Name: a protein microarray assay for serological determination of antigen-specific antibody responses following clostridium difficile infection
Uploaded: 2018-06-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מלגת הרמס אל אולה Negm, טניה מונאהן, דרך נפרד במימון המרכז למחלות עיכול נוטינגהאם ומרכז NIHR נוטינגהאם עיכול מחלות ביו מחקר.

1. הכנת צלחת Microarray
<ol><li>לדלל difficile ג אנטיגנים עם מאגר הדפסה [PBS-Tween-טרהלוז (50 מ מ)]-ריכוז אופטימלי (אשר היה מראש לפני הפעלת את החולה sera): טוקסין (200 µg/mL), הרעלן B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/mL), והאינדיאנים מטוהרים כל SLPs נגזר ribotypes 001, 002 ו- 027 (200 µg/mL). הערה: הרעלן B היה המתקבלים רעלן זן B-לבטא CCUG 20309 (90 µg/mL).<ol>
<li>?...

<ol>
	<li>Negm, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+humoral+immune+responses+to+Clostridium+difficile.-specific+antigens+by+protein+microarray+analysis.">Profiling humoral immune responses to Clostridium difficile.-specific antigens by protein microarray analysis.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 22 (9), 1033-1039 (2015).</li><li>Monaghan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+subclass-specific+binding+and+neutralizing+antibodies+against+Clostridium+difficile.+toxins+in+adult+cystic+fibrosis+sera:+possible+mode+of+immunoprotection+against+symptomatic+C.+difficile+infection.">High prevalence of subclass-specific binding and neutralizing antibodies against Clostridium difficile. toxins in adult cystic fibrosis sera: possible mode of immunoprotection against symptomatic C. difficile infection.</a> Clinical and Experimental Gastroenterology. 10, 169-175 (2017).</li><li>Negm, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+antibodies+against+Clostridium+difficile.+are+present+in+intravenous+immunoglobulin+and+are+retained+in+humans+following+its+administration.">Protective antibodies against Clostridium difficile. are present in intravenous immunoglobulin and are retained in humans following its administration.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 188 (3), 437-443 (2017).</li><li>Monaghan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OC-058+A+protein+microarray+assay+for+predicting+severe+outcomes+in+Clostridium+difficile+infection.">OC-058 A protein microarray assay for predicting severe outcomes in Clostridium difficile infection.</a> Gut. 66, 31 (2017).</li><li>Bacon, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+G+directed+against+toxins+A+and+B+of+Clostridium+difficile+in+the+general+population+and+patients+with+antibiotic-associated+diarrhea.">Immunoglobulin G directed against toxins A and B of Clostridium difficile in the general population and patients with antibiotic-associated diarrhea.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 18 (4), 205-209 (1994).</li><li>Viscidi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+antibody+response+to+toxins+A+and+B+of+Clostridium+difficile.">Serum antibody response to toxins A and B of Clostridium difficile.</a> The Journal of Infectious Diseases. 148 (1), 93-100 (1983).</li><li>Salcedo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulin+therapy+for+severe+Clostridium+difficile+colitis.">Intravenous immunoglobulin therapy for severe Clostridium difficile colitis.</a> Gut. 41 (3), 366-370 (1997).</li><li>Abougergi, M. S., Kwon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulin+for+the+treatment+of+Clostridium+difficile+infection:+a+review.">Intravenous immunoglobulin for the treatment of Clostridium difficile infection: a review.</a> Digestive Diseases and Sciences. 56 (1), 19-26 (2011).</li><li>Shah, N., Shaaban, H., Spira, R., Slim, J., Boghossian, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulin+in+the+treatment+of+severe+Clostridium+difficile+colitis.">Intravenous immunoglobulin in the treatment of severe Clostridium difficile colitis.</a> Journal of Global Infectious Diseases. 6 (2), 82-85 (2014).</li><li>Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymptomatic+carriage+of+Clostridium+difficile+and+serum+levels+of+IgG+antibody+against+toxin+A.">Asymptomatic carriage of Clostridium difficile and serum levels of IgG antibody against toxin A.</a> The New England Journal of Medicine. 342 (6), 390-397 (2000).</li><li>Solomon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+in+patients+with+Clostridium+difficile+infection+correlates+with+host+pro-inflammatory+and+humoral+immune+responses.">Mortality in patients with Clostridium difficile infection correlates with host pro-inflammatory and humoral immune responses.</a> Journal of Medical Microbiology. 62, 1453-1460 (2013).</li><li>Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+antibody+response+to+toxin+A+and+protection+against+recurrent+Clostridium+difficile+diarrhoea.">Association between antibody response to toxin A and protection against recurrent Clostridium difficile diarrhoea.</a> Lancet. 357 (9251), 189-193 (2001).</li><li>Leav, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+anti-toxin+B+antibody+correlates+with+protection+from+recurrent+Clostridium+difficile+infection+(CDI).">Serum anti-toxin B antibody correlates with protection from recurrent Clostridium difficile infection (CDI).</a> Vaccine. 28 (4), 965-969 (2010).</li><li>Drudy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antibody+response+to+surface+layer+proteins+in+Clostridium+difficile+infection.">Human antibody response to surface layer proteins in Clostridium difficile infection.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 41 (3), 237-242 (2004).</li><li>Bauer, M. P., Nibbering, P. H., Poxton, I. R., Kuijper, E. J., van Dissel, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+immune+response+as+predictor+of+recurrence+in+Clostridium+difficile+infection.">Humoral immune response as predictor of recurrence in Clostridium difficile infection.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 (12), 1323-1328 (2014).</li><li>Wilcox, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bezlotoxumab+for+prevention+of+recurrent+Clostridium+difficile+infection.">Bezlotoxumab for prevention of recurrent Clostridium difficile infection.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (4), 305-317 (2017).</li><li>Leuzzi, R., Adamo, R., Scarselli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+against+Clostridium+difficile.">Vaccines against Clostridium difficile.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 10 (6), 1466-1477 (2014).</li><li>Ghose, C., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prospect+for+vaccines+to+prevent+Clostridium+difficile+infection.">The prospect for vaccines to prevent Clostridium difficile infection.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 29 (1), 145-162 (2015).</li><li>Henderson, M., Bragg, A., Fahim, G., Shah, M., Hermes-DeSantis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+safety+and+efficacy+of+vaccines+as+prophylaxis+for+Clostridium+difficile+infections.">A review of the safety and efficacy of vaccines as prophylaxis for Clostridium difficile infections.</a> Vaccines. 5 (3), (2017).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips.">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li><li>Delehanty, J. B., Ligler, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+printing+functional+protein+microarrays.">Method for printing functional protein microarrays.</a> BioTechniques. 34 (2), 380-385 (2003).</li><li>Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+protein+microarrays.">Overview of protein microarrays.</a> Current Protocols in Protein Science. , 21 (2013).</li><li>Huang, Y., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+array-based+approaches+for+biomarker+discovery+in+cancer.">Protein array-based approaches for biomarker discovery in cancer.</a> Genomics, Proteomics &amp; Bioinformatics. 15 (2), 73-81 (2017).</li><li>Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+humoral+immune+response+to+infectious+agents+using+high-density+protein+microarrays.">Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays.</a> Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).</li><li>Bacarese-Hamilton, T., Mezzasoma, L., Ardizzoni, A., Bistoni, F., Crisanti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serodiagnosis+of+infectious+diseases+with+antigen+microarrays.">Serodiagnosis of infectious diseases with antigen microarrays.</a> Journal of Applied Microbiology. 96 (1), 10-17 (2004).</li><li>Davies, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+humoral+immune+response+to+infection+by+using+proteome+microarrays:+high-throughput+vaccine+and+diagnostic+antigen+discovery.">Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (3), 547-552 (2005).</li><li>Wadia, P. P., Sahaf, B., Miklos, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+antigen+microarrays+for+serum/plasma+antibody+detection.">Recombinant antigen microarrays for serum/plasma antibody detection.</a> Methods in Molecular Biology. 723, 81-104 (2011).</li><li>Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+in+high-content+functional+protein+microarrays.">Applications in high-content functional protein microarrays.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 30, 21-27 (2016).</li><li>Crompton, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prospective+analysis+of+the+Ab+response+to+Plasmodium+falciparum+before+and+after+a+malaria+season+by+protein+microarray.">A prospective analysis of the Ab response to Plasmodium falciparum before and after a malaria season by protein microarray.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6958-6963 (2010).</li><li>Khodakov, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oligonucleotide+microarray+for+multiplex+real-time+PCR+identification+of+HIV-1,+HBV,+and+HCV.">An oligonucleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-1, HBV, and HCV.</a> BioTechniques. 44 (2), 241-246 (2008).</li><li>Ryabinin, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+oligonucleotide+microarray+for+sub-typing+of+Influenza+A+virus.">Universal oligonucleotide microarray for sub-typing of Influenza A virus.</a> PLoS One. 6 (4), 17529 (2011).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+acute+respiratory+syndrome+diagnostics+using+a+coronavirus+protein+microarray.">Severe acute respiratory syndrome diagnostics using a coronavirus protein microarray.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4011-4016 (2006).</li><li>Cleton, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spot+the+difference:+development+of+a+syndrome+based+protein+microarray+for+specific+serological+detection+of+multiple+flavivirus+infections+in+travelers.">Spot the difference: development of a syndrome based protein microarray for specific serological detection of multiple flavivirus infections in travelers.</a> PloS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003580 (2015).</li><li>Liu, Y., Yu, F., Huang, H., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+recombinant+antigen+array+for+simultaneous+detection+of+viral+antibodies.">Development of recombinant antigen array for simultaneous detection of viral antibodies.</a> PLoS One. 8 (9), 73842 (2013).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+array+identification+of+protein+markers+for+serodiagnosis+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">Protein array identification of protein markers for serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection.</a> Scientific Reports. 5, 15349 (2015).</li><li>Mannsperger, H. A., Gade, S., Henjes, F., Beissbarth, T., Korf, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPPanalyzer:+analysis+of+reverse-phase+protein+array+data.">RPPanalyzer: analysis of reverse-phase protein array data.</a> Bioinformatics. 26 (17), 2202-2203 (2010).</li><li>Monaghan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+antibody+and+memory+B-cell+responses+to+C.+difficile-associated+diarrhoea,+inflammatory+bowel+disease+and+cystic+fibrosis.">Circulating antibody and memory B-cell responses to C. difficile-associated diarrhoea, inflammatory bowel disease and cystic fibrosis.</a> PLoS One. 8 (9), 74452 (2013).</li><li>Grainger, D. W., Greef, C. H., Gong, P., Lochhead, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+microarray+surface+chemistries.">Current microarray surface chemistries.</a> Methods in Molecular Biology. 381, 37-75 (2007).</li><li>Wellhausen, R., Seitz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facing+current+quantification+challenges+in+protein+microarrays.">Facing current quantification challenges in protein microarrays.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, (2012).</li><li>Guo, A., Zhu, X. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+critical+role+of+surface+chemistry+in+protein+microarrays.">The critical role of surface chemistry in protein microarrays.</a> Functional Protein Microarrays in Drug Discovery. , (2007).</li></ol>

ב פרוטוקול זה, אנחנו הראו ש-microarray הזה הוא פלטפורמה מתאימה להגדרת ההורמונאלית תגובות מערכת החיסון כדי difficile ג חלבונים אנטיגניים החולה סרה (דמויות 3 ו- 6), תכשירים מסחריים של IVIg (איור 5). גם הראו כי הטכניקה microarray מבצע טוב בהשוואה לאליסה קונבנציונאלי (<strong cla...

פרוטוקול זה מתאר את התפתחות של אימות של הרומן ומותאמות microarray שיטת איתור של כימות למחצה של זן חיידקי, נוגדן ספציפי isotype התגובות difficile ג אנטיגנים. אנו משתמשים בהצלחה שלנו difficile ג-microarray ספציפי assay ככלי חדש מבטיח bioanalysis ההלחנה תכני נוגדן ספציפי סרה החולה1,2, ההכנות של IVIg3, ו- זיהוי נוגדנים specificities עם עני תוצאות ב- CDI4. נדגים כיצד הדוגמאות סרום biobanked וההכנות מסחרי של IVIg ניתן לנתח microarray שקופיות, ומאפשר פרופיל לשחזור באיכות גבוהה של התגובות נוגדן ספציפי פתוגן difficile ג assay הזה.
ילדים בריאים ומבוגרים רבים יש סרום לזיהוי נוגדנים IgG ואיגה difficile ג רעלים A ו- B5,6. אלה נחשבים להתעורר בעקבות חשיפת חולף במהלך הינקות, בעקבות חשיפה difficile ג בבגרות. מסיבה זו, polyclonal IVIg היה בשימוש מותווים לטיפול חוזרים ונשנים והן לפתח CDI7,8,9. עם זאת, שלו תפקיד מכריע, מצב הפעולה עדיין לא ברור. מספר מחקרים הראו כי התגובה החיסונית ההורמונאלית difficile ג רעלים ממלאת תפקיד המחלה מצגת והתוצאה. באופן ספציפי, בחולים ללא תסמינים הצג של סרום מוגברת אנטי רעלן A אג ריכוז לעומת חולים שמפתחים מחלה סימפטומטי10. אגודה הניתנת דווח על חציון אנטי רעלן A אג titers ו- 30 יום כל סיבה תמותה11. מספר דיווחים גם חשפו אסוציאציה עם הגנה מפני הישנות של נוגדן התגובות טוקסין A, B ומספר אנטיגנים ללא רעלן (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD, וחלבונים שכבת פני השטח (SLPs))12,13 , 14 , 15. תצפיות אלה דרבנה התפתחות הראשון חיסוני פסיבי סמים מיקוד difficile ג הרעלן B (bezlotuxumab), אשר לאחרונה אושרה על-ידי לנו האוכל ואת הניהול סמים התרופות האירופית סוכנות למניעת CDI חוזרים ונשנים16. אסטרטגיות חיסון באמצעות רעלים מומת או שברי רקומביננטי הרעלן נמצאים גם בשלבי פיתוח17,18,19. גישות טיפוליות חדשות אלה ללא ספק יגרה את הדרישה להערכת החיסון ההורמונאלית, התגובות אנטיגנים מרובים במדגמים גדולים.
היום, יש מחסור הבולטים של מבחני תפוקה גבוהה זמינים מסחרית מסוגל בו זמנית הערכת זן חיידקי, נוגדן ספציפי isotype התגובות difficile ג אנטיגנים. יש צורך לפתח מבחני כזה כדי להקל על מאמצי המחקר העתידי ויישומים קליניים. מיקרו-מערכים חלבון הם שיטה לשתק מספרים גדולים של חלבונים מטוהרים בנפרד כמערך במרחב מאורגנת של כתמים על גבי משטח מיקרוסקופי מבוסס שקופיות באמצעות מערכת רובוטית, אשר ניתן ללא מגע או קשר20 הדפסה כלי21. המקומות עשוי לייצג תערובות מורכבים כגון תא lysates, נוגדנים, רקמת homogenates, חלבונים אנדוגני או רקומביננטי או פפטידים, נוזלי גוף או סמים22,23.
טכנולוגיית microarray חלבון מציעה יתרונות ברורים על פני אליסה שבאתר סטנדרטי טכניקות, אשר באופן מסורתי שימש להערכת אנטי -ג difficile תגובות נוגדנים. אלה כוללים קיבולת מוגברת לגילוי מגוון של מולטי-isotype-ספציפי נוגדנים נגד פאנל נרחב יותר של חלבון מטרות, דרישות נפח מופחת אנטיגנים, דגימות של ריאגנטים, ויכולת משופרת כדי לשלב גדול יותר מספר משכפל טכני, בנוסף מספר פנימי בקרת איכות (QC) מודד1. מיקרו-מערכים ולכן הם יותר רגישים, מדויק, לשחזור, יש טווח דינמי גדול יותר. גורמים אלה הופכים מיקרו-מערכים חלופה זולה יותר מאהדה פוטנציאל ELISAs איתור בקנה מידה גדול של חלבונים הידועים. עם זאת, החסרונות של הטכנולוגיה microarray לנבוע בעיקר ההוצאות מראש גדולות הקשורות הקמת פאנל של אנטיגנים נקיים במיוחד והגדרת את הפלטפורמה הטכנולוגית.
מיקרו-מערכים חלבון היו בשימוש נרחב מעל שני עשורים ככלי אבחון ומחקר בסיסי יישומים קליניים. יישומים מסוימים כוללים ביטוי חלבון פרופיל, המחקר של קשרי סובסטרט, סמן ההקרנה, ניתוח של אינטראקציות מארח-חיידק, והגדרת פרופיל נוגדן ירידה לפרטים23,24, 25,26,27,28. הוקמו רבים חדשים הפתוגן חלבון/אנטיגן מיקרו-מערכים, כולל מלריה (הפלזמודיום)29, HIV-130, שפעת31, סארס (הסארס)32, לקדחת דימומית33 , herpesviruses34, ו שחפת35.
בפרוטוקול הנוכחי מתייחס להקמת קל ההפעלה ג difficile תגובתי microarray הנוגדנים, המאפשר כימות מדויק, מדויק, וספציפי של מולטי-isotype, זן ספציפי נוגדן התגובות ג difficile אנטיגנים סרה, polyclonal IVIg. במסמך זה, אנו כוללים נציג תוצאות הנוגעים ביצוע וזמינותו microarray מקובל כאשר לעומת אליסה וכן דיוק וזמינותו של הפארמצבטית פרופילים. זה וזמינותו ניתן לפתח עוד לעשות פרופיל הדגימות קליניים אחרים, קובע סטנדרט חדש למחקר לתוך הבסיס המולקולרי של CDI.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1827px;" width="1826">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">BioRobotics MicroGrid II arrayer</td>
			<td style="width:296px;">Digilab, Malborough, MA, USA</td>
			<td style="width:296px;">N/A</td>
			<td style="width:836px;">Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scanner InnoScan 710.</td>
			<td>Innopsys</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MAPIX software version 7.2.0</td>
			<td>Innopsys</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Measure signal intensities of the spots.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon contact pin</td>
			<td>Parallel Synthesis Technologies</td>
			<td>SMT-P75</td>
			<td>Print the samples onto the slides.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific Nalgene Desiccator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>41102426</td>
			<td>To store the new and printed slides.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">384-well plate</td>
			<td>Genetix</td>
			<td>X7022UN</td>
			<td>To prepare the antigens.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate cover</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>CLS6570-100EA</td>
			<td>To reduce evaporation of the samples.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aminosilane slides</td>
			<td>Schott,&#160; Germany</td>
			<td>1064875</td>
			<td>The slide of choice for printing the antigens.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide holders</td>
			<td>GraceBio Labs, USA</td>
			<td>204862</td>
			<td>Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells .&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Candida albicans lysate</td>
			<td>NIBSC</td>
			<td>PR-BA117-S</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetanus Toxoid&#160;</td>
			<td>Athens Research and Technology</td>
			<td>04/150</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090707</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090707-1</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090707-2</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090707-3</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090707-4</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090701</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090701-1M</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090701-2M</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090713</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>BA-3080</td>
			<td>Goat anti- human IgG (&#947;-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9052-08&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9060-08&#160;&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9210-08&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgG4 pFc&#39;-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9190-08&#160;&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat - Biotinylated</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>BA-3030</td>
			<td>Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgA1-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9130-08</td>
			<td>Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgA2-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9140-08&#160;&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgM-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9020-08&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 mm syringe filter</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td>Filter the 5% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>A7284</td>
			<td>Use 5% BSA for blocking the slides.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody diluent</td>
			<td>Dako, UK</td>
			<td>S3022</td>
			<td>To dilute the serum and the secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin Cy5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>SA1011</td>
			<td>Detection of the immune reaction.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087)</td>
			<td>Toxins Group, Public Health England</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain)</td>
			<td>Toxins Group, Public Health England</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb</td>
			<td>University of Bath&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td>Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins</td>
			<td>Dublin City University&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vigam (IVIg preparation 1)</td>
			<td>Nottingham University Hospitals NHS Trust</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Privigen (IVIg preparation 2)</td>
			<td>Nottingham University Hospitals NHS Trust</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Intratect (IVIg preparation 3)</td>
			<td>Nottingham University Hospitals NHS Trust</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protein microarray assay for serological determination of antigen-specific antibody responses following clostridium difficile infection

אנו מספקים סקירה מפורטת הרומן תפוקה גבוהה microarray שיטת קביעת אנטי - רמות נוגדןClostridium difficile סרה אנושי, ההכנות נפרדים של polyclonal עירוי אימונוגלובולינים (IVIg). הפרוטוקול מתאר את השלבים מתודולוגי המעורבים הכנת הדוגמא, הדפסה של מערכים, וזמינותו הליך ניתוח נתונים. בנוסף, פרוטוקול זה יכול להיות פיתוח נוסף לשלב דגימות קליניים מגוונים, לרבות פלזמה, תא supernatants תרבות. אנחנו מראים איך microarray חלבון יכול לשמש כדי לקבוע שילוב של isotype (IgG, איגה, IgM), מחלקת משנה (IgG1 IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), וטיהרו נוגדנים ספציפיים זן מאוד כל difficile ג רעלים A ו- B (toxinotype 0, זן VPI 10463, ribotype 087), הרעלן B מ ג difficile הרעלן B-בלבד לביטוי זן (CCUG 20309), צורת קודמן קטע B של הרעלן בינארי, pCDTb, ribotype ספציפיים כל משטח שכבת חלבונים (SLPs; 001, 002, 027), ולשלוט חלבונים (טטנוס טוקסואידי, קנדידה אלביקנס). במהלך הניסוי, מיקרו-מערכים הם שנבדק עם סרה מאנשים עם זיהום difficile ג CDI, אנשים עם סיסטיק פיברוזיס (CF) ללא שלשולים, בריא פקדים (HC), וממנו ויחידים טרום טיפול פוסט-IVIg טיפול של CDI, כשל חיסוני משולב הפרעה כרונית דלקתית כרונית polyradiculopathy. אנו נתקלים הבדלים משמעותיים efficacies ניטרול רעלים, רמות נוגדן ספציפי מולטי-isotype בין קבוצות המטופל, תכשירים מסחריים של IVIg, ואת שרה לפני הבאים IVIg המינהל. בנוסף, יש מתאם משמעותי בין microarray מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה) עבור רמות IgG אנטיטוקסין הדוגמאות סרום. תוצאות אלו מציעים ש-microarray הזה יכול להיות כלי מבטיח עבור פרופיל תגובות נוגדנים אנטיגנים C.difficile בבני אדם שחוסנו או נגועים. עם עוד יותר עידון של אנטיגן פאנלים, צמצום עלויות הייצור, אנו צופים כי הטכנולוגיה microarray עשוי לעזור לייעל ובחר את immunotherapies שימושי ביותר קלינית לדלקת difficile ג באופן ספציפי למטופל.

איור 1 מדגימה תרשים זרימה המתאר את השלבים העיקריים הפרוטוקול המתואר. איור 2 מציג את בדיקות מתאם ספירמן הוכחת משמעותי הסכם בין microarray אליסה IgG ו איגה אנטי רעלן A ו- B רמות בסרה מבחן החולה. איור 3 מראה דיפרנציאלית IgG ואיגה נוגדן-clas...

Watch this Scientific Journal Video about A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection at JoVE.com

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

מאמר זה מתאר שיטה microarray חלבון עבור פרופיל החיסונית ההורמונאלית, התגובות פאנל 7-ה-plex של מאוד מטוהרים Clostridium difficile אנטיגנים של sera אנושי. ניתן להאריך את הפרוטוקול מצפני תגובות נוגדנים ספציפיים בהכנות של ורידי polyclonal.

שיטת Microarray לקביעת סרולוגית לזיהום Clostridium difficile נוגדן התגובות הבאות אנטיגן ספציפי

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

אנטיגן ספציפי In vivo להרוג Assay באמצעות תווית CFSE תאים היעד

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

באמצעות assay הפאן ויראלי microarray (Virochip) אל מסך דוגמאות קליניות עבור פתוגנים ויראליים

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

סרטן המעי הגס Cell Surface חלבון פרופיל שימוש microarray ו ריבוב נוגדן פלואורסצנטי

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority ...

Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation

Assay רגישות יתר מושהה סוג חוצה vivo להסדרת אנטיגן ספציפי

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host ...

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Culturing ושמירה<em&gt; Difficile Clostridium</em&gt; בסביבת אנאירובית

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

טכניקות הדמיה כל-החיה והזרימה Cytometric לתגובות ניתוח של אנטיגן ספציפי CD8 + T תא לאחר Nanoparticle חיסון

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Cefoperazone שטופל עכבר דגם של קליני רלוונטי<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; R20291 הזנים

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

איתור והעשרה של נדיר- אנטיגן ספציפי בתאי B עבור ניתוח של הפנוטיפ ותפקוד

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

פרוטוקול לאפיין את השינויים המורפולוגיים של<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; בתגובה לטיפול אנטיביוטי

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

אין ויוו Assay גילוי של הפונקציה Cytolytic תא T אנטיגן ספציפי באמצעות מודל החיסון

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...