Name: a protein microarray assay for serological determination of antigen-specific antibody responses following clostridium difficile infection
Uploaded: 2018-06-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection at JoVE.com

وأيد هذا البحث "زمالة هيرميس" نجم علا وموناغان تانيا ومن خلال تمويل مستقل من مركز أمراض الجهاز الهضمي في نوتنغهام و NIHR نوتنغهام الجهاز الهضمي الأمراض الطبية مركز البحوث.

1-إعداد لوحة ميكرواري
<ol><li>تمييع المستضدات جيم مع المخزن مؤقت طباعة [برنامج تلفزيوني-توين-تريهالوسي (50 مم)] في تركيز المثلى (التي كانت مسبقاً قبل تشغيل الأمصال المريض): السم (200 ميكروغرام/مل)، والسمية ب (100 ميكروغرام/مل)، بكدتب (200 ميكروغرام/مل)، وتنقية أصلي التخاطب كلها مستمدة من ريبوتيبي...

<ol>
	<li>Negm, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+humoral+immune+responses+to+Clostridium+difficile.-specific+antigens+by+protein+microarray+analysis.">Profiling humoral immune responses to Clostridium difficile.-specific antigens by protein microarray analysis.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 22 (9), 1033-1039 (2015).</li><li>Monaghan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+subclass-specific+binding+and+neutralizing+antibodies+against+Clostridium+difficile.+toxins+in+adult+cystic+fibrosis+sera:+possible+mode+of+immunoprotection+against+symptomatic+C.+difficile+infection.">High prevalence of subclass-specific binding and neutralizing antibodies against Clostridium difficile. toxins in adult cystic fibrosis sera: possible mode of immunoprotection against symptomatic C. difficile infection.</a> Clinical and Experimental Gastroenterology. 10, 169-175 (2017).</li><li>Negm, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+antibodies+against+Clostridium+difficile.+are+present+in+intravenous+immunoglobulin+and+are+retained+in+humans+following+its+administration.">Protective antibodies against Clostridium difficile. are present in intravenous immunoglobulin and are retained in humans following its administration.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 188 (3), 437-443 (2017).</li><li>Monaghan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OC-058+A+protein+microarray+assay+for+predicting+severe+outcomes+in+Clostridium+difficile+infection.">OC-058 A protein microarray assay for predicting severe outcomes in Clostridium difficile infection.</a> Gut. 66, 31 (2017).</li><li>Bacon, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+G+directed+against+toxins+A+and+B+of+Clostridium+difficile+in+the+general+population+and+patients+with+antibiotic-associated+diarrhea.">Immunoglobulin G directed against toxins A and B of Clostridium difficile in the general population and patients with antibiotic-associated diarrhea.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 18 (4), 205-209 (1994).</li><li>Viscidi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+antibody+response+to+toxins+A+and+B+of+Clostridium+difficile.">Serum antibody response to toxins A and B of Clostridium difficile.</a> The Journal of Infectious Diseases. 148 (1), 93-100 (1983).</li><li>Salcedo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulin+therapy+for+severe+Clostridium+difficile+colitis.">Intravenous immunoglobulin therapy for severe Clostridium difficile colitis.</a> Gut. 41 (3), 366-370 (1997).</li><li>Abougergi, M. S., Kwon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulin+for+the+treatment+of+Clostridium+difficile+infection:+a+review.">Intravenous immunoglobulin for the treatment of Clostridium difficile infection: a review.</a> Digestive Diseases and Sciences. 56 (1), 19-26 (2011).</li><li>Shah, N., Shaaban, H., Spira, R., Slim, J., Boghossian, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulin+in+the+treatment+of+severe+Clostridium+difficile+colitis.">Intravenous immunoglobulin in the treatment of severe Clostridium difficile colitis.</a> Journal of Global Infectious Diseases. 6 (2), 82-85 (2014).</li><li>Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymptomatic+carriage+of+Clostridium+difficile+and+serum+levels+of+IgG+antibody+against+toxin+A.">Asymptomatic carriage of Clostridium difficile and serum levels of IgG antibody against toxin A.</a> The New England Journal of Medicine. 342 (6), 390-397 (2000).</li><li>Solomon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+in+patients+with+Clostridium+difficile+infection+correlates+with+host+pro-inflammatory+and+humoral+immune+responses.">Mortality in patients with Clostridium difficile infection correlates with host pro-inflammatory and humoral immune responses.</a> Journal of Medical Microbiology. 62, 1453-1460 (2013).</li><li>Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+antibody+response+to+toxin+A+and+protection+against+recurrent+Clostridium+difficile+diarrhoea.">Association between antibody response to toxin A and protection against recurrent Clostridium difficile diarrhoea.</a> Lancet. 357 (9251), 189-193 (2001).</li><li>Leav, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+anti-toxin+B+antibody+correlates+with+protection+from+recurrent+Clostridium+difficile+infection+(CDI).">Serum anti-toxin B antibody correlates with protection from recurrent Clostridium difficile infection (CDI).</a> Vaccine. 28 (4), 965-969 (2010).</li><li>Drudy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antibody+response+to+surface+layer+proteins+in+Clostridium+difficile+infection.">Human antibody response to surface layer proteins in Clostridium difficile infection.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 41 (3), 237-242 (2004).</li><li>Bauer, M. P., Nibbering, P. H., Poxton, I. R., Kuijper, E. J., van Dissel, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+immune+response+as+predictor+of+recurrence+in+Clostridium+difficile+infection.">Humoral immune response as predictor of recurrence in Clostridium difficile infection.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 (12), 1323-1328 (2014).</li><li>Wilcox, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bezlotoxumab+for+prevention+of+recurrent+Clostridium+difficile+infection.">Bezlotoxumab for prevention of recurrent Clostridium difficile infection.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (4), 305-317 (2017).</li><li>Leuzzi, R., Adamo, R., Scarselli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+against+Clostridium+difficile.">Vaccines against Clostridium difficile.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 10 (6), 1466-1477 (2014).</li><li>Ghose, C., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prospect+for+vaccines+to+prevent+Clostridium+difficile+infection.">The prospect for vaccines to prevent Clostridium difficile infection.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 29 (1), 145-162 (2015).</li><li>Henderson, M., Bragg, A., Fahim, G., Shah, M., Hermes-DeSantis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+safety+and+efficacy+of+vaccines+as+prophylaxis+for+Clostridium+difficile+infections.">A review of the safety and efficacy of vaccines as prophylaxis for Clostridium difficile infections.</a> Vaccines. 5 (3), (2017).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips.">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li><li>Delehanty, J. B., Ligler, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+printing+functional+protein+microarrays.">Method for printing functional protein microarrays.</a> BioTechniques. 34 (2), 380-385 (2003).</li><li>Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+protein+microarrays.">Overview of protein microarrays.</a> Current Protocols in Protein Science. , 21 (2013).</li><li>Huang, Y., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+array-based+approaches+for+biomarker+discovery+in+cancer.">Protein array-based approaches for biomarker discovery in cancer.</a> Genomics, Proteomics &amp; Bioinformatics. 15 (2), 73-81 (2017).</li><li>Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+humoral+immune+response+to+infectious+agents+using+high-density+protein+microarrays.">Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays.</a> Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).</li><li>Bacarese-Hamilton, T., Mezzasoma, L., Ardizzoni, A., Bistoni, F., Crisanti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serodiagnosis+of+infectious+diseases+with+antigen+microarrays.">Serodiagnosis of infectious diseases with antigen microarrays.</a> Journal of Applied Microbiology. 96 (1), 10-17 (2004).</li><li>Davies, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+humoral+immune+response+to+infection+by+using+proteome+microarrays:+high-throughput+vaccine+and+diagnostic+antigen+discovery.">Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (3), 547-552 (2005).</li><li>Wadia, P. P., Sahaf, B., Miklos, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+antigen+microarrays+for+serum/plasma+antibody+detection.">Recombinant antigen microarrays for serum/plasma antibody detection.</a> Methods in Molecular Biology. 723, 81-104 (2011).</li><li>Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+in+high-content+functional+protein+microarrays.">Applications in high-content functional protein microarrays.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 30, 21-27 (2016).</li><li>Crompton, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prospective+analysis+of+the+Ab+response+to+Plasmodium+falciparum+before+and+after+a+malaria+season+by+protein+microarray.">A prospective analysis of the Ab response to Plasmodium falciparum before and after a malaria season by protein microarray.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6958-6963 (2010).</li><li>Khodakov, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oligonucleotide+microarray+for+multiplex+real-time+PCR+identification+of+HIV-1,+HBV,+and+HCV.">An oligonucleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-1, HBV, and HCV.</a> BioTechniques. 44 (2), 241-246 (2008).</li><li>Ryabinin, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+oligonucleotide+microarray+for+sub-typing+of+Influenza+A+virus.">Universal oligonucleotide microarray for sub-typing of Influenza A virus.</a> PLoS One. 6 (4), 17529 (2011).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+acute+respiratory+syndrome+diagnostics+using+a+coronavirus+protein+microarray.">Severe acute respiratory syndrome diagnostics using a coronavirus protein microarray.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4011-4016 (2006).</li><li>Cleton, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spot+the+difference:+development+of+a+syndrome+based+protein+microarray+for+specific+serological+detection+of+multiple+flavivirus+infections+in+travelers.">Spot the difference: development of a syndrome based protein microarray for specific serological detection of multiple flavivirus infections in travelers.</a> PloS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003580 (2015).</li><li>Liu, Y., Yu, F., Huang, H., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+recombinant+antigen+array+for+simultaneous+detection+of+viral+antibodies.">Development of recombinant antigen array for simultaneous detection of viral antibodies.</a> PLoS One. 8 (9), 73842 (2013).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+array+identification+of+protein+markers+for+serodiagnosis+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">Protein array identification of protein markers for serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection.</a> Scientific Reports. 5, 15349 (2015).</li><li>Mannsperger, H. A., Gade, S., Henjes, F., Beissbarth, T., Korf, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPPanalyzer:+analysis+of+reverse-phase+protein+array+data.">RPPanalyzer: analysis of reverse-phase protein array data.</a> Bioinformatics. 26 (17), 2202-2203 (2010).</li><li>Monaghan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+antibody+and+memory+B-cell+responses+to+C.+difficile-associated+diarrhoea,+inflammatory+bowel+disease+and+cystic+fibrosis.">Circulating antibody and memory B-cell responses to C. difficile-associated diarrhoea, inflammatory bowel disease and cystic fibrosis.</a> PLoS One. 8 (9), 74452 (2013).</li><li>Grainger, D. W., Greef, C. H., Gong, P., Lochhead, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+microarray+surface+chemistries.">Current microarray surface chemistries.</a> Methods in Molecular Biology. 381, 37-75 (2007).</li><li>Wellhausen, R., Seitz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facing+current+quantification+challenges+in+protein+microarrays.">Facing current quantification challenges in protein microarrays.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, (2012).</li><li>Guo, A., Zhu, X. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+critical+role+of+surface+chemistry+in+protein+microarrays.">The critical role of surface chemistry in protein microarrays.</a> Functional Protein Microarrays in Drug Discovery. , (2007).</li></ol>

في هذا البروتوكول، وقد أظهرنا ذلك ميكرواري منصة مناسبة لتحديد الاستجابات المناعية خلطيه جيم البروتين المستضدات في الأمصال المريض (الشكلان 3 و 6) والتحضيرات التجارية من IVIg (الشكل 5). وقد أثبتنا أيضا أن تقنية ميكرواري أداء جيدا بالمقارنة مع أليسا التقل?...

ويصف هذا البروتوكول التنمية والمصادقة مقايسة ميكرواري البروتين رواية ومخصصة للكشف عن وشبه الكمي للسلالة البكتيرية واستجابات جسم ايستب محددة إلى المستضدات جيم . نستخدمها بنجاح أعمالنا جيم-مقايسة ميكرواري محددة كأداة جديدة واعدة للتحاليل الطبية التركيبية لمحتوى جسم معين في الأمصال المريض1،2، الأعمال التحضيرية IVIg3، و تحديد خصائص الأجسام المضادة ترتبط بنتائج سيئة في الهيئة4. نظهر كيف يمكن تحليل عينات مصلية بيوبانكيد والتحضيرات التجارية من IVIg على شرائح ميكرواري، والسماح للتنميط استنساخه عالية الجودة للردود الخاصة بمسببات المرض جسم جيم في هذا التحليل.
كثير من الأطفال الأصحاء والبالغين قد أضداد المصل يمكن كشفها IgG و IgA للسموم جيم أ وب5،6. هذه يعتقد أن تنشأ في أعقاب التعرض عابر خلال مرحلة الرضاعة وعقب التعرض جيم في مرحلة البلوغ. لهذا السبب، فقد كان IVIg [بولكلونل] يستخدم خارج التسمية لعلاج المتكررة ومداهم ديمقراطيي7،،من89. ومع ذلك، لها دور حاسم وطريقة العمل لا يزال غير واضح. لقد بينت دراسات عديدة أن استجابة مناعية خلطيه للسموم جيم يلعب دوراً في عرض المرض ونتائجه. على وجه التحديد، تظهر أعراض المرضى بمصل زيادة السمية المضادة "مفتش" تركيز مقارنة بالمرضى الذين يصابون بأعراض مرض10. ذكر ارتباط يمكن إثباته لمتوسط السمية لمكافحة "ألف مفتش" التتر و 30 يوما جميع أسباب وفيات11. كشفت عدة تقارير أيضا عن اقتران مع حماية ضد الردود التكرار والأجسام المضادة للسم أ وب عدة مولدات المضادات غير السمية (Cwp66، Cwp84، FliC، فليد، والبروتينات الطبقة السطحية (SLPs))12،13 , 14 , 15-هذه الملاحظات قد حفزت تطوير أول المناعي السلبي المخدرات تستهدف جيم السم ب (بيزلوتوكسوماب)، الذي أقرته مؤخرا لنا الغذاء والدواء والأدوية الأوروبية الوكالة لمنع التدخلات المتكررة16. استراتيجيات التطعيم باستخدام السموم المعطل أو الشظايا السمية المؤتلف، أيضا قيد التنمية17،،من1819. لا شك في أن تحفز هذه النهج العلاجية الجديدة الحاجة إلى تقييم الاستجابات المناعية خلطيه لمولدات المضادات المتعددة في العينات ذات الأحجام الكبيرة.
واليوم، هناك نقص ملحوظ في المتاحة تجارياً الفائق فحوصات قادرة في نفس الوقت تقييم السلالة البكتيرية واستجابات جسم ايستب محددة إلى المستضدات جيم . وهناك حاجة غير ملباة لتطوير مثل هذه الاختبارات لتيسير جهود البحث في المستقبل والتطبيقات السريرية. [ميكروارس] البروتين هي أسلوب لشل أعدادا كبيرة من البروتينات تنقية منفردة كمجموعة منظمة مكانياً من البقع على سطح المستندة إلى شريحة مجهرية باستخدام نظام روبوتية، التي يمكن أن تكون20 جهة اتصال أو عدم الاتصال طباعة أداة21. وقد تمثل البقع الخلائط المعقدة مثل ليساتيس خلية أو الأجسام المضادة، هوموجيناتيس الأنسجة، والبروتينات الذاتية أو المؤتلف أو الببتيدات، وسوائل الجسم أو المخدرات22،23.
بروتين ميكرواري التكنولوجيا يوفر مزايا متميزة أكثر من أليسا الداخلية القياسية التقنيات التي استخدمت تقليديا لتقييم مكافحة--جيم جسم الردود. وتشمل هذه زيادة قدرة على الكشف عن مجموعة من الأجسام المضادة المتعددة-ايستب-محددة ضد فريق أوسع من أهداف البروتين، وانخفاض حجم الاحتياجات لمولدات المضادات، والعينات، والمواد الكاشفة، وتعزيز قدرة على إدماج أكبر عدد replicates التقنية، بالإضافة إلى مراقبة الجودة الداخلية متعددة (QC) تدابير1. وهي بالتالي أكثر حساسية ودقة واستنساخه [ميكروارس] أكبر مجموعة ديناميكية. وهذه العوامل تجعل [ميكروارس] بديلاً أرخص ويحتمل أن تكون مواتية الساس لكشف البروتينات المعروفة على نطاق واسع. ومع ذلك، يؤدي مساوئ التكنولوجيا ميكرواري أساسا من التكاليف الأولية الكبيرة المرتبطة بإنشاء فريق مستضدات تنقية عالية وإعداد منصة تكنولوجية.
بروتين [ميكروارس] وقد استخدمت على نطاق واسع على مدى العقدين الماضيين كأداة تشخيصية والأساسية لبحث في التطبيقات السريرية. تطبيقات محددة تشمل التعبير البروتين التنميط، ودراسة العلاقات إنزيم الركازة، فحص العلامات البيولوجية، وتحليل التفاعلات بين الميكروبات والمضيف، والتنميط جسم خصوصية23،24، 2526،،،من2728. [ميكروارس البروتين/مستضد العديد من جديد الممرض في] قد أنشئت، بما في ذلك الملاريا (المنجلية)29، وفيروس نقص المناعة البشرية-130،31من الإنفلونزا، مرض الالتهاب الرئوي الحاد (السارس)32، الحمى النزفية الفيروسية33 ، هيربيسفيروسيس34و35من السل.
يتصل هذا البروتوكول بإنشاء سهولة التشغيل جيم. صعب مستضد رد الفعل ميكرواري المقايسة، الذي يمكن القياس الكمي دقيقة ودقيقة ومحددة متعددة-ايستب والردود الخاصة بسلالة جسم إلى جيم صعب مولدات المضادات في الأمصال و IVIg [بولكلونل]. هنا، نحن تشمل الممثل نتائج تتصل أداء الإنزيم ميكرواري مقبولة بالمقارنة مع أليسا، فضلا عن دقة التحليل وإمكانية تكرار نتائج التشكيلات الجانبية. هذا التحليل يمكن زيادة تطويرها للشخصية الأخرى العينات السريرية، ويضع معايير جديدة للبحث في الأساس الجزيئي للهيئة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1827px;" width="1826">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">BioRobotics MicroGrid II arrayer</td>
			<td style="width:296px;">Digilab, Malborough, MA, USA</td>
			<td style="width:296px;">N/A</td>
			<td style="width:836px;">Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scanner InnoScan 710.</td>
			<td>Innopsys</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MAPIX software version 7.2.0</td>
			<td>Innopsys</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Measure signal intensities of the spots.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon contact pin</td>
			<td>Parallel Synthesis Technologies</td>
			<td>SMT-P75</td>
			<td>Print the samples onto the slides.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific Nalgene Desiccator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>41102426</td>
			<td>To store the new and printed slides.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">384-well plate</td>
			<td>Genetix</td>
			<td>X7022UN</td>
			<td>To prepare the antigens.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate cover</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>CLS6570-100EA</td>
			<td>To reduce evaporation of the samples.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aminosilane slides</td>
			<td>Schott,&#160; Germany</td>
			<td>1064875</td>
			<td>The slide of choice for printing the antigens.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide holders</td>
			<td>GraceBio Labs, USA</td>
			<td>204862</td>
			<td>Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells .&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Candida albicans lysate</td>
			<td>NIBSC</td>
			<td>PR-BA117-S</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetanus Toxoid&#160;</td>
			<td>Athens Research and Technology</td>
			<td>04/150</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090707</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090707-1</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090707-2</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090707-3</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090707-4</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090701</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090701-1M</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090701-2M</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090713</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>BA-3080</td>
			<td>Goat anti- human IgG (&#947;-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9052-08&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9060-08&#160;&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9210-08&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgG4 pFc&#39;-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9190-08&#160;&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat - Biotinylated</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>BA-3030</td>
			<td>Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgA1-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9130-08</td>
			<td>Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgA2-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9140-08&#160;&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgM-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9020-08&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 mm syringe filter</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td>Filter the 5% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>A7284</td>
			<td>Use 5% BSA for blocking the slides.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody diluent</td>
			<td>Dako, UK</td>
			<td>S3022</td>
			<td>To dilute the serum and the secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin Cy5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>SA1011</td>
			<td>Detection of the immune reaction.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087)</td>
			<td>Toxins Group, Public Health England</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain)</td>
			<td>Toxins Group, Public Health England</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb</td>
			<td>University of Bath&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td>Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins</td>
			<td>Dublin City University&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vigam (IVIg preparation 1)</td>
			<td>Nottingham University Hospitals NHS Trust</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Privigen (IVIg preparation 2)</td>
			<td>Nottingham University Hospitals NHS Trust</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Intratect (IVIg preparation 3)</td>
			<td>Nottingham University Hospitals NHS Trust</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protein microarray assay for serological determination of antigen-specific antibody responses following clostridium difficile infection

نحن نقدم عرضاً مفصلاً للمقايسة ميكرواري رواية الفائق البروتين للبت في مكافحة مستويات الأجسام المضادةالمطثيّة العسيرة في الأمصال البشرية وفي الأعمال التحضيرية منفصلة [بولكلونل] الغلوبولين المناعي الوريدي (IVIg). البروتوكول يصف الخطوات المنهجية المتبعة في إعداد عينة، وطباعة صفائف وإجراء الفحص، وتحليل البيانات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن زيادة تطوير هذا البروتوكول لتدرج عينات سريرية مختلفة بما في ذلك البلازما والخلايا supernatants ثقافة. علينا إظهار كيف يمكن استخدام ميكرواري البروتين لتحديد مزيج من ايستب (IgG, IgA, IgM)، فئة فرعية (IgG1، IgG2، IgG3، IgG4، IgA1، IgA2)، والأجسام المضادة سلالة محددة للغاية تنقية كله جيم السموم A و B (توكسينوتيبي 0، سلالة VPI 10463، ريبوتيبي 087)، السمية ب من جيم ب السم فقط--وإذ يعرب عن سلالة (ككوج 20309)، ونموذج سلائف جزء ب السم ثنائي، بكدتب، ريبوتيبي-الخاصة بالطبقة السطحية أسرة البروتينات (التخاطب؛ 001، 002، 027)، والتحكم بالبروتينات (التيتانوس توكسيد والمبيضات البيض). وخلال التجربة، يتم سبر [ميكروارس] مع الأمصال من الأفراد مع الأفراد المصابين بالتليف الكيسي (CF) دون الإسهال، ضوابط صحية (المفوض السامي)، جيم العدوى (الهيئة)، ومن قبل الأفراد والعلاج IVIg وظيفة علاج اضطراب نقص المناعة المشترك، مجتمعية وبوليراديكولوباثي دملينتينغ التهاب مزمن. أننا نواجه اختلافات كبيرة في بلغت تحييد السم ومستويات محددة من جسم ايستب متعددة بين مجموعات المرضى، التحضيرات التجارية IVIg، والأمصال قبل ويلي IVIg الإدارة. أيضا، هناك ارتباط كبير بين ميكرواري والمرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (إليزا) لمستويات مفتش الترياق في عينات مصل الدم. هذه النتائج تشير إلى أن ميكرواري يمكن أن تصبح أداة واعدة للتنميط الردود الأجسام المضادة على المستضدات C.difficile في البشر جرى تطعيمهم أو المصابة. مع مزيد من الصقل مستضد الألواح وتخفيض تكاليف الإنتاج، ونحن نتوقع أن التكنولوجيا ميكرواري قد تساعد في تحسين وتحديد إيمونوثيرابيس أكثر سريرياً مفيدة للعدوى جيم بصورة خاصة بالمريض.

يوضح الشكل 1 المخطط انسيابي تصف الخطوات الرئيسية في بروتوكول وصف. ويبين الشكل 2 اختبارات ارتباط سبيرمان مما يدل على اتفاق كبيرة بين ميكرواري واليسا ل IgG و IgA المضادة السم أ وب المستويات في الأمصال اختبار المريض. ويبين الشكل 3...

Watch this Scientific Journal Video about A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection at JoVE.com

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

توضح هذه المقالة طريقة ميكرواري بروتين بسيطة للتنميط خلطيه الاستجابات المناعية للوحة 7-من نوع plex للغاية تنقية المستضدات المطثيّة العسيرة في الأمصال البشرية. ويمكن تمديد البروتوكول لتحديد استجابات جسم معين في الأعمال التحضيرية الغلوبولين المناعي الوريدي [بولكلونل].

مقايسة ميكرواري البروتين "تحديد المصلية" محددة مستضد "الضد الردود التالية" المطثيّة العسيرة الإصابة

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

مستضد محددة في فيفو الفحص باستخدام خلايا القتل المستهدف CFSE إعتبر

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

باستخدام الفحص ميكروأري عموم الفيروسي (Virochip) إلى الشاشة العينات السريرية لمسببات الأمراض الفيروسية

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

القولون والمستقيم سطح الخلية السرطانية باستخدام بروتين التنميط ميكروأري جسم والمتعدد الإسفار

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority ...

Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation

عبر الجسم الحي فرط الحساسية النوع المتأخر الفحص ل Antigen تنظيم محدد

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host ...

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

زراعة وصيانة<em&gt; المطثية العسيرة</em&gt; في بيئة لاهوائية

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

التصوير كله والحيوان وتدفق Cytometric تقنيات CD8 + T الردود خلية التحليل من Antigen محددة بعد الجسيمات النانوية التطعيم

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

المعالجة سيفوبيرازون ماوس نموذج سريريا ذات صلة<em&gt; المطثية العسيرة</em&gt; سلالة R20291

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

كشف وإثراء نادر محددة مستضد الخلايا B لتحليل النمط الظاهري وظيفة

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

بروتوكول لتوصيف التغيرات المورفولوجية<em&gt; كلوستريديوم ديفيسيل</em&gt; في الاستجابة للعلاج بالمضادات الحيوية

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

في فيفو الفحص للكشف عن وظيفة محددة مستضد تي خلية عن استخدام نموذج التطعيم

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...