Name: quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in caenorhabditis elegans by nile red and oil red o staining
Uploaded: 2018-03-05T14:00:00
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Este trabajo fue posible por la concesión de NIH: R01GM109028 (criador)

1. el Nilo rojo (NR) tinción de lípidos
<ol><li>Preparación de solución 5 mg/mL NR<ol>
<li>En una botella de 500 mL, añadir 100 mg de polvo NR a 200 mL de acetona al 100%.</li>
		<li>Cubrir la botella con papel de aluminio para evitar cualquier exposición a la luz.</li>
		<li>Antes de usar, agitar la solución durante 2 h en la oscuridad.</li>
		<li>Para uso a largo plazo, guarde la solución NR en un frasco bien sellado sin ninguna exposición a la luz. Solución madre de escala NR según las necesidades de inve...

<ol>
	<li>Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+red:+a+selective+fluorescent+stain+for+intracellular+lipid+droplets.">Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets.</a> J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).</li><li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+at+a+glance.">Lipid droplets at a glance.</a> J Cell Sci. 122 (6), 749-752 (2009).</li><li>Horobin, R. W., Kiernan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conn's biological stains: a handbook of dyes, stains and fluorochromes for use in biology and medicine. , (2002).</li><li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+the+worm:+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research.">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angew Chem Int Edit. 50 (21), 4774-4807 (2011).</li><li>Khanna, A., Johnson, D. L., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+for+mafr-1+in+reproduction+and+lipid+homeostasis.">Physiological roles for mafr-1 in reproduction and lipid homeostasis.</a> Cell Rep. 9 (6), 2180-2191 (2014).</li><li>Lynn, D. A., Dalton, H. M., Sowa, J. N., Wang, M. C., Soukas, A. A., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omega-3+and-6+fatty+acids+allocate+somatic+and+germline+lipids+to+ensure+fitness+during+nutrient+and+oxidative+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Omega-3 and-6 fatty acids allocate somatic and germline lipids to ensure fitness during nutrient and oxidative stress in Caenorhabditis elegans.</a> P Natl Acad Sci USA. 112 (50), 15378-15383 (2015).</li><li>Pang, S., Lynn, D. A., Lo, J. Y., Paek, J., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKN-1+and+Nrf2+couples+proline+catabolism+with+lipid+metabolism+during+nutrient+deprivation.">SKN-1 and Nrf2 couples proline catabolism with lipid metabolism during nutrient deprivation.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li><li>Saltiel, A. R., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+signalling+and+the+regulation+of+glucose+and+lipid+metabolism.">Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism.</a> Nature. 414 (6865), 799-806 (2001).</li><li>Witting, M., Schmitt-Kopplin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+lipidome:+A+primer+for+lipid+analysis+in+Caenorhabditis+elegans.">The Caenorhabditis elegans lipidome: A primer for lipid analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Arch Biochem Biophys. 589, 27-37 (2016).</li><li>Yen, K., Le, T. T., Bansal, A., Narasimhan, S. D., Cheng, J. X., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+fat+storage+quantitation+in+nematode+Caenorhabditis+elegans+using+label+and+label-free+methods.">A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods.</a> PloS One. 5 (9), e12810 (2010).</li><li>Zhang, Y., Zou, X., Ding, Y., Wang, H., Wu, X., Liang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+genomics+and+functional+study+of+lipid+metabolic+genes+in+Caenorhabditis+elegans.">Comparative genomics and functional study of lipid metabolic genes in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Genomics. 14 (1), 164 (2013).</li><li>Folick, A., Min, W., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+lipid+dynamics+using+Coherent+Anti-stokes+Raman+Scattering+(CARS)+and+Stimulated+Raman+Scattering+(SRS)+microscopy.">Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy.</a> Curr Opin Genet Dev. 21 (5), 585-590 (2011).</li><li>Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+high+throughput+microscopic+assessment+of+fat+mass+in+Caenorhabditis+elegans.">Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans.</a> J Vis Exp. (73), (2013).</li><li>O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+major+fats+are+stored+in+vesicles+distinct+from+lysosome-related+organelles.">C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles.</a> Cell Metab. 10 (5), 430-435 (2009).</li></ol>

El aumento de la obesidad y las tasas de enfermedad metabólica hace que C. elegans un modelo adecuado para estudiar los mecanismos que regulan la acumulación de grasa en las células y tejidos. La evidencia reciente sugiere que los cambios en los niveles de lípidos están correlacionados con los procesos celulares que van desde8, la activación de la hormona receptores2, salida reproductiva5de señalización de la insulina. En comparació...

Los lípidos son esenciales para la vida. Son componentes integrales de las membranas, actúan como mensajeros secundarios y transductores de señales y tienen funciones cruciales en almacenamiento de energía. Cuando el metabolismo lipídico se altera, conduce a enfermedades como obesidad y diabetes tipo II, que están presionando de preocupaciones de salud pública9. Elegans de Caenorhabditis (C. elegans) es un organismo modelo excelente estudiar el metabolismo de los lípidos ya que tiene un ciclo de vida relativamente corto, un cuerpo transparente, un linaje de la célula conocidos y un genoma completamente secuenciado. Principalmente un hermafrodita C. elegans permite a los investigadores levantar grandes cantidades de animales isogénicas en breve períodos de tiempo a realizar alto rendimiento adelantados pantallas genéticas para estudiar una amplia gama de genes y rutas metabólicas4. Este enfoque ha revelado un alto grado de conservación de genes de metabolismo de lípido de C. elegans 273 entre los seres humanos, ratones, ratas y drosophila. Además, más de 300 genes de lípido en C. elegans tienen orthologues humano que están asociadas con enfermedades no relacionadas con el síndrome metabólico11. Tradicionalmente, examen del almacenaje del lípido en C. elegans ha dependido sobre todo de ensayos marcados con tinte, que proporcionan información confiable sobre la acumulación de lípidos. Menos común es una descripción de donde localización los lípidos y medidas diferencias en abundancia de lípidos en los tejidos. Sin embargo, trabajo reciente ha revelado que la distribución de lípidos puede ser tan importante como la acumulación de lípidos6.
Últimamente, los estudios han comenzado a integrar métodos tales como alto rendimiento líquido cromatografía-espectrometría de masas (HPLC-MS), cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), y anti-stokes coherente microscopia de Raman dispersión (coches) a la dirección del deficiencias de los enfoques basados en la mancha analizando directamente el contenido de extractos de lípidos y fracciones de lípidos específicos depósitos de lípido, respectivamente10,11. Por otra parte, microscopia de coches ha revelado que el rojo Nilo sólo puede servir como un proxy para la acumulación de grasa cuando se utiliza como un colorante fijador, para su uso como una tinción vital conduce al objetivo de tinción de organelos fluorescentes auto10. Sin embargo, los conocimientos técnicos requeridos y los costos asociados con estos cromatografía y los métodos de microscopía hacen su uso insostenible para muchas preguntas de investigación. En este artículo, discutimos un método conveniente y confiable para fijar y depósitos de lípidos neutros en C. elegans con Nilo rojo de la mancha y aceite O rojo para distinguir la abundancia de lípidos en animales enteros y en tejidos específicos.
Nilo rojo, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, es un tinte benzophenoxazone que fácilmente se disuelve en disolventes orgánicos varios, pero sobre todo es insoluble en agua. Es un excelente lysochrome colorante utilizado para teñir lípidos neutros como los triglicéridos o ésteres de colesterol ya que cuenta con un color fuerte, solubiliza bien en lípidos tiene insignificante interacción con los tejidos circundantes y es menos solubles en el solvente que en lípidos. Tiene una máxima excitación y de emisión de 450-500 y 520 nm, respectivamente1. Cuando Nilo teñido de rojo C. elegans para la fluorescencia verde, cuerpos lípidos discreta pueden ser observados a lo largo del intestino y otros tejidos ya sea en grupos o disperse uniformemente, dependiendo del genotipo del animal o el tratamiento experimental 7.
Aceite rojo O es a lysochrome, soluble en la grasa colorante utilizado para teñir los triglicéridos y las lipoproteínas. Se llama un colorante azo porque su estructura química contiene dos grupos azo a tres anillos aromáticos. Es difícil ionizar, que hace que sea altamente soluble en lípidos. Su color de tinte es rojo y su absorción de la luz máxima es 518 nm 3. C. elegans manchado con aceite O rojo muestran gotas lipídicas rojo que destacan contra el cuerpo del animal transparente, que facilita la evaluación cualitativa de la distribución de lípidos entre los tejidos diferentes6.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Imager.M2m Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERC5s camera</td>
			<td>Axiocam</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Color-capable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRm camera</td>
			<td>Axiocam</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Fluorescence-capable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N1142</td>
			<td>Lipid Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil red O</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12989</td>
			<td>Lipid Stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>DNA stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH1133-1LP</td>
			<td>Fixative solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m seterile syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-477</td>
			<td>Cellulose acetate filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428000015</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Rotisserie</td>
			<td>Lab Quake</td>
			<td>400110Q</td>
			<td>Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10136-084</td>
			<td>Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7758-11-4</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>7786-30-3</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57-88-5</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>L9110</td>
			<td>NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3147</td>
			<td>Bacterial growth</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in caenorhabditis elegans by nile red and oil red o staining

Caenorhabditis elegans es un organismo modelo excepcional en el que estudiar el metabolismo de los lípidos y la homeostasis de la energía. Muchos de sus genes de lípidos se conservan en los seres humanos y están asociados con el síndrome metabólico u otras enfermedades. Examen de la acumulación de lípidos en este organismo puede realizarse por fijadores colorantes o métodos libres de etiqueta. Manchas de fijador como Nilo rojo y aceite O rojo son maneras baratas, confiables para medir cuantitativamente los niveles de lípidos y observar cualitativamente la distribución de lípidos a través de los tejidos, respectivamente. Por otra parte, estas manchas permiten proyección de alto rendimiento de varios genes del metabolismo de lípidos y vías. Además, su carácter hidrofóbico facilita la solubilidad en lípidos, reduce la interacción con los tejidos circundantes y evita la disociación en el solvente. Aunque estos métodos son eficaces en el examen de contenido lipídico general, no proporcionan toda la información sobre la composición química y la diversidad de los depósitos de lípidos. Para estos propósitos, métodos libres de etiqueta tales como microscopia de GC-MS y los coches son mejores satisfecho, sus costos no obstante.

SKN-1 es un bZip, factor de transcripción de cytoprotective que comparte homología con NRF2 mamíferos y se ha demostrado para mediar la oxidación de los ácidos grasos. Dependiendo de la concentración de glucosa en su dieta, gusanos con un alelo activado constitutivamente skn-1 muestran los niveles de lípidos diferentes cuando manchados con rojo Nilo7. Figura 1A -C muestra activado skn-1 animale...

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Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Cuantificación de lípidos abundancia y evaluación de la distribución de lípidos en Caenorhabditis elegans por Nilo rojo y aceite rojo O manchas

Nilo rojo de fijo Caenorhabditis elegans es un método para la medición cuantitativa de los depósitos de lípidos neutros, mientras que el aceite rojo O tinción facilita la evaluación cualitativa de la distribución de lípidos entre los tejidos.

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

The overall goal of these staining methods is to quantify intracellular lipid abundance and evaluate lipid distribution among different tissues. This method can help answer key questions in lipid metabolism such as how are lipids genetically and biochemically regulated and which disease states this regulate lipid homeostasis. The main advantage of this technique is that it is relatively simple and inexpensive to carry out.To carry out Nile Red lipid staining, plate worms on Nematode Growth Medium or NGM seeded with late log OP50 E.coli and grow the worms at 20 degrees Celsius to early L4 stage. Wash the worms with one millimeter of PBST solution and transfer the worm suspension to a 1.5 milliliter microfuge tube. Centrifuge the worms at 560 times gravity for one minute.Then remove the supernatant and repeat the PBST wash until the E.coli is cleared from the suspension. Next, to the worm pellet, add 100 microliters of 40%isopropanol or 60%for ORO staining and incubate the sample at room temperature for three minutes. The addition of isopropanol is crucial for proper permeabilization of the worms before staining.Centrifuge the worms at 560 times gravity for one minute and remove the supernatant without disrupting the worm pellet. It is important to minimize light exposure during the centrifugation steps. Now while in the dark, add 600 microliters of previously prepared NR working solution to each sample.Invert the tubes three times and fully mix the worms and solution. Then incubate the sample in the dark at room temperature for two hours. Following incubation, centrifuge the worms and remove the supernatant.Then add 600 microliters of PBST and incubate the samples in the dark for 30 minutes to remove the excess NR stain. After spinning the samples again as before, remove all but approximately 50 microliters of supernatant and resuspend the worm pellet in the remaining solution. To prepare slides for imaging, pipette five microliters of worm suspension onto a microscope slide and carefully apply a coverslip to avoid trapping any air bubbles.Using the FITC GFP channel to image NR stained worms and trying different exposure times, image the worms at five-fold magnification to capture several animals per field of view. Then switch to 10-fold magnification for better quantification of individual worms. To quantify the images, upload the micrographs to ImageJ.In the image pull down menu, adjust the brightness, contrast of the image deck, and propagate changes to all the images by clicking apply. Use the polygon selection tool to delineate each imaged worm and under the analysis pull down menu, use the measure function to qualify fluorescence intensity emitted by NR.For each image, measure five background locations and calculate the average background fluorescence intensity. Add 600 microliters of Oil Red O or ORO working solution to each sample and invert the tube three times to mix the worms well and the ORO.Rotate the samples at 30 RPM and RT for two hours. Centrifuge the samples at 560 times gravity for one minute and aspirate all the supernatant except for 100 microliters. Then use 600 microliters of PBST to resuspend the samples and rotate the tubes at 30 RPM for 30 minutes to remove excess ORO staining.To better distinguish the location of the animals'germ line in the intestinal cells, stain nuclei by adding one microliter of DAPI for every one milliliter of ORO working solution. Then to prepare slides for imaging, resuspend the worms and the remaining supernatant and mix the solution well. Put five microliters of worm suspension on a microscope slide and carefully apply a coverslip ensuring that no air bubbles form.To image the ORO stained worms, use a color capable camera at five-fold magnification to image several worms in one field of view. Then switch to 10-fold magnification for better examination of individual worms. Finally, after uploading the images to ImageJ and creating an image deck according to the text protocol, categorize the images according to lipid accumulation throughout the animal's body or in specific tissues.SKN-1 shares homology with mammalian Nrf2 and has been shown to mediate fatty acid oxidation. This figure shows activated SKN-1 animals exposed to conditions that lead to increasing lipid levels. As seen in these images, NR fluorescence captured using the FITC GFP channel is prominent along the intestine, but is dimmer in the head, tail, and intestinal lumen.While it is easy to categorize the worms according to the presence or absence of Age-dependent Somatic Depletion of Fat or ASDF, it may be difficult to identify animals with intermediate fat loss. Compared to non-ASDF animals, which show bright red staining throughout the body with few translucent areas, ASDF worms exhibit noticeable fat depletion in intestinal cells. Animals in the process of developing ASDF often show translucent spots where most of the fat loss eventually occur.Moreover, ASDF worms may still feature bright red staining in the head and tail regions because the phenotype is not defined by complete somatic fat loss, but by extensive fat depletion relative to non-aged animals. Once mastered, this technique can be done in three hours plus imaging time if it is performed properly. While attempting this procedure, it's important to remember to wash and permeabilize worms no more than 30 minutes before staining.Following this procedure, other methods like CARS microscopy can be performed to compare the type of lipid species each technology identifies and to determine which method is better suited for specific types of questions. After watching this video, you should have a good understanding of how to quantify lipids and evaluate lipid distribution in the worms using Nile Red and Oil Red O staining, followed by ImageJ micrograph analysis.

Research

JoVE Journal

Biology

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Investigación

Biología

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Aging is a complex process characterized by progressive physiological changes resulting from both environmental and genetic contributions. Lipids are ...

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