke bare beriker for arrangøren inneholder ligation produkter, men også for begrensning fragment ender, på grunn av plasseringen av fange oligos om begrensning fragmenter (se figur 1B).
Etter HiCUP filtrering, bestemmer vi fange effektiviteten. PCHi-C biblioteker inneholder tre typer gyldig sekvens leser etter HiCUP filtrering: 1.) promoter: genomet leser (dvs. leser mellom et fanget promoter fragment og et ikke-arrangøren HindIII begrensning fragment overalt i genomet) 2.) promoter: arrangøren leser (leser mellom to fanget promoter fragmenter) 3.) genom: genomet leser (bakgrunn Hi-C ligation produkter der ingen av hemorroider produktet tilordnes en fanget promoter). Disse forkastes før nedstrøms analyser.
Høykvalitets PCHi-C biblioteker har fange effektivitet (summen av 1 og 2 over) mellom 65 – 90% (figur 3D). En direkte sammenligning til Hi-C biblioteker viser at PCHi-C resulterer i en ~ 15-fold berikelse for arrangøren inneholder ligation produkter (figur 3D), i noen tilfeller 17-fold. Dette er nær den hypotetiske maksimalt (19.6-fold) berikelse for PCHi-C, som er avhengig av andelen genomet begrensning fragmenter dekket av fange systemet. Større berikelse kan oppnås ved å utforme fange systemer målretting færre restriksjoner fragmenter44,45,46.
Analyse av arrangøren interactomes demonstrerer celle type og avstamning-spesifisitet33,34,35, uttales endringer under differensiering37,38,39 . Tallene 4 og 5 viser eksempler på avstamning spesifisitet og differensiering dynamikk på bestemte arrangørene. For eksempel ALAD er constitutively uttrykt i alle celler, men uttrykket er upregulated erythroblasts47. ALAD selskapet kontakter flere distale fragmenter i alle blodkreft cellene og han ekstra samspill i erythroblasts (Figur 4). IL-8 viser ingen statistisk signifikante interaksjoner i B-celler, svært få interaksjoner i T celler og dusinvis av interaksjoner i celle av myeloide linjen, inkludert celle-type spesifikke interaksjoner i megakaryocytes, monocytter og nøytrofile ( Figur 5). Disse eksemplene viser hvordan PCHi-C kan brukes til å løse celle-type spesifikke interactomes og identifisere promoter-samspill områder med regulatoriske potensial.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig1.jpg"> Figur 1 : Promoter fange Hi-C begrunnelsen og fange agn design. (A) skjematisk arbeidsflyten av PCHi-C. I kjernen ligation Hi-C41,42 (I) etterfulgt av-løsning hybridisering med biotinylated RNA agn (II) målretting begrensning fragmenter av alle menneskelige (avbildet her) eller mus gen arrangører (III). (B) agn design for PCHi-C. Biotinylated RNA fange agn (røde buede linjer) er utformet mot endene av arrangøren inneholder begrensning fragmenter (grå, Merk at arrangøren sekvensene seg (rød) bare nås med RNA fange agn hvis de ligger på begrensning fragment ender). Hemorroider produkter promoter inneholder begrensning fragmenter (grå) og deres samspill begrensning fragmenter (gul og grønn) er isolert gjennom sekvens-komplementaritet hybridisering mellom RNA agn og DNA mål, og påfølgende biotin-streptavidin pulldown, som vist i A. (C) sammenligning av PCHi-C fange effektivitet for arrangøren inneholder begrensning fragmenter målrettet av en RNA agn fange sonde vs to RNA agn fange sonder (se skjematisk i B). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig2.jpg"> Figur 2 : PCHi-C før sekvensering kvalitetskontroll. (A) igjen, skjematisk av romlige sidestilling mellom selskapet og PIR, noe som resulterer i et Hi-C ligation produkt som består av et promoter inneholder begrensning fragment (grå, formidler sekvens i rødt) og en PIR begrensning fragment (gul). Høyre, DNA gel geleelektroforese viser eksempler på Hi-C ligation produkter forsterket bruker bestemte primer parene (som vist skjematisk til venstre). (B) igjen, HindIII, NheI og HindIII/NheI begrensning eksemplene fordøyer Hi-C ligation produkter (PCR produkter vises i A). Høyre, skjematisk av DNA sekvens etter Hi-C ligation etter mislykket (øverst) eller vellykket (nederst) dNTP Klenow utfylling av begrensning veikryss og påfølgende hemorroider. (C) representant Hi-C biblioteket bioanalyzer profil (1/5 fortynning). (D) representant PCHi-C biblioteket bioanalyzer profil (ingen utvanning). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig3.jpg"> Figur 3 : PCHi-C etter sekvensering kvalitetskontroll. (A) sammenligning av prosentandel gyldig sekvens lese par etter HiCUP43 behandling i PCHi-C vs tilsvarende Hi-C-bibliotek (data fra Javierre et al., 201635). (B) representant HiCUP PCHi-C resultatet viser gyldig lese par og andre rekkefølge kategorier som forkastes før nedstrøms analyser (data fra Javierre et al., 201635). (C) sammenligning av 'samme fragment interne' leser etter HiCUP på PCHi-C vs tilsvarende Hi-C-bibliotek (data fra Javierre et al., 201635). (D) sammenligning av prosentandel leser med agnet promoter fragmenter (fange effektivitet) i PCHi-C vs tilsvarende Hi-C biblioteker (data fra Javierre et al., 201635). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig4.jpg"> Figur 4: ALAD PCHi-C profil i blodkreft menneskeceller. Promotoren samhandling myelogen celletyper vises som blå buer, og formidler interaksjoner lymfoide celletyper vises som purpur buer. Erythroblast-spesifikke interaksjoner indikeres av røde piler (data fra Javierre et al., 201635). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57320/57320fig5.jpg"> Figur 5 : IL8 PCHi-C profil i blodkreft menneskeceller. Promotoren samhandling myelogen celletyper vises som blå buer, og formidler interaksjoner lymfoide celletyper vises som purpur buer. Monocytt-spesifikke interaksjoner angis med grønne pilene, nøytrofile-spesifikke interaksjoner indikeres av røde piler og en megakaryocyte-spesifikke interaksjon angis av en brun pil (data fra Javierre et al., 201635). <a href="/files/ftp_upload/57320/57320fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="9">Menneskelige</td>
		</tr>
<tr>
<td>navn</td>
			<td colspan="3">Sekvens</td>
			<td>Kromosom</td>
			<td>Strand</td>
			<td>Start GRCh38/hg38</td>
			<td>Slutten GRCh38/hg38</td>
			<td>Primer kombinasjoner å teste 3C interaksjoner og biotin inkorporering</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS AHF64 Dekker</td>
			<td colspan="3">GCATGCATTAGCCTCTGCTGTTCTCTGAAATC</td>
			<td>11</td>
			<td>+</td>
			<td>116803960</td>
			<td>116803991</td>
			<td>sammen med hs AHF66 Dekker</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS AHF66 Dekker</td>
			<td colspan="3">CTGTCCAAGTACATTCCTGTTCACAAACCC</td>
			<td>11</td>
			<td>+</td>
			<td>116810219</td>
			<td>116810248</td>
			<td>sammen med hs AHF64 Dekker</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS MYC locus</td>
			<td colspan="3">GGAGAACCGGTAATGGCAAA</td>
			<td>8</td>
			<td>-</td>
			<td>127733814</td>
			<td>127733833</td>
			<td>bruke i kombinasjon med hs MYC +1820 eller hs MYC-538</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS MYC +1820</td>
			<td colspan="3">AAAATGCCCATTTCCTTCTCC</td>
			<td>8</td>
			<td>+</td>
			<td>129554527</td>
			<td>129554547</td>
			<td>sammen med hs MYC locus</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS MYC-538</td>
			<td colspan="3">TGCCTGATGGATAGTGCTTTC</td>
			<td>8</td>
			<td>-</td>
			<td>127195696</td>
			<td>127195716</td>
			<td>sammen med hs MYC locus</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS HIST1 F</td>
			<td colspan="3">AAGCAGGAAAAGGCATAGCA</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>26207174</td>
			<td>26207193</td>
			<td>sammen med hs HIST1 R</td>
		</tr>
<tr>
<td>HS HIST1 R</td>
			<td colspan="3">TCTTGGGTTGTGGGACTTTC</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>27771575</td>
			<td>27771594</td>
			<td>sammen med hs HIST1 F</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="9">Mus</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">Sekvens</td>
			<td>Kromosom</td>
			<td>Strand</td>
			<td>Start GRCm38/mm10</td>
			<td>Slutten GRCm38/mm10</td>
			<td>Primer kombinasjoner å teste 3C interaksjoner og biotin inkorporering</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">TCATGAGTTCCCCACATCTTTG</td>
			<td>8</td>
			<td>+</td>
			<td>84841090</td>
			<td>84841111</td>
			<td>sammen med mm Calr2</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">CTGTGGGCACCAGATGTGTAAAT</td>
			<td>8</td>
			<td>+</td>
			<td>84848519</td>
			<td>84848541</td>
			<td>sammen med mm Calr1</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">TATCAAGGGTGCCCGTCACCTTCAGC</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>125163098</td>
			<td>125163123</td>
			<td>sammen med Gapdh4 Dekker</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGGCTTTTATAGCACGGTTATAAAGT</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>125163774</td>
			<td>125163799</td>
			<td>sammen med Gapdh3 Dekker</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGAGGAGGGAAAAGGAGTGATT</td>
			<td>6</td>
			<td>+</td>
			<td>52212829</td>
			<td>52212850</td>
			<td>sammen med mm Hoxa13</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">CAGGCATTATTTGCTGAGAACG</td>
			<td>6</td>
			<td>-</td>
			<td>52253490</td>
			<td>52253511</td>
			<td>sammen med mm Hoxa7</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGGTAATGGTGTCACTAACTGG</td>
			<td>13</td>
			<td>+</td>
			<td>23571284</td>
			<td>23571305</td>
			<td>sammen med mm Hist1h3e eller mm Hist1h4i</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">GGGTTTGATGAGTTGGTGAAG</td>
			<td>13</td>
			<td>+</td>
			<td>23566541</td>
			<td>23566561</td>
			<td>sammen med mm Hist1h2ae</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="3">TTGGGCCAAAGCCTATATGA</td>
			<td>13</td>
			<td>+</td>
			<td>22043085</td>
			<td>22043104</td>
			<td>sammen med mm Hist1h2ae</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Primer sekvenser for kvalitetskontroll av menneskelige og mus Hi-C biblioteker.

Watch this Scientific Journal Video about Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions at JoVE.com

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

DNA regulatoriske elementer, for eksempel enhancers, kontrollere genuttrykk ved fysisk å kontakte målet genet arrangører, ofte gjennom langtrekkende chromosomal interaksjoner spenner genomisk distanser. Promotoren fange Hi-C (PCHi-C) identifiserer betydelig interaksjon mellom arrangører og distale regioner, aktivere tilordningen av potensielle regulatoriske sekvenser til sine mål gener.

Promotoren fange Hei-C: Med høy oppløsning, genomet-bred profilering av arrangøren interaksjoner

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genome-wide Fastsettelse av pattedyr Replication Timing av DNA innhold Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Analyse av c-KIT ligand-promotoren ved bruk av kromatinimmunutfelling

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genom-brede kartlegging av protein-DNA-interaksjoner med ChEC-seq i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Kartlegging genomet hele tilgjengelig Chromatin i primære menneskelige T-lymfocytter av ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Bfu genomet hele transkripsjon forfall i voksende og Quiescent menneskelig fibroblaster

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generasjon av genomet hele Chromatin konformasjon fange biblioteker fra tett trinnvis tidlig Drosophila embryo

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genomet hele overvåking av transkripsjon feil i eukaryote organismer

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

Høyoppløselig sammenligning av bakteriell Bøyning frekvenser

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Genetisk kartlegging av Thermotolerance forskjeller mellom arter av Saccharomyces gjær via Genova-bredt gjensidige Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Identifikasjon av enhancer-promoter kontakter i embryoid organer av kvantitative kromosom conformation capture (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...