Name: live cell imaging of chromosome segregation during mitosis
Uploaded: 2018-03-14T15:00:00
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Gostaríamos de agradecer a Dr. Guo-Chiuan Hung e Dr. Bharatkumar Joshi comentários valiosos que melhorou o manuscrito.

Todos os experimentos realizados nestes estudos foram realizados em conformidade com os protocolos aprovados pelo Comitê de uso e cuidado institucional do Animal no centro de pesquisa do Food and Drug Administration (FDA).
1. isolamento e cultura de fibroblastos embrionários de Mouse (MEFs)
<ol><li>Isole os fibroblastos embrionários do rato (MEFs) de uma estirpe de PP2A-B56γ-rato e tipo selvagem littermates pelo protocolo padrão 7,8</...

<ol>
	<li>Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+in+CIN:+Mitotic+Infidelity+and+Its+Consequences+for+Tumor+Promotion+and+Suppression.">Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression.</a> Dev Cell. 39, 638-652 (2016).</li><li>Etemad, B., Kops, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attachment+issues:+kinetochore+transformations+and+spindle+checkpoint+silencing.">Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing.</a> Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).</li><li>Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+assembly+checkpoint.">The spindle assembly checkpoint.</a> Curr Biol. 22, 966-980 (2012).</li><li>Jallepalli, P. V., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+segregation+and+cancer:+cutting+through+the+mystery.">Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery.</a> Nat Rev Cancer. (2), 109-117 (2001).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+protein+CSPP1+interacts+with+CENP-H+protein+to+coordinate+accurate+chromosome+oscillation+in+mitosis.">Mitotic protein CSPP1 interacts with CENP-H protein to coordinate accurate chromosome oscillation in mitosis.</a> J Biol Chem. 290 (45), 27053-27066 (2015).</li><li>Pikor, L., Thu, K., Vucic, E., Lam, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+and+implication+of+genome+instability+in+cancer.">The detection and implication of genome instability in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 32 (3-4), 341-352 (2013).</li><li>Varadkar, P., Despres, D., Kraman, M., Lozier, J., Phadke, A., Nagaraju, K., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+phosphatase+2A+B56&#947;+regulatory+subunit+is+required+for+heart+development.">The protein phosphatase 2A B56&#947; regulatory subunit is required for heart development.</a> Dev Dyn. 243 (6), 778-790 (2014).</li><li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells+Suitable+for+Culturing+Human+Embryonic+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (64), e3854 (2012).</li><li>Varadkar, P., Abbasi, F., Takeda, K., Dyson, J. J., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PP2A-B56&#947;+is+required+for+an+efficient+spindle+assembly+checkpoint.">PP2A-B56&#947; is required for an efficient spindle assembly checkpoint.</a> Cell Cycle. 18 (12), 1210-1219 (2017).</li><li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschl&#228;ger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle.">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nat Protoc. 8 (3), 602-626 (2013).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques.">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).</li><li>Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+reveals+LINC+complex+recruitment+at+nuclear+indentation+sites.">Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites.</a> Sci Rep. 8 (4), 7362 (2014).</li><li>Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spindle+Assembly+Checkpoint+Is+Not+Essential+for+Viability+of+Human+Cells+with+Genetically+Lowered+APC/C+Activity.">The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity.</a> Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).</li><li>Iuso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+Expression+of+Human+Protamine+1+(hPrm1)+Remodels+Fibroblast+Nuclei+into+Spermatid-like+Structures.">Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures.</a> Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).</li><li>Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+and+perspectives+on+stem+cell-based+therapies+undergoing+clinical+trials+for+regenerative+medicine:+case+studies.">Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies.</a> Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).</li></ol>

Ciclo celular controle postos de controle que garantem a segregação do cromossomo precisa evitar aneuploidia e célula transformação 1,2,3. No presente estudo, encontramos essa inativação de PP2A-B56γ resultou em um posto de montagem do eixo enfraquecido. Imagem de célula viva nos permitiu observar a segregação de mis cromossômica durante a mitose em MEFs PP2A-B56γ tratados com nocodazole 9.</...

O seguinte protocolo, descrevemos um método conveniente para visualizar a segregação cromossômica e progressão mitótica durante o ciclo celular em fibroblastos embrionários de rato usando histona 2B-GFP, BacMam 2.0 rotulagem e imagens de células vivas.
Postos de controle do ciclo celular monitorar a segregação do cromossomo e desempenham um papel importante na manutenção da integridade genética das células 1,2,3. Acumulação de cromossomos mis segregados pode levar à aneuploidia, que é uma marca registrada de mais sólido tumores 4. Daí, deteção de retardamento cromossomos pode ser usada como um método para estudar a instabilidade cromossômica.
Fluorescente etiquetado proteínas podem ser usado para visualizar a segregação do cromossomo ao vivo e cromossômicas atraso mas a geração de mCherry-tag ou proteína H2B-GFP com a tag requer conhecimento substancial do gene entrega e biologia molecular 5. Aqui nós descrevemos o uso do reagente de CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0, doravante chamado regente CL-HB, por razões de simplicidade. Este reagente pode ser usado imediatamente e, portanto, elimina as preocupações sobre o vetor de qualidade e integridade. Além disso, este reagente não requer o uso de tratamentos potencialmente prejudiciais ou lipídios e produtos químicos de tintura-carregamento. Ao contrário de etiquetas fluorescentes convencionais, o regente de CL-HB manchas independentemente de função (i. e., potencial de membrana). O regente de CL-HB pode ser simplesmente adicionado às células e incubado durante a noite para a expressão da proteína. O regente de CL-HB não replicar em células de mamíferos e pode ser usado em configurações de 1 laboratório nível de biossegurança (BSL). Também, este transfecção transiente pode ser detectada após incubação durante a noite por até 5 dias, tempo suficiente para efectuar análises de celulares mais dinâmicas.
Alternativamente, anormalidades cromossômicas poderiam ser estudadas por várias técnicas como citometria de fluxo, imuno-histoquímica ou fluorescência em situ hybridization (FISH) 6. Citometria de fluxo pode ser usada para estudar aneuploidia, que pode ser medida com base no conteúdo de DNA e a fase das células no ciclo celular. Apesar de citometria de fluxo pode ser usada para medir a aneuploidia, ele não fornece informações sobre segregação cromossômica de mis. Técnicas de peixes e imuno-histoquímica usam sondas fluorescentes para ligar ao DNA ou cromossomos. Enquanto essas técnicas fornecem um instantâneo do status de uma população de células, eles não permitem célula viva imagem faltando, assim, qualquer informação obtida através da visualização spatiotemporal de citocinese em células específicas, seguido por um período de tempo.
Este protocolo foi utilizado para estudar os cromossomas menos desenvolvidas ou cromossômica mis segregação em nocodazole Tratado rato embrionárias fibroblastos (MEFs) isoladas de PP2A-B56γ-ratos. Além de acima de aplicativo, este protocolo fornece uma ferramenta simples para rotular e visualizar a segregação cromossômica em vários tipos de células, que pode ser usado para estudar a regulação do ciclo celular ou instabilidade cromossômica em células tumorais. Além disso, ele pode também ser usado para estudar a instabilidade cromossômica causada por vários tratamentos com drogas ou para estudar os efeitos do gene nocaute resultando em segregação cromossômica de mis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:644px;" width="645">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:128px;">11320082</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">MEM Non-Essential amino acids solution (100X)</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered saline</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:135px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td>MX 1458-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryogenic vial storage boxes</td>
			<td style="width:135px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:128px;">10-500-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Cryogenic vials</td>
			<td style="width:135px;">Corning/costar</td>
			<td align="right">431416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">T75 flasks</td>
			<td style="width:135px;">Cellstar</td>
			<td align="right" style="width:128px;">658175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">2 well chambered cover glass</td>
			<td style="width:135px;">Nunc</td>
			<td style="width:128px;">155380PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Cellometer Vision Cell Profiler</td>
			<td style="width:135px;">Nexcelom Bioscience LLC</td>
			<td style="width:128px;">Cellometer Vision Trio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:128px;">C10594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system</td>
			<td style="width:135px;">Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td style="width:128px;">Zeiss Cell Observer SD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Water Bath</td>
			<td style="width:135px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:128px;">280 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Incubator</td>
			<td style="width:135px;">Sanyo commercial solutions</td>
			<td style="width:128px;">MCO-18AIC (UV)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Class II Biological safety cabinet</td>
			<td style="width:135px;">The Baker Company</td>
			<td style="width:128px;">SterilGard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Axiovision software</td>
			<td style="width:135px;">Zeiss</td>
			<td style="width:128px;">Ver.4.8.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:135px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:128px;">Ver. 1.51r</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging of chromosome segregation during mitosis

Cromossomos devem ser confiável e uniformemente agrupados em células-filhas durante a divisão celular mitótica. Fidelidade de segregação cromossômica é controlada por vários mecanismos que incluem o Checkpoint do fuso de Assembly (SAC). O SAC é parte de um sistema de realimentação complexo que é responsável pela prevenção de um progresso de célula através de mitose, a menos que todos os cinetócoros cromossômicos tem anexado para eixo de microtúbulos. Guarnição cromossómica e cromossomo anormal segregação é um indicador de disfuncional ciclo celular postos de controle e pode ser usada para medir a estabilidade genômica de dividir células. Desregulamentação do saco pode resultar na transformação de uma célula normal em uma célula maligna através da acumulação de erros durante a segregação cromossômica. Implementação do saco e a formação de complexos o cinetócoro estão fortemente regulamentados pelas interações entre quinase e fosfatase, tais como a proteína fosfatase 2A (PP2A). Este protocolo descreve a imagem de célula viva de retardamento de cromossomos em fibroblastos embrionários de rato isolados de ratos que tinham um nocaute de subunidade reguladora PP2A-B56γ. Esse método supera os defeitos do outros ciclo celular controle técnicas de imagem como citometria de fluxo ou imunocitoquímica que fornecem apenas um instantâneo de um estatuto de citocinese células, em vez de uma visualização dinâmica spatiotemporal de cromossomos durante a mitose.

MEFs de tipo selvagem e PP2A-B56γ-ratos foram semeadas em um vidro de tampa de câmara de 2-poço e permitidos anexar. No dia 2, MEFs foram sincronizados usando 0.1% FBS por 24 h. No dia 3, MEFs na mídia com 200 ng/mL nocodazole e regentwere de PPC CL-HB 30 incubados por 18 h em 37° C e 5% CO2. No dia 4, as células foram fotografadas usando um sistema de microscópio confocal de disco giratório (Figura 1). Viver imagem latente da pi...

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Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Este protocolo descreve um método fácil e conveniente para rotular e Visualizar ao vivo cromossomos em células mitóticas usando Histone2B-GFP BacMam 2.0 label e um sistema de microscopia confocal de disco girando.

Imagem de célula viva de segregação do cromossomo durante a mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

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