Name: using terminal transferase-mediated dutp nick end-labelling (tunel) and caspase 3/7 assays to measure epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis
Uploaded: 2018-05-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling TUNEL and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis at JoV

Мы благодарим следующих людей, которые помогал с земледелия и сбора данных: D. Tegtmeier, C. де Йонг, J. Hawkes, K. Фоссену, S. Персиваль, м. Мак-Вильямс, L. Бертола, м. Стюарт, н. Харни и т. Knavel; и м. Merces для помощи с вскрытия. Мы также хотели бы поблагодарить M. McFadden, P. Харлоу и Таронга зоопарк для повышения л. alpinaи G. Marantelli для повышения P. корробори. Мы благодарим F. Pasmans, A. Martel для консультации по апоптоз анализов, C. Константин, а. Кладник и р. Уэбб для помощи с TUNEL assay, и т. Emeto и W. Weßels для помощи с протоколом и комплект для assay каспазы-3/7. Эта рукопись и протокол заимствован из Brannelly et al 2017 Коллегиального J22.

Университет Джеймса Кука одобрил животных этики в приложениях A1875 P. корробори и A1897 и A2171 для л. alpina.
1. Животноводство и мониторинг
<ol><li>Дом животные индивидуально, в среде подходит для видов, с соответствующим водой, кормления и график уборки. Ежедневно проверяй?...

<ol>
	<li>Stuart, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Status+and+trends+of+amphibian+declines+and+extinctions+worldwide.">Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide.</a> Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).</li><li>Skerratt, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spread+of+chytridiomycosis+has+caused+the+rapid+global+decline+and+extinction+of+frogs.">Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs.</a> EcoHealth. 4, 125-134 (2007).</li><li>Voyles, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+chytridiomycosis,+a+cause+of+catastrophic+amphibian+declines.">Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines.</a> Science. 326 (5952), 582-585 (2009).</li><li>Woodhams, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+trends+associated+with+skin+peptide+defenses+against+chytridiomycosis+in+Australian+frogs.">Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs.</a> Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).</li><li>Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicted+disease+susceptibility+in+a+Panamanian+amphibian+assemblage+based+on+skin+peptide+defenses.">Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses.</a> Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).</li><li>Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+defenses+of+amphibian+skin:+antimicrobial+peptides+and+more.">Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more.</a> Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).</li><li>Savage, A. E., Zamudio, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+genotypes+associate+with+resistance+to+a+frog-killing+fungus.">MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus.</a> PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).</li><li>Bataille, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+amphibians+to+chytridiomycosis+is+associated+with+MHC+class+II+conformation.">Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation.</a> Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127 (2015).</li><li>Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+local+immune+responses+by+the+frog-killing+fungus+Batrachochytrium+dendrobatidis.">Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis.</a> Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).</li><li>Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+chytridiomycosis+on+hematopoietic+tissue+in+the+spleen,+kidney+and+bone+marrow+in+three+diverse+amphibian+species.">Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species.</a> Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069 (2016).</li><li>Brutyn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Batrachochytrium+dendrobatidis+zoospore+secretions+rapidly+disturb+intercellular+junctions+in+frog+skin.">Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin.</a> Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).</li><li>Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+stages+of+the+amphibian+chytrid+Batrachochytrium+dendrobatidis.">Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).</li><li>Pasmans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chytridiomycosis+related+mortality+in+a+midwife+toad+(Alytes+obstetricans)+in+Belgium.">Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium.</a> Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).</li><li>Ellison, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+skin+deep:+Functional+genomic+basis+for+resistance+to+amphibian+chytridiomycosis.">More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis.</a> Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).</li><li>Fites, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+invasive+chytrid+fungus+of+amphibians+paralyzes+lymphocyte+responses.">The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses.</a> Science. 342 (6156), 366-369 (2013).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li><li>Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+determine+specificity+and+sensitivity+of+the+TUNEL+reaction+in+the+quantitation+of+apoptosis.">A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis.</a> American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).</li><li>Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantitative+detection+of+chytridiomycosis+(Batrachochytrium+dendrobatidis)+in+amphibian+samples+using+real-time+Taqman+PCR+assay.">Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).</li><li>Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibians+with+infectious+disease+increase+their+reproductive+effort:+evidence+for+the+terminal+investment+hypothesis.">Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis.</a> Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).</li><li>Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+disinfectants+effective+against+the+amphibian+chytrid+fungus+Batrachochytrium+dendrobatidis.">Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).</li><li>Woods, A., Ellis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Histopathology: A Complete Reference. , (1994).</li><li>Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+cell+death+in+frogs+with+chytridiomycosis.">Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis.</a> PeerJ. 5, e2925 (2017).</li></ol>

Мы исследовали эпидермальный апоптоз и смерть клетки как потенциального механизма патологии chytridiomycosis смертельной болезнью или механизма болезни сопротивления в Bd восприимчивых видов. Мы использовали два метода оценки смерть клетки эпидермиса, assay TUNEL для в месте смерти анал...

Амфибии в настоящее время испытывают один наибольшие потери глобального биоразнообразия любой позвоночных таксонов1. Главной причиной этих падений является фатальным кожи chytridiomycosis болезни, вызванные грибкового патогена Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2. Возбудитель поверхностно заражает эпидермис, что может привести к нарушению функции кожи, что приводит к тяжелой электролита потери, инфаркт миокарда и смерти3. В настоящее время изучаются различные потенциал принимающей иммунные механизмы против Bd , например антимикробных пептидов4,5, кожный бактериальной флоры6, иммунных клеток рецепторов7,8, и активность лимфоцитов9,10. Однако несколько исследований изучить ли эпидермальный апоптоз и клеток смерть является механизм иммунитета против этого смертоносного возбудителя.
Патология Bd -инфекции может быть смерть клетки, apoptosis (запрограммированная смерть клетки) или некроз (незапрограммированным смерти), в эпидермисе. Предыдущие исследования свидетельствуют о том, что инфекция Bd может индуцировать апоптоз, потому что нарушения внутриклеточного соединения наблюдается, когда кожа эксплантов подвергаются zoospore supernatants в vitro11. Кроме того дегенеративные изменения эпидермиса в Bd-инфицированных лягушки наблюдаются с помощью электронной микроскопии12,13. Транскриптомики анализы показывают, что apoptosis пути upregulated в14инфицированных кожи, и амфибии splenocytes проходят apoptosis, когда они подвергаются воздействию Bd supernatants в vitro15. Несмотря на растущий объем доказательств, предполагая, что Bd может вызвать apoptosis и принимающей ячейки смерти в пробирке, в vivo исследований, которые изучить или количественно апоптоз, что отсутствуют механизмы через прогрессирование инфекции. Кроме того это неизвестно, если узел использует апоптоз как оборонительные иммунной стратегия борьбы с Bd инфекции, или если апоптоз патологии заболеваний.
В этом исследовании, мы пытались обнаружить смерть эпидермальные клетки и апоптоз в зараженных животных в естественных условиях с помощью двух методов: assay протеина каспазы-3/7 и терминал dUTP трансферазы опосредованной Ник маркировки конце () в situ assay TUNEL. Как каждый assay обнаруживает различные аспекты смерти клетки16, вместе эти методы обеспечивают полное понимание механизмов, участвующих в смерти клетки и обеспечить точное измерение эффекта. Assay каспазы-3/7 дает количественную оценку деятельности эффекторных caspases 3 и 7, который позволяет количественной оценки как внутренние и внешние апоптоз пути. В противоположность этому TUNEL assay выявляет фрагментацию ДНК, которая вызвана механизмов смерти клеток, включая апоптоза, некроз и pyroptosis17. Мы используем TUNEL assay расследовать на месте гибели клеток в пределах эпидермиса клинически инфицированных и неинфицированных животных, с использованием трех различных кожи секций: спинку, Вентер и бедра корробори Ложные жабы. Этот метод определяет анатомические сайт гибели клеток, а также отличительные его расположение в пределах конкретных слоев эпидермиса. Затем мы используем пробирного каспазы-3/7 провести количественную оценку серии времени апоптоза на протяжении 8-недельного инфекции в Австралийские квакши verreauxii alpina. Мы принимаем образцы кончик пальца две недели от же животных и возможность соотнести возбудителя инфекции нагрузки с активность каспазы-3/7.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>POLARstar Omega</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td>Luminescent plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well flat clear bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well low flange white flat bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Bacteriological (Oxoid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>OXLP0011B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>6764254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactose Broth (Oxoid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>OXCM0137B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricane-S (MS-222)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0872873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15561020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile rayon swab</td>
			<td>Medical Wire &#38; Equipment</td>
			<td>MW-113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S7165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Bradford reagent</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase Glo&#160; 3/7</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0887-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1374248-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin hydrolysate Enzymatic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X)</td>
			<td>Thermo/Life</td>
			<td>20-012-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepman</td>
			<td>Thermo/Life</td>
			<td>4318930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4444556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Axio Scan florescent miscroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Florescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2mm stainless steel beads</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>11079132SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer ITSI-3 Chytr (5&#8242;-CCTTGATATAATACAGTGTGCCATATGTC-3&#8242;)</td>
			<td>Taqman</td>
			<td></td>
			<td>Individual design for primers and probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 5.8S Chytr (5&#8242;-TCGGTTCTCTAGGCAACAGTTT-3&#8242;)</td>
			<td>Taqman</td>
			<td></td>
			<td>Individual design for primers and probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minor groove binder probe Chytr MGB2(5&#8242;-CGAGTCGAAC-3&#8242;)</td>
			<td>Taqman</td>
			<td></td>
			<td>Individual design for primers and probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor-Gene qPCR Instruments</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5ml</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-681-372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture petri plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>263991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>11079105Z</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using terminal transferase-mediated dutp nick end-labelling (tunel) and caspase 3/7 assays to measure epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis

Земноводные испытывают большие потери биоразнообразия во всем мире и одна из основных причин является chytridiomycosis инфекционных заболеваний. Это заболевание обусловлено грибкового патогена Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), который заражает и разрушает лягушка эпидермиса; Однако патологические изменения не характеризовались явным образом. Апоптоз (запрограммированная смерть клетки) может использоваться патогенами для повреждать ткани макроорганизма, но также может быть принимающей механизм болезни сопротивления для удаления патогена. В этом исследовании, мы количественно эпидермальных клеток смерть инфицированных и неинфицированных животных, с использованием двух различных анализов: терминал dUTP трансферазы опосредованной Ник конце маркировки (TUNEL) и caspase 3/7. С помощью вентральных, спинной и ткани кожи бедра в TUNEL assay, мы наблюдаем мобильный смерти клетки эпидермиса в situ клинически зараженных животных и сравнивать гибель клеток с неинфицированным животных с помощью флуоресцентной микроскопии. Для того, чтобы определить, как изменить уровни апоптоз в эпидермисе течение инфекции мы удалить образцы мыс Совет недели над 8-недельного периода и использовать пробирного каспазы-3/7 с извлеченные протеины для количественной оценки деятельности в рамках образцы. Затем мы сопоставляем активность каспазы-3/7 с нагрузкой инфекции. TUNEL assay полезен для локализации клеток смерть на месте, но дорого и времени интенсивно на сэмпл. Assay каспазы-3/7 эффективен для больших выборок и времени курс экспериментов. Однако потому что маленькие лягушки мыс наконечник биопсии имеется ограниченный экстракт для выборки стандартизации через методы количественной оценки белков, таких как assay Брадфорд. Поэтому мы предлагаем оценки площади поверхности кожи через фотографического анализа мыс биопсий, чтобы избежать потребления экстракты во время выборки стандартизации.

TUNEL Assay
Там были более TUNEL позитивные клетки в зараженных животных, чем неинфицированных контрольных животных. В месте расположения TUNEL положительных клеток различались в инфицированных и контроля животных. В животных управле...

Watch this Scientific Journal Video about Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling TUNEL and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis at JoV

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling TUNEL and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

Мы количественно эпидермального клеточной гибели лягушек с chytridiomycosis, с использованием двух методов. Во-первых мы используем маркировки конце терминал dUTP трансферазы опосредованной Ник (TUNEL) в situ гистология для определения различия между клинически инфицированных и неинфицированных животных. Во-вторых мы проводим анализ временных рядов апоптоза над инфекции с помощью анализа белка каспазы-3/7.

С помощью dUTP трансферазы терминал-опосредованной Ник конце маркировки (TUNEL) и Caspase 3/7 Assays для измерения эпидермальный клеточной гибели лягушек с Chytridiomycosis

Amphibians are experiencing a great loss in biodiversity globally and one of the major causes is the infectious disease chytridiomycosis. This disease is ...

The overall goal of this experiment is to observe the affect of amphibian fungal pathogen batrachochytrium dendrobatidis on apoptosis and cell death in the epidermal tissue of frogs. This method can help us understand wildlife disease such as if infection causes cell death or, conversely, if there are immune mechanisms against infection. The main advantage of this technique is that it can be performed on small tissue biopsy samples so that small individuals can be repeatedly sampled throughout the course of infection.To begin this procedure, prepare hydrophilic glass slides with sample tissue as outlined in the text protocol. To deparaffinize the tissue sections, wash the slides three times with xylene for five minutes each in a coplin jar. Next, wash the slides with 100%ethanol two times for five minutes each.After this, wash the slides with 95%ethanol and 70%ethanol for three minutes each. Then, wash the slides once with PBS for five minutes. To prepare experimental and negative control slides, pretreat the tissue by adding freshly diluted proteinase K directly to the slides.Incubate the slides for 10 minutes at room temperature. Then, wash the slides in PBS two times for two minutes each. To prepare positive control slides, pretreat the tissue with DN buffer then incubate the slides at room temperature for five minutes.After this, dissolve DNase one in DN buffer to a final concentration of 0.1 micrograms per milliliter. Add the prepared DNase solution to the slides. Incubate the slides for 15 minutes at room temperature.Then, wash the slides with distilled water in a coplin jar five times for three minutes each. Quench the reaction in 3%hydrogen peroxide in PBS for five minutes at room temperature. Next, wash the slides in PBS two times for two minutes each.Then, add equilibrium buffer to the tissue on the slides. Incubate for 10 seconds at room temperature. Then, tap off the excess liquid around the tissue section.Dilute terminal deoxynucleotidyl transferase enzyme in reaction buffer. Then, add it to the tissue on the experimental and positive control slides. Incubate in a humidified chamber for one hour at 37 degrees Celsius.After this, place the slides in a coplin jar containing the working concentration of stop buffer. Agitate for 15 seconds and then incubate the slides at room temperature for 10 minutes. Then, wash the slides with PBS three times for one minute each and tap off the excess liquid.Next, add the anti-digoxigenin conjugate, prewarmed to room temperature, directly onto the tissue. Incubate the slides for 30 minutes at room temperature in a humidified dark chamber. After the incubation is complete, wash the slides with PBS four times for two minutes each.Tap off any excess liquid. Then, add mounting medium to the slides. Add 15 microliters of DAPI solution to the mounting medium on the slides.Cover each slide with a cover slip and seal with nail polish. Allow the slides to dry in the dark. Using a fluorescent microscope, observe the slides immediately upon completion of the standing process.Take photos at 400 times at random intervals along each skin section. Count DAPI-stained blue cells to ensure at least 100 cells per skin section per animal are visible. Next, count the number of TUNEL-positive cells which appear as red single cells with clear cell edges.To begin, use an inverted light microscope at 40 times to take a photo of each of the frog's toes. Draw lines around the edge of the toe clip and use imaging software to estimate the area within the shape. To evaluate the surface area of the three-dimensional skin sample, multiply the estimated area by pi.To extract proteins from a frozen frog toe sample, place the sample in a 1.5 milliliter screw cap microcentrifuge tube containing 100 microliters of sample buffer and two stainless steel beads. Use a bead beater at maximum speed to lyse the cells. After this, place the tube on ice for three minutes.Then, centrifuge the tube to collect the supernatant. To perform the caspase 3/7 assay in a 384-well plate, add 10 microliters of sample buffer as blank and 10 microliters of protein extract in triplicate. Then, pipette 10 microliters of commercially available caspase 3/7 reagent to the protein extract and blank wells.Then, shake the plate gently for 15 seconds to mix the two reagents. Incubate at room temperature in dark for 30 minutes. Finally, use a luminescent plate reader to measure the luminescence of the sample.In this study, the infected animals depict significantly more TUNEL-positive cells in comparison to control animals as illustrated by red or pink-stained cells. In control animals, there are few TUNEL-positive cells, and they are not concentrated in the epidermis. In infected animals, the TUNEL-positive cells are more frequent in the epidermis.TUNEL-positive cells are more concentrated at and directly adjacent to the sights of infected cells. Also, there are more widespread TUNEL-positive cells over the epidermis and in epidermal layers that are deeper than where the fungal pathogen resided. In infected animals, there are more TUNEL-positive cells in all three skin types with a particularly high level in the thigh and venter skin.In the caspase assay, the infection intensity is positively correlated with caspase 3/7 activity. Additionally, caspase 3/7 activity in infected and uninfected animals differed over time. Caspase 3/7 activity decreased within the first few weeks after inoculation and then increased toward the end of week seven in infected animals.Caspase 3/7 activity remained constant in uninfected individuals. While attempting the procedure for the TUNEL assay, it's important to read the slides on the same day as the assay to avoid loss of sensitivity and to keep the slides in a cool dark place to protect the dyes. After watching this video, you should have a good understanding of how to detect apoptosis and cell death using two different detection methods in small tissue samples like amphibian skin.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Конкурентные Homing Анализы по изучению тропических Гут-Т-клеток миграции

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Методы оценки бета опосредованная гибель клеток от цитотоксических Т-лимфоцитов

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Количественный<em&gt; В пробирке</em&gt; Анализе на определение адгезию нейтрофилов к активированным Первичные человеческие эндотелиальные клетки микрососудов в статических условиях

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Кишечные бактериальной инвазии эпителиальных клеток кишечника<em&gt; In Vitro</em&gt; Резко усиливается с помощью вертикальной модели диффузионной камере

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Использование химии Нажмите для оценки влияния вирусной инфекции на клетки-хозяина синтеза РНК

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Клеточная проточной цитометрии измерить цитотоксическую активность

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Лечение тромбоцитов Продукты с рибофлавин и УФ света: эффективность против высокий титр бактериального загрязнения

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Нейтрофильная Выделение и анализ для определения их роли в клеточной лимфомы чувствительность к терапевтических агентов

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

С помощью рентгеновской кристаллографии, биофизики и функциональными пробами, чтобы определить механизмы управляющих Т-клеточного рецептора распознавания рака антигенам

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

затравочный<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Комары с бусами для индуцирования и измерить меланизации иммунный ответ

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is ...