Name: using terminal transferase-mediated dutp nick end-labelling (tunel) and caspase 3/7 assays to measure epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis
Uploaded: 2018-05-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling TUNEL and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis at JoV

हम निंनलिखित लोग हैं, जो पशुपालन और डेटा संग्रह के साथ सहायता का धंयवाद: Tegtmeier, सी. डी जोंग, जे हॉकरों, के. Fossen, एस. Percival, एम. McWilliams, एल. Bertola, एम. स्टीवर्ट, एन Harney, और टी. Knavel; और विच्छेदों के साथ सहायता के लिए एम. Merces. हम यह भी एल. वी. alpinaस्थापना के लिए एम. McFadden, पी Harlow और Taronga चिड़ियाघर शुक्रिया अदा करना चाहूंगा पी. Marantelliस्थापना के लिए और जी. corroboree । हम Kladnik परख के साथ सहायता के लिए apoptosis परख, सी. Constantine, ए. TUNEL और आर. वेब पर सलाह के लिए एफ Pasmans, ए Martel धंयवाद, और Emeto 3/7 परख के लिए प्रोटोकॉल और किट के साथ मदद के लिए Weßels और डब्ल्यू caspase । यह पांडुलिपि और प्रोटोकॉल Brannelly एट अल २०१७ पीयर जे22से अनुकूलित है।

जेम्स कुक विश्वविद्यालय ने एल. वी. alpinaके लिए पी. corroboree और A1897 तथा A2171 के लिए A1875 अनुप्रयोगों में पशु नैतिकता को मंजूरी दी ।
1. पशुपालन और निगरानी
<ol><li>एक उपयुक्त पानी, खिला और सफाई अनुसूची के साथ प?...

<ol>
	<li>Stuart, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Status+and+trends+of+amphibian+declines+and+extinctions+worldwide.">Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide.</a> Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).</li><li>Skerratt, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spread+of+chytridiomycosis+has+caused+the+rapid+global+decline+and+extinction+of+frogs.">Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs.</a> EcoHealth. 4, 125-134 (2007).</li><li>Voyles, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+chytridiomycosis,+a+cause+of+catastrophic+amphibian+declines.">Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines.</a> Science. 326 (5952), 582-585 (2009).</li><li>Woodhams, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+trends+associated+with+skin+peptide+defenses+against+chytridiomycosis+in+Australian+frogs.">Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs.</a> Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).</li><li>Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicted+disease+susceptibility+in+a+Panamanian+amphibian+assemblage+based+on+skin+peptide+defenses.">Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses.</a> Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).</li><li>Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+defenses+of+amphibian+skin:+antimicrobial+peptides+and+more.">Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more.</a> Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).</li><li>Savage, A. E., Zamudio, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+genotypes+associate+with+resistance+to+a+frog-killing+fungus.">MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus.</a> PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).</li><li>Bataille, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+amphibians+to+chytridiomycosis+is+associated+with+MHC+class+II+conformation.">Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation.</a> Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127 (2015).</li><li>Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+local+immune+responses+by+the+frog-killing+fungus+Batrachochytrium+dendrobatidis.">Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis.</a> Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).</li><li>Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+chytridiomycosis+on+hematopoietic+tissue+in+the+spleen,+kidney+and+bone+marrow+in+three+diverse+amphibian+species.">Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species.</a> Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069 (2016).</li><li>Brutyn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Batrachochytrium+dendrobatidis+zoospore+secretions+rapidly+disturb+intercellular+junctions+in+frog+skin.">Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin.</a> Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).</li><li>Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+stages+of+the+amphibian+chytrid+Batrachochytrium+dendrobatidis.">Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).</li><li>Pasmans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chytridiomycosis+related+mortality+in+a+midwife+toad+(Alytes+obstetricans)+in+Belgium.">Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium.</a> Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).</li><li>Ellison, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+skin+deep:+Functional+genomic+basis+for+resistance+to+amphibian+chytridiomycosis.">More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis.</a> Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).</li><li>Fites, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+invasive+chytrid+fungus+of+amphibians+paralyzes+lymphocyte+responses.">The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses.</a> Science. 342 (6156), 366-369 (2013).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li><li>Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+determine+specificity+and+sensitivity+of+the+TUNEL+reaction+in+the+quantitation+of+apoptosis.">A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis.</a> American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).</li><li>Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantitative+detection+of+chytridiomycosis+(Batrachochytrium+dendrobatidis)+in+amphibian+samples+using+real-time+Taqman+PCR+assay.">Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).</li><li>Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibians+with+infectious+disease+increase+their+reproductive+effort:+evidence+for+the+terminal+investment+hypothesis.">Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis.</a> Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).</li><li>Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+disinfectants+effective+against+the+amphibian+chytrid+fungus+Batrachochytrium+dendrobatidis.">Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).</li><li>Woods, A., Ellis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Histopathology: A Complete Reference. , (1994).</li><li>Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+cell+death+in+frogs+with+chytridiomycosis.">Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis.</a> PeerJ. 5, e2925 (2017).</li></ol>

हम घातक रोग chytridiomycosis की विकृति के एक संभावित तंत्र या Bd अतिसंवेदनशील प्रजातियों में रोग प्रतिरोध की एक प्रणाली के रूप में एपिडर्मल apoptosis और कोशिका मृत्यु का पता लगाया । हम एपिडर्मिस में सेल मौत का आकलन क?...

उभयचर वर्तमान में किसी भी हड्डीवाला taxa1के वैश्विक जैव विविधता का सबसे बड़ा नुकसान का सामना कर रहे हैं । इन गिरावट का एक प्रमुख कारण घातक त्वचा रोग chytridiomycosis, कवक रोगज़नक़ Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2की वजह से है । रोगज़नक़ सतही एपिडर्मिस, जो गंभीर इलेक्ट्रोलाइट हानि, हृदय की गिरफ्तारी, और मौत3में जिसके परिणामस्वरूप त्वचा समारोह के विघटन के लिए नेतृत्व कर सकते है संक्रमित । विभिंन संभावित मेजबान Bd के खिलाफ प्रतिरक्षा तंत्र वर्तमान में ऐसे रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स के रूप में अध्ययन किया जा रहा है,4,5, त्वचा के जीवाणु वनस्पति6, प्रतिरक्षा सेल रिसेप्टर्स7,8, और लिम्फोसाइट गतिविधि9,10. हालांकि, कुछ अध्ययनों से पता लगाने कि क्या एपिडर्मल apoptosis और कोशिका मृत्यु इस घातक रोगज़नक़ के खिलाफ एक प्रतिरक्षा तंत्र है ।
कोशिका मृत्यु, या तो apoptosis (क्रमादेशित सेल मौत) या परिगलन (unprogrammed मौत) के माध्यम से, एपिडर्मिस में Bd संक्रमण की विकृति हो सकती है । पिछले शोध से पता चलता है कि Bd संक्रमण apoptosis प्रेरित हो सकता है क्योंकि intracellular जंक्शनों के विघटन मनाया जाता है जब त्वचा explants इन विट्रो11में zoospore supernatants के संपर्क में हैं। इसके अतिरिक्त, Bd-संक्रमित मेंढक में अपक्षयी एपिडर्मल परिवर्तन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी12,13का उपयोग कर मनाया जाता है । Transcriptomic विश्लेषण संकेत मिलता है कि apoptosis रास्ते संक्रमित त्वचा14में विनियमित रहे हैं, और amphibian splenocytes से गुजरना apoptosis जब वे Bd supernatants करने के लिए इन विट्रो15में उजागर कर रहे हैं । सुझाव है कि Bd apoptosis और मेजबान सेल मौत इन विट्रोमें प्रेरित कर सकते हैं सबूत की बढ़ती मात्रा के बावजूद, vivo अध्ययन है कि पता लगाने या संक्रमण की प्रगति के माध्यम से apoptosis तंत्र को बढ़ाता है में कमी है । इसके अलावा, यह अज्ञात है अगर मेजबान एक रक्षात्मक प्रतिरक्षा रणनीति के रूप में apoptosis का उपयोग करता है Bd संक्रमण का मुकाबला, या यदि apoptosis रोग की एक विकृति है ।
इस अध्ययन में, हम एपिडर्मल कोशिका मौत का पता लगाने के उद्देश्य से और vivo में संक्रमित पशुओं में apoptosis दो तरीकों का उपयोग कर: caspase 3/7 प्रोटीन परख, और टर्मिनल ट्रांस्फ़्रेज़-मध्यस्थता dUTP निक अंत-लेबलिंग (TUNEL) में सीटू परख. के रूप में प्रत्येक परख सेल मौत के विभिंन पहलुओं16का पता लगाता है, एक साथ इन तरीकों कोशिका मृत्यु में शामिल तंत्र की एक पूरी समझ प्रदान करते हैं, और प्रभाव का एक सटीक उपाय सुनिश्चित करते हैं । caspase 3/7 परख quantifies caspases 3 और 7 है, जो आंतरिक और बाह्य apoptosis मार्ग दोनों के ठहराव सक्षम बनाता है की गतिविधि । इसके विपरीत, TUNEL परख डीएनए विखंडन है, जो apoptosis, परिगलन और pyroptosis17सहित कोशिका मृत्यु तंत्र के कारण होता है का पता लगाता है । हम TUNEL परख का उपयोग दोनों नैदानिक संक्रमित और संक्रमित तीन अलग त्वचा वर्गों का उपयोग पशुओं के एपिडर्मिस के भीतर कोशिका मृत्यु के स्थान की जांच: dorsum, वेंटर और Pseudophryne corroboreeकी जांघ । इस विधि कोशिका मृत्यु के संरचनात्मक साइट, साथ ही विशिष्ट एपिडर्मल परतों के भीतर अपने स्थान को पहचानने की पहचान करता है । हम तो caspase 3/7 परख का उपयोग एक समय श्रृंखला एक 8 में apoptosis के ठहराव सप्ताह के संचालन के लिए लिटौरिया verreauxii alpinaमें संक्रमण । हम एक ही जानवर से पैर की अंगुली टिप नमूने ले और caspase 3/7 गतिविधि के साथ रोगज़नक़ संक्रमण लोड सहसंबंधी करने में सक्षम हैं ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>POLARstar Omega</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td>Luminescent plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well flat clear bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well low flange white flat bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Bacteriological (Oxoid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>OXLP0011B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>6764254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactose Broth (Oxoid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>OXCM0137B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricane-S (MS-222)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0872873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15561020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile rayon swab</td>
			<td>Medical Wire &#38; Equipment</td>
			<td>MW-113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S7165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Bradford reagent</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase Glo&#160; 3/7</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0887-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1374248-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin hydrolysate Enzymatic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X)</td>
			<td>Thermo/Life</td>
			<td>20-012-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepman</td>
			<td>Thermo/Life</td>
			<td>4318930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4444556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Axio Scan florescent miscroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Florescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2mm stainless steel beads</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>11079132SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer ITSI-3 Chytr (5&#8242;-CCTTGATATAATACAGTGTGCCATATGTC-3&#8242;)</td>
			<td>Taqman</td>
			<td></td>
			<td>Individual design for primers and probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 5.8S Chytr (5&#8242;-TCGGTTCTCTAGGCAACAGTTT-3&#8242;)</td>
			<td>Taqman</td>
			<td></td>
			<td>Individual design for primers and probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minor groove binder probe Chytr MGB2(5&#8242;-CGAGTCGAAC-3&#8242;)</td>
			<td>Taqman</td>
			<td></td>
			<td>Individual design for primers and probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor-Gene qPCR Instruments</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5ml</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-681-372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture petri plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>263991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>11079105Z</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using terminal transferase-mediated dutp nick end-labelling (tunel) and caspase 3/7 assays to measure epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis

उभयचर वैश्विक स्तर पर जैव विविधता में एक महान नुकसान का सामना कर रहे है और प्रमुख कारणों में से एक संक्रामक रोग chytridiomycosis है । यह रोग कवक रोगजनक Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) के कारण होता है, जो मेंढक एपिडर्मिस को संक्रमित और बाधित कर जाता है; हालांकि, रोग परिवर्तन स्पष्ट रूप से विशेषता नहीं किया गया है । Apoptosis (क्रमादेशित सेल मौत) रोगज़नक़ों द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता को नुकसान मेजबान ऊतक, लेकिन यह भी रोगज़नक़ हटाने के लिए रोग प्रतिरोध की एक मेजबान तंत्र हो सकता है । टर्मिनल ट्रांस्फ़्रेज़-मध्यस्थता dUTP निक अंत-लेबलिंग (TUNEL), और caspase 3/7: इस अध्ययन में, हम संक्रमित और संक्रमित दो अलग परख का उपयोग पशुओं के एपिडर्मल कोशिका मौत यों तो । TUNEL परख में ventral, पृष्ठीय, और जांघ त्वचा ऊतक का प्रयोग, हम नैदानिक संक्रमित पशुओं की सीटू में एपिडर्मल कोशिकाओं में कोशिका मृत्यु का पालन और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर पशुओं के साथ सेल मौत की तुलना करें । आदेश में निर्धारित करने के लिए कैसे संक्रमण के पाठ्यक्रम पर एपिडर्मिस परिवर्तन में apoptosis स्तर हम पैर की अंगुली को हटाने-टिप नमूने एक 8 सप्ताह की अवधि में पाक्षिक, और निकाले गए प्रोटीन के साथ एक caspase 3/7 परख का उपयोग करने के लिए नमूने के भीतर गतिविधि यों तो । हम तो संक्रमण लोड के साथ caspase 3/7 गतिविधि सहसंबंधी बनाना । TUNEL परख सीटू मेंसेल मौत के स्थानीयकरण के लिए उपयोगी है, लेकिन महंगा है और नमूना प्रति गहन समय है । caspase 3/7 परख बड़े नमूना आकार और समय पाठ्यक्रम प्रयोगों के लिए कुशल है । हालांकि, क्योंकि मेंढक पैर की अंगुली टिप बायोप्सी छोटे है वहां सीमित निकालने प्रोटीन ठहराव तरीकों, जैसे ब्रैडफोर्ड परख के माध्यम से नमूना मानकीकरण के लिए उपलब्ध है । इसलिए, हम सुझाव है कि पैर की अंगुली बायोप्सी के फोटोग्राफिक विश्लेषण के माध्यम से त्वचा की सतह क्षेत्र का आकलन नमूना मानकीकरण के दौरान अर्क लेने से बचने के लिए ।

TUNEL परख
संक्रमित पशुओं की तुलना में संक्रमित जानवरों में अधिक TUNEL सकारात्मक कोशिकाएं थीं । TUNEL सकारात्मक कोशिकाओं के सीटू में स्थान संक्रमित और नियंत्रण जानवरो?...

Watch this Scientific Journal Video about Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling TUNEL and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis at JoV

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling TUNEL and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

हम दो तरीकों का उपयोग chytridiomycosis के साथ मेंढ़क में एपिडर्मल कोशिका मौत यों तो । सबसे पहले, हम नैदानिक संक्रमित और संक्रमित पशुओं के बीच मतभेद का निर्धारण करने के लिए सीटू प्रोटोकॉल में टर्मिनल ट्रांस्फ़्रेज़-मध्यस्थता dUTP निक एंड-लेबलिंग (TUNEL) का उपयोग करें । दूसरा, हम एक caspase 3/7 प्रोटीन विश्लेषण का उपयोग कर संक्रमण पर apoptosis की एक समय श्रृंखला विश्लेषण आचरण ।

टर्मिनल ट्रांस्फ़्रेज़ का उपयोग-मध्यस्थता dUTP निक अंत लेबलिंग (TUNEL) और Caspase 3/7 परख एपिडर्मल के साथ मेंढक में Chytridiomycosis कोशिका मृत्यु को मापने के लिए

Amphibians are experiencing a great loss in biodiversity globally and one of the major causes is the infectious disease chytridiomycosis. This disease is ...

The overall goal of this experiment is to observe the affect of amphibian fungal pathogen batrachochytrium dendrobatidis on apoptosis and cell death in the epidermal tissue of frogs. This method can help us understand wildlife disease such as if infection causes cell death or, conversely, if there are immune mechanisms against infection. The main advantage of this technique is that it can be performed on small tissue biopsy samples so that small individuals can be repeatedly sampled throughout the course of infection.To begin this procedure, prepare hydrophilic glass slides with sample tissue as outlined in the text protocol. To deparaffinize the tissue sections, wash the slides three times with xylene for five minutes each in a coplin jar. Next, wash the slides with 100%ethanol two times for five minutes each.After this, wash the slides with 95%ethanol and 70%ethanol for three minutes each. Then, wash the slides once with PBS for five minutes. To prepare experimental and negative control slides, pretreat the tissue by adding freshly diluted proteinase K directly to the slides.Incubate the slides for 10 minutes at room temperature. Then, wash the slides in PBS two times for two minutes each. To prepare positive control slides, pretreat the tissue with DN buffer then incubate the slides at room temperature for five minutes.After this, dissolve DNase one in DN buffer to a final concentration of 0.1 micrograms per milliliter. Add the prepared DNase solution to the slides. Incubate the slides for 15 minutes at room temperature.Then, wash the slides with distilled water in a coplin jar five times for three minutes each. Quench the reaction in 3%hydrogen peroxide in PBS for five minutes at room temperature. Next, wash the slides in PBS two times for two minutes each.Then, add equilibrium buffer to the tissue on the slides. Incubate for 10 seconds at room temperature. Then, tap off the excess liquid around the tissue section.Dilute terminal deoxynucleotidyl transferase enzyme in reaction buffer. Then, add it to the tissue on the experimental and positive control slides. Incubate in a humidified chamber for one hour at 37 degrees Celsius.After this, place the slides in a coplin jar containing the working concentration of stop buffer. Agitate for 15 seconds and then incubate the slides at room temperature for 10 minutes. Then, wash the slides with PBS three times for one minute each and tap off the excess liquid.Next, add the anti-digoxigenin conjugate, prewarmed to room temperature, directly onto the tissue. Incubate the slides for 30 minutes at room temperature in a humidified dark chamber. After the incubation is complete, wash the slides with PBS four times for two minutes each.Tap off any excess liquid. Then, add mounting medium to the slides. Add 15 microliters of DAPI solution to the mounting medium on the slides.Cover each slide with a cover slip and seal with nail polish. Allow the slides to dry in the dark. Using a fluorescent microscope, observe the slides immediately upon completion of the standing process.Take photos at 400 times at random intervals along each skin section. Count DAPI-stained blue cells to ensure at least 100 cells per skin section per animal are visible. Next, count the number of TUNEL-positive cells which appear as red single cells with clear cell edges.To begin, use an inverted light microscope at 40 times to take a photo of each of the frog's toes. Draw lines around the edge of the toe clip and use imaging software to estimate the area within the shape. To evaluate the surface area of the three-dimensional skin sample, multiply the estimated area by pi.To extract proteins from a frozen frog toe sample, place the sample in a 1.5 milliliter screw cap microcentrifuge tube containing 100 microliters of sample buffer and two stainless steel beads. Use a bead beater at maximum speed to lyse the cells. After this, place the tube on ice for three minutes.Then, centrifuge the tube to collect the supernatant. To perform the caspase 3/7 assay in a 384-well plate, add 10 microliters of sample buffer as blank and 10 microliters of protein extract in triplicate. Then, pipette 10 microliters of commercially available caspase 3/7 reagent to the protein extract and blank wells.Then, shake the plate gently for 15 seconds to mix the two reagents. Incubate at room temperature in dark for 30 minutes. Finally, use a luminescent plate reader to measure the luminescence of the sample.In this study, the infected animals depict significantly more TUNEL-positive cells in comparison to control animals as illustrated by red or pink-stained cells. In control animals, there are few TUNEL-positive cells, and they are not concentrated in the epidermis. In infected animals, the TUNEL-positive cells are more frequent in the epidermis.TUNEL-positive cells are more concentrated at and directly adjacent to the sights of infected cells. Also, there are more widespread TUNEL-positive cells over the epidermis and in epidermal layers that are deeper than where the fungal pathogen resided. In infected animals, there are more TUNEL-positive cells in all three skin types with a particularly high level in the thigh and venter skin.In the caspase assay, the infection intensity is positively correlated with caspase 3/7 activity. Additionally, caspase 3/7 activity in infected and uninfected animals differed over time. Caspase 3/7 activity decreased within the first few weeks after inoculation and then increased toward the end of week seven in infected animals.Caspase 3/7 activity remained constant in uninfected individuals. While attempting the procedure for the TUNEL assay, it's important to read the slides on the same day as the assay to avoid loss of sensitivity and to keep the slides in a cool dark place to protect the dyes. After watching this video, you should have a good understanding of how to detect apoptosis and cell death using two different detection methods in small tissue samples like amphibian skin.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

प्रतियोगी घर वापस आना Assays आंत रेखा टी सेल प्रवासन अध्ययन

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

साइटोटोक्सिक टी lymphocytes द्वारा बीटा सेल मौत मध्यस्थता का आकलन करने के तरीके

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

मात्रात्मक<em&gt; इन विट्रो में</emस्टेटिक शर्तों के तहत सक्रिय प्राथमिक मानव microvascular endothelial कोशिकाओं को न्युट्रोफिल आसंजन उपाय&gt; परख

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

आंतों उपकला कोशिकाओं की आंतों बैक्टीरियल आक्रमण<em&gt; इन विट्रो में</em&gt; नाटकीय रूप से एक कार्यक्षेत्र प्रसार चैंबर मॉडल का उपयोग बढ़ाया है

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

मेजबान सेल शाही सेना संश्लेषण पर वायरल संक्रमण के प्रभाव को मापने के लिए क्लिक करें रसायन विज्ञान का प्रयोग

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

राइबोफ्लेविन साथ प्लेटलेट उत्पाद और पराबैंगनी प्रकाश का उपचार: उच्च अनुमापांक जीवाणु संक्रमण के खिलाफ प्रभावशीलता

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

न्युट्रोफिल अलगाव और विश्लेषण करने के लिए चिकित्सीय एजेंट लिंफोमा सेल संवेदनशीलता में उनकी भूमिका का निर्धारण करने के लिए

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

का उपयोग करते हुए एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, बायोफिजिक्स, और कार्यात्मक assays तंत्र शासी टी-सेल कैंसर प्रतिजनों की रिसेप्टर मान्यता निर्धारित करने के लिए

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

inoculating<em&gt; एनोफ़ेलीज़ gambiae</em&gt; प्रेरित और उपाय करने के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया melanization मोती के साथ मच्छरों

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is ...