Name: deep vein thrombosis induced by stasis in mice monitored by high frequency ultrasonography
Uploaded: 2018-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione dal cuore e Stroke Foundation of Canada e da The Morris e Bella Fainman Family Foundation. Gli autori vorrei ringraziare Veronique Michaud per il suo aiuto tecnico con il sistema di imaging ad ultrasuoni VEVO770.

Tutte le procedure sono state approvate dal istituzionale animale cura Comitato della McGill University Montreal, QC, Canada. Tutte le attrezzature necessarie sono elencata nella tabella I.
1. murino (C57BL/6J) IVC stasi protocollo
<ol><li>Preparazione all'intervento Nota: Questo è un intervento chirurgico di sopravvivenza e di conseguenza, un'adeguata tecnica asettica deve essere seguita in ogni momento. Questo include assicurandosi che tutti i materiali sono a portata ...

<ol>
	<li>Fowkes, F. J., Price, J. F., Fowkes, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+diagnosed+deep+vein+thrombosis+in+the+general+population:+systematic+review.">Incidence of diagnosed deep vein thrombosis in the general population: systematic review.</a> Eur J Vasc Endovasc Surg. 25 (1), 1-5 (2003).</li><li>McGuinness, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+labelled+monocytes+by+experimental+venous+thrombi.">Recruitment of labelled monocytes by experimental venous thrombi.</a> Thromb Haemost. 85 (6), 1018-1024 (2001).</li><li>Singh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+of+thrombus+to+resolve+in+urokinase-type+plasminogen+activator+gene-knockout+mice:+rescue+by+normal+bone+marrow-derived+cells.">Failure of thrombus to resolve in urokinase-type plasminogen activator gene-knockout mice: rescue by normal bone marrow-derived cells.</a> Circulation. 107 (6), 869-875 (2003).</li><li>Itoh, K., Ieko, M., Hiraguchi, E., Kitayama, H., Tsukamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+kinetics+of+99mTc+labeled+recombinant+tissue+plasminogen+activator+in+rabbits.">In vivo kinetics of 99mTc labeled recombinant tissue plasminogen activator in rabbits.</a> Ann Nucl Med. 8 (3), 193-199 (1994).</li><li>Kang, C., Bonneau, M., Brouland, J. P., Bal dit Sollier, C., Drouet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+pig+models+of+venous+thrombosis+mimicking+human+disease.">In vivo pig models of venous thrombosis mimicking human disease.</a> Thromb Haemost. 89 (2), 256-263 (2003).</li><li>Knight, L. C., Baidoo, K. E., Romano, J. E., Gabriel, J. L., Maurer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pulmonary+emboli+and+deep+venous+thrombi+with+99mTc-bitistatin,+a+platelet-binding+polypeptide+from+viper+venom.">Imaging pulmonary emboli and deep venous thrombi with 99mTc-bitistatin, a platelet-binding polypeptide from viper venom.</a> J Nucl Med. 41 (6), 1056-1064 (2000).</li><li>Wakefield, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venous+thrombosis+prophylaxis+by+inflammatory+inhibition+without+anticoagulation+therapy.">Venous thrombosis prophylaxis by inflammatory inhibition without anticoagulation therapy.</a> J Vasc Surg. 31 (2), 309-324 (2000).</li><li>Robins, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Gas6+contributes+to+thrombogenesis+and+promotes+tissue+factor+up-regulation+after+vessel+injury+in+mice.">Vascular Gas6 contributes to thrombogenesis and promotes tissue factor up-regulation after vessel injury in mice.</a> Blood. 121 (4), 692-699 (2013).</li><li>Aghourian, M. N., Lemarie, C. A., Bertin, F. R., Blostein, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E+synthase+is+upregulated+by+Gas6+during+cancer-induced+venous+thrombosis.">Prostaglandin E synthase is upregulated by Gas6 during cancer-induced venous thrombosis.</a> Blood. 127 (6), 769-777 (2016).</li><li>Laurance, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas6+(Growth+Arrest-Specific+6)+Promotes+Inflammatory+(CCR2hiCX3CR1lo)+Monocyte+Recruitment+in+Venous+Thrombosis.">Gas6 (Growth Arrest-Specific 6) Promotes Inflammatory (CCR2hiCX3CR1lo) Monocyte Recruitment in Venous Thrombosis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. , (2017).</li><li>Diaz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+review+of+mouse+models+of+venous+thrombosis.">Critical review of mouse models of venous thrombosis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (3), 556-562 (2012).</li><li>Aghourian, M. N., Lemarie, C. A., Blostein, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+monitoring+of+venous+thrombosis+in+mice.">In vivo monitoring of venous thrombosis in mice.</a> J Thromb Haemost. 10 (3), 447-452 (2012).</li><li>Brandt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+vein+thrombus+formation+induced+by+flow+reduction+in+mice+is+determined+by+venous+side+branches.">Deep vein thrombus formation induced by flow reduction in mice is determined by venous side branches.</a> Clin Hemorheol Microcirc. 56 (2), 145-152 (2014).</li><li>Diaz, J. A., Farris, D. M., Wrobleski, S. K., Myers, D. D., Wakefield, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferior+vena+cava+branch+variations+in+C57BL/6+mice+have+an+impact+on+thrombus+size+in+an+IVC+ligation+(stasis)+model.">Inferior vena cava branch variations in C57BL/6 mice have an impact on thrombus size in an IVC ligation (stasis) model.</a> J Thromb Haemost. 13 (4), 660-664 (2015).</li><li>Luther, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Effector-Memory+T+Cell+Activation+Regulates+Post-Thrombotic+Vein+Wall+Inflammation+and+Thrombus+Resolution.">Innate Effector-Memory T Cell Activation Regulates Post-Thrombotic Vein Wall Inflammation and Thrombus Resolution.</a> Circ Res. , (2016).</li><li>Subramaniam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+contributions+of+complement+factors+to+platelet+activation+and+fibrin+formation+in+venous+thrombus+development.">Distinct contributions of complement factors to platelet activation and fibrin formation in venous thrombus development.</a> Blood. 129 (16), 2291-2302 (2017).</li><li>Diaz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombogenesis+with+continuous+blood+flow+in+the+inferior+vena+cava.+A+novel+mouse+model.">Thrombogenesis with continuous blood flow in the inferior vena cava. A novel mouse model.</a> Thromb Haemost. 104 (2), 366-375 (2010).</li></ol>

Ci sono diversi passaggi critici per la formazione del trombo venoso successo utilizzando il modello di stasi. Induzione di trombosi della vena è più impegnativo in vecchi topi dovuta all'accumulo di grasso che circonda la vena cava inferiore e l'aorta. Idealmente, i topi sottoposti a questa procedura dovrebbero essere 8 - 10 settimane fa. Dovrebbe prestare molta attenzione a non indurre danno endoteliale nell'IVC durante la dissezione smussa e la legatura. Inoltre, è fondamentale per mantenere l'animale in un'incubat...

Tromboembolismo venoso (TEV), che è composto di trombosi venosa profonda (TVP) ed embolia polmonare, è la terza causa di morte cardiovascolare dopo infarto miocardico e ictus. È una condizione comune che colpisce 1-2% della popolazione, con un'incidenza annuale di 1 su 5001. VTE può portare a: 1) morte attraverso embolia polmonare; 2) post-trombotica sindrome, caratterizzata da dolore cronico alla gamba, il gonfiamento e l'ulcerazione; o 3) ipertensione polmonare cronica conseguente compromesso respiratorio cronico significativo. TEV è una malattia multi-fattoriale e può derivare da stasi del flusso sanguigno, danni alle pareti del vaso, e/o stati hypercoagulable a causa di una rottura dell'equilibrio tra la coagulazione e del sistema fibrinolitico, come è stata descritta più di cento anni fa di Virchow ed è noto come triade di Virchow.
Perché nella maggior parte dei casi è impossibile da ottenere campioni DVT umani, i ricercatori hanno sviluppato modelli sperimentali animali di DVT. Sono stati utilizzati diversi animali incluse ratto2del mouse3, coniglio4, maiale5, cane6e primate non umano7 . I topi possono essere geneticamente modificati e sono l'animale più frequentemente usato per studiare DVT. Tuttavia, come in tutti gli animali, DVT spontanea non è osservato nei topi. Pertanto, alterazioni fisiche o chimiche della parete venosa vengono utilizzate per creare trombosi nei topi. In precedenza abbiamo utilizzato il modello di cloruro ferrico per indurre trombosi nella vena cava inferiore (IVC) di topi8,9,10. Questo modello ha il vantaggio di produrre in modo affidabile gli emboli occlusivi pochi minuti e può essere utilizzato per indagare il ruolo dei farmaci anticoagulanti e antipiastrinici durante la TVP acuta. Tuttavia, è una procedura terminale. Così, per studiare la TVP acuta e cronica, il modello di stasi è più adatto. In questo modello, la formazione dell'embolo è indotta dall'interruzione completa del flusso di sangue nella VCI, uno dei fattori nella triade di Virchow per sviluppo di TVP. Questo modello può essere utilizzato per studiare la formazione di DVT e risoluzione, che è un vantaggio rispetto al FeCl3 modello11.
Abbiamo sviluppato un metodo non invasivo per seguire la formazione dell'embolo e risoluzione nel tempo utilizzando un sistema di micro-Imaging per applicazioni ad alta frequenza ultrasuoni12. Precedentemente abbiamo dimostrato che misura di trombosi venosa dall'ultrasuono correla favorevolmente con gli emboli ottenuti patologico. In due studi successivi abbiamo confermato che le misure ottenute con ultrasuoni in correlazione con l'embolo area quantificato di istochimica9,10e peso dell'embolo. Ancora più importante, abbiamo mostrato che l'ultrasuono ad alta frequenza può essere utilizzato per monitorare la formazione di trombosi venosa profonda in topi12. Può anche essere utilizzato per quantificare la risoluzione dell'embolo in modo non invasivo.
Qui, descriviamo il protocollo che consente la formazione di trombi utilizzando il modello murino di trombosi stasi-indotta e come formazione dell'embolo possa essere monitorata in modo non invasivo nel corso del tempo usando l'ultrasuono ad alta frequenza.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-0 perma-hand silk suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>706G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>20830-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture tying forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>20830-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt forceps (straight and curved)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>20830-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Driver</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15396-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needles</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEVO 770 High Resolution Imaging System</td>
			<td>Visualsonics</td>
			<td>No longer sold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SR Buprenorphine</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td></td>
			<td>Given to LDI by Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systan eye oinment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>288/28062-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x2 sterile Gauze</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>#104148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tip Applicators</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from JGH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transpore hypoallergenic surgical tape</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>#7411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel (Aquasonic-100)</td>
			<td>Dufort &#38; Lavigne</td>
			<td>#AKEN4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From JGH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Dispomed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic chamber,hoses, and adminstration equipment</td>
			<td>Dispomed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair remover</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water heated hard pad</td>
			<td>Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td>#HHP-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gaymar heater water pump TP500</td>
			<td>MATVET Inc.</td>
			<td>#R-500305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infra-red heating lamp</td>
			<td>electrimat inc.</td>
			<td>#1R175R-PAR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse rectal temperature prope</td>
			<td>emkaTECHNOLOGIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From JGH</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deep vein thrombosis induced by stasis in mice monitored by high frequency ultrasonography

La trombosi venosa è una condizione comune che colpisce 1-2% della popolazione, con un'incidenza annuale di 1 su 500. Trombosi venosa profonda può condurre alla morte attraverso l'embolia polmonare o risultati nella sindrome post-trombotica, caratterizzata da dolore cronico alla gamba, il gonfiamento e l'ulcerazione, o nell'ipertensione polmonare cronica conseguente significativo cronica delle vie respiratorie compromesso. Questa è la più comune malattia cardiovascolare dopo infarto miocardico e ictus ischemico ed è una sfida clinica per tutte le discipline mediche, come può complicare il corso di altre malattie come il cancro, la malattia sistematica, chirurgia e trauma principale.
Modelli sperimentali sono necessari per lo studio di questi meccanismi. Il modello di stasi induce embolo coerente dimensione e una quantità quantificabile dell'embolo. Tuttavia, è necessario sistematicamente lega i rami laterali della vena cava inferiore per evitare la variabilità nelle dimensioni dell'embolo e qualsiasi interpretazione di dati errati. Abbiamo sviluppato una tecnica non invasiva per misurare la dimensione dell'embolo usando l'ecografia. Utilizzando questa tecnica, che possiamo valutare lo sviluppo dell'embolo e risoluzione nel tempo dello stesso animale. Questo approccio limita il numero di topi necessaria per la quantificazione di coerenza con il principio di sostituzione, riduzione e perfezionamento degli animali nella ricerca di trombosi venosa. Abbiamo dimostrato che il peso dell'embolo e l'analisi istologica di embolo dimensione correlano con la misura ottenuta con l'ecografia. Pertanto, lo studio corrente descrive come indurre trombosi profonda della vena in topi utilizzando il modello di stasi della vena cava inferiore e come monitorare utilizzando ultrasuoni ad alta frequenza.

Modello di trombosi venosa stasi
Nel modello di stasi, topi sono anestetizzati e un'incisione è fatta per esporre la vena cava inferiore (IVC). L'incisione è fatta sul lato sinistro o destro del mouse invece di una laparotomia mediana in un modo che non avrebbe interferito con la sonda di ultrasuono. I muscoli addominali e la pelle si piega indietro per esporre il IVC (Figura 1). ...

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Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography

Il presente protocollo descrive la procedura per ottenere la trombosi venosa utilizzando un modello di stasi. Inoltre, stiamo utilizzando un metodo non invasivo per misurare la formazione dell'embolo e risoluzione nel tempo.

Trombosi venosa profonda indotta dalla stasi in topi monitorati dall'ecografia ad alta frequenza

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death ...

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