Name: using terminal transferase-mediated dutp nick end-labelling (tunel) and caspase 3/7 assays to measure epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis
Uploaded: 2018-05-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling TUNEL and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis at JoV

우리 축산 및 데이터 수집 지원 다음과 같은 사람들에 게 감사: D. Tegtmeier, C. 드 종, J. 호크스, K. Fossen, S. 퍼시벌, M. 맥 윌리엄스, L. Bertola, M., 명 Harney, 스튜어트와 T. Knavel; 그리고 해와 지원에 대 한 M. Merces입니다. 우리 또한 M. 맥 퍼 든, 피 할로 타롱가 동물원 alpina v. L., 양육에 대 한 G. Marantelli P. 코양육에 대 한 감사 하 고 싶습니다. F. Pasmans, A. 마 텔 apoptosis 분석 실험, C. 콘스탄틴, A. Kladnik, R. Webb TUNEL 분석 결과, 지원에 대 한 조언 감사 그리고 T. Emeto와 W. Weßels에 대 한 프로토콜 및 caspase 3/7 분석 결과 대 한 키트 도움이. 이 원고와 프로토콜은 Brannelly 외 2017 피어 J22. 에서 적응

제임스 쿡 대학 승인 응용 프로그램 A1875 P. 코 와 A1897 및 A2171 L. alpina 대동물 윤리.
1. 축산 및 모니터링
<ol><li>적절 한 물, 수 유 및 일정을 청소와 종족에 대 한 적절 한 환경에서 동물을 개별적으로, 집. 매일 동물을 확인 합니다.<ol>
<li>비판적으로 멸종 위기에 놓인된 Pseudophryne 코 의 성인 개인 (TUNEL 분석 결과, 제 4)를 사용 하 고 (Caspase 3/7 분석 결과, 5)에 ?...

<ol>
	<li>Stuart, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Status+and+trends+of+amphibian+declines+and+extinctions+worldwide.">Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide.</a> Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).</li><li>Skerratt, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spread+of+chytridiomycosis+has+caused+the+rapid+global+decline+and+extinction+of+frogs.">Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs.</a> EcoHealth. 4, 125-134 (2007).</li><li>Voyles, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+chytridiomycosis,+a+cause+of+catastrophic+amphibian+declines.">Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines.</a> Science. 326 (5952), 582-585 (2009).</li><li>Woodhams, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+trends+associated+with+skin+peptide+defenses+against+chytridiomycosis+in+Australian+frogs.">Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs.</a> Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).</li><li>Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicted+disease+susceptibility+in+a+Panamanian+amphibian+assemblage+based+on+skin+peptide+defenses.">Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses.</a> Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).</li><li>Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+defenses+of+amphibian+skin:+antimicrobial+peptides+and+more.">Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more.</a> Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).</li><li>Savage, A. E., Zamudio, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+genotypes+associate+with+resistance+to+a+frog-killing+fungus.">MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus.</a> PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).</li><li>Bataille, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+amphibians+to+chytridiomycosis+is+associated+with+MHC+class+II+conformation.">Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation.</a> Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127 (2015).</li><li>Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+local+immune+responses+by+the+frog-killing+fungus+Batrachochytrium+dendrobatidis.">Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis.</a> Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).</li><li>Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+chytridiomycosis+on+hematopoietic+tissue+in+the+spleen,+kidney+and+bone+marrow+in+three+diverse+amphibian+species.">Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species.</a> Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069 (2016).</li><li>Brutyn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Batrachochytrium+dendrobatidis+zoospore+secretions+rapidly+disturb+intercellular+junctions+in+frog+skin.">Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin.</a> Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).</li><li>Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+stages+of+the+amphibian+chytrid+Batrachochytrium+dendrobatidis.">Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).</li><li>Pasmans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chytridiomycosis+related+mortality+in+a+midwife+toad+(Alytes+obstetricans)+in+Belgium.">Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium.</a> Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).</li><li>Ellison, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+skin+deep:+Functional+genomic+basis+for+resistance+to+amphibian+chytridiomycosis.">More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis.</a> Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).</li><li>Fites, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+invasive+chytrid+fungus+of+amphibians+paralyzes+lymphocyte+responses.">The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses.</a> Science. 342 (6156), 366-369 (2013).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li><li>Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+determine+specificity+and+sensitivity+of+the+TUNEL+reaction+in+the+quantitation+of+apoptosis.">A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis.</a> American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).</li><li>Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantitative+detection+of+chytridiomycosis+(Batrachochytrium+dendrobatidis)+in+amphibian+samples+using+real-time+Taqman+PCR+assay.">Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).</li><li>Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibians+with+infectious+disease+increase+their+reproductive+effort:+evidence+for+the+terminal+investment+hypothesis.">Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis.</a> Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).</li><li>Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+disinfectants+effective+against+the+amphibian+chytrid+fungus+Batrachochytrium+dendrobatidis.">Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).</li><li>Woods, A., Ellis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Histopathology: A Complete Reference. , (1994).</li><li>Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+cell+death+in+frogs+with+chytridiomycosis.">Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis.</a> PeerJ. 5, e2925 (2017).</li></ol>

우리는 표 피 apoptosis와 세포 죽음의 치명적인 질병 chytridiomycosis 병리학 또는 Bd 취약 종에 질병 저항 메커니즘의 잠재적인 메커니즘으로 탐험. 우리 세포 죽음 표 피, 표 피 세포 죽음 분석, 현장에 대 한 분석 결과 TUNEL 및 감염의 진행을 통해 표 피 세포 죽음을 모니터링을 위한 caspase 3/7 분석 결과 평가의 두 가지 방법을 사용 합니다. 우리는 세포 죽음 및 apoptosis 감염 부하와 상관은 ?...

양서류는 현재 발생 하나 모든 척추 동물 taxa1의 세계 생물 다양성의 가장 큰 손실. 이러한 하락의 주요 원인 치명적인 피부 질병 chytridiomycosis, Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2곰 팡이 병원 균에 의해 발생 이다. 병원 체는 표면적으로 표 피, 피부 기능 심한 전해질 손실, 심장 마비, 그리고 사망3결과의 중단으로 이어질 수 있는 감염. Bd 에 대 한 다양 한 잠재적인 호스트 면역 메커니즘은 현재 공부 되 고, 항균 성 펩 티 드4,5, 피부 세균 식물6,8, 면역 세포의 수용 체7, 그리고 림프 구 활동9,10. 그러나, 몇 가지 연구는 상피 apoptosis와 세포 죽음은이 치명적인 병원 체에 대 한 면역 메커니즘을 탐구 한다.
세포 죽음, apoptosis (프로그램 된 세포 죽음) 또는 괴 사 (unprogrammed 죽음), 표 피에서 통해 Bd 감염의 병리학을 있을 수 있습니다. 이전 연구 Bd 감염 세포내 접합의 피부 explants zoospore supernatants 생체 외에서11. 에 노출 되는 때 관찰 하기 때문에 apoptosis를 유도 수 있습니다 하는 것을 건의 한다. 또한, Bd에 퇴행 성 상피 변화-감염 된 개구리 전자 현미경12,13를 사용 하 여 관찰 된다. Transcriptomic 분석 나타냅니다 apoptosis 경로 감염 된 피부14, upregulated 양서류 splenocytes 그들은 체 외에서 Bd supernatants15에 노출 되 면 apoptosis를 받 다. Bd 를 일으킬 수 있는 제안 하는 증거의 증가 볼륨에도 불구 하 고 apoptosis와 호스트 죽음 생체 외에서 vivo에서 연구에 하거나 감염의 진행을 통해 메커니즘 부족 apoptosis를 계량 하는 세포. 또한, 그것 아니다 알려진 호스트 Bd 감염을 방지 하기 위해 면역 방어 전략으로 apoptosis를 사용 하는 경우 또는 apoptosis 질병의 병 리.
이 연구에서 우리가 감염된 동물에서 vivo에서 두 가지 방법을 사용 하 여 표 피 세포 죽음 및 apoptosis를 감지 목적: caspase 3/7 단백질 분석 결과, 및 터미널 전이 효소 중재 dUTP 닉 끝 라벨 (TUNEL) 현장에서 시험. 각 분석 결과 감지 세포 죽음16의 다른 측면, 함께 이러한 방법을 세포 죽음에 관련 된 메커니즘의 완전 한 이해를 제공 하 고 효과의 정확한 측정을 보장. Caspase 3/7 분석 결과 단정 이펙터 caspases 3, 7, 내장 및 외부 apoptosis 경로의 정량화를 가능 하 게의 활동. 반면, TUNEL 분석 결과 검색 DNA 파편, apoptosis, 괴 사 및 pyroptosis17를 포함 하 여 세포 죽음 메커니즘에 의해 발생 합니다. TUNEL 분석 결과 사용 하 여 세 가지 다른 피부 섹션을 사용 하 여 모두 임상적으로 감염 되 고 감염 되지 않은 동물의 표 피 내 세포 죽음의 위치를 조사 하는 우리: 고 등는 venter와 Pseudophryne 코의 허벅지. 이 메서드는 특정 상피 층 내에서 위치를 구별 뿐만 아니라 세포 죽음의 해 부 사이트를 식별 합니다. 우리는 다음 caspase 3/7 분석 결과 사용 하 여 Litoria verreauxii alpina에 8 주 감염을 통해 apoptosis의 시간 시리즈 정량화를 수행. 우리 같은 동물에서 발가락 끝 샘플을 격주 걸릴 고 caspase 3/7 활동 병원 체 감염 부하를 연결할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>POLARstar Omega</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td>Luminescent plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well flat clear bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well low flange white flat bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Bacteriological (Oxoid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>OXLP0011B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>6764254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactose Broth (Oxoid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>OXCM0137B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricane-S (MS-222)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0872873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15561020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile rayon swab</td>
			<td>Medical Wire &#38; Equipment</td>
			<td>MW-113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S7165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Bradford reagent</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase Glo&#160; 3/7</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0887-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1374248-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin hydrolysate Enzymatic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X)</td>
			<td>Thermo/Life</td>
			<td>20-012-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepman</td>
			<td>Thermo/Life</td>
			<td>4318930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4444556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Axio Scan florescent miscroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Florescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2mm stainless steel beads</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>11079132SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer ITSI-3 Chytr (5&#8242;-CCTTGATATAATACAGTGTGCCATATGTC-3&#8242;)</td>
			<td>Taqman</td>
			<td></td>
			<td>Individual design for primers and probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 5.8S Chytr (5&#8242;-TCGGTTCTCTAGGCAACAGTTT-3&#8242;)</td>
			<td>Taqman</td>
			<td></td>
			<td>Individual design for primers and probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minor groove binder probe Chytr MGB2(5&#8242;-CGAGTCGAAC-3&#8242;)</td>
			<td>Taqman</td>
			<td></td>
			<td>Individual design for primers and probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor-Gene qPCR Instruments</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5ml</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-681-372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture petri plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>263991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>11079105Z</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using terminal transferase-mediated dutp nick end-labelling (tunel) and caspase 3/7 assays to measure epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis

양서류 세계적으로 생물 다양성에 큰 손실을 겪고 그리고 주요 원인 중 하나 전염병 chytridiomycosis. 이 병은 곰 팡이 병원 균 Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), 감염 하 고 개구리 표 피;를 방해에 의해 발생 그러나, 병 적인 변화는 계속 명시적으로 특징 되지. Apoptosis (프로그램 된 세포 죽음) 호스트 조직 손상에 병원 균에 의해 사용할 수 있습니다 하지만 병원 체 제거에 대 한 질병 저항의 호스트 메커니즘을 수도 있습니다. 이 연구에서 우리는 두 개의 서로 다른 분석 실험을 사용 하 여 감염 되 고 감염 되지 않은 동물의 표 피 세포 죽음 계량: 터미널 전이 효소 중재 dUTP 닉 끝-라벨 (TUNEL) 및 caspase 3/7. 사용 하, 등, 복 부 및 허벅지 피부 조직을 TUNEL 분석 결과에 우리가 관찰 세포 죽음 표 피 세포에는 제자리에서 임상적으로 감염 된 동물의 고 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 감염 되지 않은 동물 세포 죽음을 비교. 표 피에서 apoptosis 수준 감염의 과정을 통해 변경 하는 방법을 결정 하기 위해 우리는 8 주 동안 격주 발가락 끝 샘플을 제거 하 고 추출 된 단백질 caspase 3/7 분석 결과 사용 하 여 샘플 내에서 활동을 계량. 우리는 다음 감염 부하 caspase 3/7 활동을 상관 관계. TUNEL 분석 결과 세포 죽음에서 제자리에서의 지역화에 대 한 유용 하지만 비용과 시간 샘플 당 집중. Caspase 3/7 분석 결과 큰 샘플 크기와 시간에 대 한 효율적인 실험 과정. 그러나, 개구리 발가락 팁 biopsies 작기 때문에 있다 제한 추출 샘플 표준화 Bradford 분석 실험과 같은 단백질 정량화 방법을 통해 사용할 수 있습니다. 따라서, 피부 표면 영역 샘플 표준화 동안 추출 물을 사용 하지 않으려면 발가락 biopsies의 사진 분석을 통해 추정 하는 것이 좋습니다.

TUNEL 분석 결과
감염된 제어 동물에 더 많은 TUNEL 긍정적인 세포 보다 감염 된 동물에 있었습니다. 셀에 달랐다 긍정적인 TUNEL 제자리에 위치 감염 하 고 동물을 제어. 제어 동물, TUNEL 셀 및 표 피는 피부를 통해 피부 레이어 (참조 그림 1A), 수준 낮은 하지만 감염 된 동물에 TUNEL 긍정적인 세포 ?...

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Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling TUNEL and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

우리는 두 가지 방법을 사용 하 여 chytridiomycosis와 개구리에서 상피 세포 죽음 계량. 먼저, 터미널 전이 효소 중재 dUTP 닉 끝 라벨 (TUNEL) 제자리에서 조직학 사용 하 여 임상적으로 감염 되 고 감염 되지 않은 동물 간의 차이 확인 하려면. 둘째, 우리는 caspase 3/7 단백질 분석을 사용 하 여 감염을 통해 apoptosis의 시간 시리즈 분석을 실시 합니다.

사용 하 여 터미널 전이 효소 중재 dUTP 닉 끝-라벨 (TUNEL) 및 Caspase 3/7 Chytridiomycosis와 개구리에 측정 상피 세포 죽음을 분석 실험

Amphibians are experiencing a great loss in biodiversity globally and one of the major causes is the infectious disease chytridiomycosis. This disease is ...

The overall goal of this experiment is to observe the affect of amphibian fungal pathogen batrachochytrium dendrobatidis on apoptosis and cell death in the epidermal tissue of frogs. This method can help us understand wildlife disease such as if infection causes cell death or, conversely, if there are immune mechanisms against infection. The main advantage of this technique is that it can be performed on small tissue biopsy samples so that small individuals can be repeatedly sampled throughout the course of infection.To begin this procedure, prepare hydrophilic glass slides with sample tissue as outlined in the text protocol. To deparaffinize the tissue sections, wash the slides three times with xylene for five minutes each in a coplin jar. Next, wash the slides with 100%ethanol two times for five minutes each.After this, wash the slides with 95%ethanol and 70%ethanol for three minutes each. Then, wash the slides once with PBS for five minutes. To prepare experimental and negative control slides, pretreat the tissue by adding freshly diluted proteinase K directly to the slides.Incubate the slides for 10 minutes at room temperature. Then, wash the slides in PBS two times for two minutes each. To prepare positive control slides, pretreat the tissue with DN buffer then incubate the slides at room temperature for five minutes.After this, dissolve DNase one in DN buffer to a final concentration of 0.1 micrograms per milliliter. Add the prepared DNase solution to the slides. Incubate the slides for 15 minutes at room temperature.Then, wash the slides with distilled water in a coplin jar five times for three minutes each. Quench the reaction in 3%hydrogen peroxide in PBS for five minutes at room temperature. Next, wash the slides in PBS two times for two minutes each.Then, add equilibrium buffer to the tissue on the slides. Incubate for 10 seconds at room temperature. Then, tap off the excess liquid around the tissue section.Dilute terminal deoxynucleotidyl transferase enzyme in reaction buffer. Then, add it to the tissue on the experimental and positive control slides. Incubate in a humidified chamber for one hour at 37 degrees Celsius.After this, place the slides in a coplin jar containing the working concentration of stop buffer. Agitate for 15 seconds and then incubate the slides at room temperature for 10 minutes. Then, wash the slides with PBS three times for one minute each and tap off the excess liquid.Next, add the anti-digoxigenin conjugate, prewarmed to room temperature, directly onto the tissue. Incubate the slides for 30 minutes at room temperature in a humidified dark chamber. After the incubation is complete, wash the slides with PBS four times for two minutes each.Tap off any excess liquid. Then, add mounting medium to the slides. Add 15 microliters of DAPI solution to the mounting medium on the slides.Cover each slide with a cover slip and seal with nail polish. Allow the slides to dry in the dark. Using a fluorescent microscope, observe the slides immediately upon completion of the standing process.Take photos at 400 times at random intervals along each skin section. Count DAPI-stained blue cells to ensure at least 100 cells per skin section per animal are visible. Next, count the number of TUNEL-positive cells which appear as red single cells with clear cell edges.To begin, use an inverted light microscope at 40 times to take a photo of each of the frog's toes. Draw lines around the edge of the toe clip and use imaging software to estimate the area within the shape. To evaluate the surface area of the three-dimensional skin sample, multiply the estimated area by pi.To extract proteins from a frozen frog toe sample, place the sample in a 1.5 milliliter screw cap microcentrifuge tube containing 100 microliters of sample buffer and two stainless steel beads. Use a bead beater at maximum speed to lyse the cells. After this, place the tube on ice for three minutes.Then, centrifuge the tube to collect the supernatant. To perform the caspase 3/7 assay in a 384-well plate, add 10 microliters of sample buffer as blank and 10 microliters of protein extract in triplicate. Then, pipette 10 microliters of commercially available caspase 3/7 reagent to the protein extract and blank wells.Then, shake the plate gently for 15 seconds to mix the two reagents. Incubate at room temperature in dark for 30 minutes. Finally, use a luminescent plate reader to measure the luminescence of the sample.In this study, the infected animals depict significantly more TUNEL-positive cells in comparison to control animals as illustrated by red or pink-stained cells. In control animals, there are few TUNEL-positive cells, and they are not concentrated in the epidermis. In infected animals, the TUNEL-positive cells are more frequent in the epidermis.TUNEL-positive cells are more concentrated at and directly adjacent to the sights of infected cells. Also, there are more widespread TUNEL-positive cells over the epidermis and in epidermal layers that are deeper than where the fungal pathogen resided. In infected animals, there are more TUNEL-positive cells in all three skin types with a particularly high level in the thigh and venter skin.In the caspase assay, the infection intensity is positively correlated with caspase 3/7 activity. Additionally, caspase 3/7 activity in infected and uninfected animals differed over time. Caspase 3/7 activity decreased within the first few weeks after inoculation and then increased toward the end of week seven in infected animals.Caspase 3/7 activity remained constant in uninfected individuals. While attempting the procedure for the TUNEL assay, it's important to read the slides on the same day as the assay to avoid loss of sensitivity and to keep the slides in a cool dark place to protect the dyes. After watching this video, you should have a good understanding of how to detect apoptosis and cell death using two different detection methods in small tissue samples like amphibian skin.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

굿 - 트로픽 T 세포의 마이 그 레이션을 공부 경쟁력 호밍 Assays

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

연구

면역학 및 감염병학

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

세포 독성 T Lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

장 상피 세포의 장내 세균의 침입<em&gt; 체외</em&gt; 크게 수직 확산 챔버 모델을 사용하여 향상

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

호스트 세포 RN​​A의 합성에 바이러스 감염의 효과를 측정하는 클릭 화학을 사용하여

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

리보플라빈과 혈소판 제품 및 자외선 치료 : 높은 역가 세균 오염에 대해 효과

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

X 선 결정학, 생물 물리학 및 기능 분석 실험을 사용하면 메커니즘 집행 T 세포 암 항원의 수용체 인식을 확인하는 방법

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

접종<em&gt; 아노 펠 레스 gambiae</emMelanization 면역 반응을 유도하고 측정하는 비즈&gt; 모기

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is ...