Name: a protein microarray assay for serological determination of antigen-specific antibody responses following clostridium difficile infection
Uploaded: 2018-06-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection at JoVE.com

इस अनुसंधान के लिए एक हेमीज़ फैलोशिप द्वारा ओला Negm और तान्या मोनाघन और नॉटिंघम पाचन रोग केंद्र और NIHR नॉटिंघम पाचन रोगों जैव चिकित्सा अनुसंधान केंद्र से अलग धन के माध्यम से समर्थन किया गया था ।

1. एक Microarray प्लेट तैयार करना
<ol><li>एक मुद्रण बफर के साथ C. डिफीसाइल एंटीजन पतला [पंजाब के बीच-trehalose (५० mM)] इष्टतम एकाग्रता पर (जो रोगी सीरा चलाने से पहले पूर्वनिर्धारित था): विष a (२०० µ g/ml) और विष B (१०० µ g/ml), pCDTb (२०० µ g/म?...

<ol>
	<li>Negm, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+humoral+immune+responses+to+Clostridium+difficile.-specific+antigens+by+protein+microarray+analysis.">Profiling humoral immune responses to Clostridium difficile.-specific antigens by protein microarray analysis.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 22 (9), 1033-1039 (2015).</li><li>Monaghan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+subclass-specific+binding+and+neutralizing+antibodies+against+Clostridium+difficile.+toxins+in+adult+cystic+fibrosis+sera:+possible+mode+of+immunoprotection+against+symptomatic+C.+difficile+infection.">High prevalence of subclass-specific binding and neutralizing antibodies against Clostridium difficile. toxins in adult cystic fibrosis sera: possible mode of immunoprotection against symptomatic C. difficile infection.</a> Clinical and Experimental Gastroenterology. 10, 169-175 (2017).</li><li>Negm, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+antibodies+against+Clostridium+difficile.+are+present+in+intravenous+immunoglobulin+and+are+retained+in+humans+following+its+administration.">Protective antibodies against Clostridium difficile. are present in intravenous immunoglobulin and are retained in humans following its administration.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 188 (3), 437-443 (2017).</li><li>Monaghan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OC-058+A+protein+microarray+assay+for+predicting+severe+outcomes+in+Clostridium+difficile+infection.">OC-058 A protein microarray assay for predicting severe outcomes in Clostridium difficile infection.</a> Gut. 66, 31 (2017).</li><li>Bacon, A. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+humoral+immune+response+to+infection+by+using+proteome+microarrays:+high-throughput+vaccine+and+diagnostic+antigen+discovery.">Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (3), 547-552 (2005).</li><li>Wadia, P. P., Sahaf, B., Miklos, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+antigen+microarrays+for+serum/plasma+antibody+detection.">Recombinant antigen microarrays for serum/plasma antibody detection.</a> Methods in Molecular Biology. 723, 81-104 (2011).</li><li>Moore, C. D., Ajala, O. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+oligonucleotide+microarray+for+sub-typing+of+Influenza+A+virus.">Universal oligonucleotide microarray for sub-typing of Influenza A virus.</a> PLoS One. 6 (4), 17529 (2011).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+acute+respiratory+syndrome+diagnostics+using+a+coronavirus+protein+microarray.">Severe acute respiratory syndrome diagnostics using a coronavirus protein microarray.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4011-4016 (2006).</li><li>Cleton, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spot+the+difference:+development+of+a+syndrome+based+protein+microarray+for+specific+serological+detection+of+multiple+flavivirus+infections+in+travelers.">Spot the difference: development of a syndrome based protein microarray for specific serological detection of multiple flavivirus infections in travelers.</a> PloS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003580 (2015).</li><li>Liu, Y., Yu, F., Huang, H., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+recombinant+antigen+array+for+simultaneous+detection+of+viral+antibodies.">Development of recombinant antigen array for simultaneous detection of viral antibodies.</a> PLoS One. 8 (9), 73842 (2013).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+array+identification+of+protein+markers+for+serodiagnosis+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">Protein array identification of protein markers for serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection.</a> Scientific Reports. 5, 15349 (2015).</li><li>Mannsperger, H. A., Gade, S., Henjes, F., Beissbarth, T., Korf, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPPanalyzer:+analysis+of+reverse-phase+protein+array+data.">RPPanalyzer: analysis of reverse-phase protein array data.</a> Bioinformatics. 26 (17), 2202-2203 (2010).</li><li>Monaghan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+antibody+and+memory+B-cell+responses+to+C.+difficile-associated+diarrhoea,+inflammatory+bowel+disease+and+cystic+fibrosis.">Circulating antibody and memory B-cell responses to C. difficile-associated diarrhoea, inflammatory bowel disease and cystic fibrosis.</a> PLoS One. 8 (9), 74452 (2013).</li><li>Grainger, D. W., Greef, C. H., Gong, P., Lochhead, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+microarray+surface+chemistries.">Current microarray surface chemistries.</a> Methods in Molecular Biology. 381, 37-75 (2007).</li><li>Wellhausen, R., Seitz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facing+current+quantification+challenges+in+protein+microarrays.">Facing current quantification challenges in protein microarrays.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, (2012).</li><li>Guo, A., Zhu, X. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+critical+role+of+surface+chemistry+in+protein+microarrays.">The critical role of surface chemistry in protein microarrays.</a> Functional Protein Microarrays in Drug Discovery. , (2007).</li></ol>

इस प्रोटोकॉल में, हमने दिखाया है कि microarray रोगी सीरा में सी. डिफीसाइल प्रोटीन एंटीजन को विनोदी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को परिभाषित करने के लिए एक उपयुक्त मंच है (आंकड़े 3 और 6) और IVIg की वाणि?...

इस प्रोटोकॉल का पता लगाने और अर्द्ध ठहराव बैक्टीरियल तनाव और isotype-विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं के लिए सी डिफीसाइल एंटीजन के लिए एक उपंयास और अनुकूलित प्रोटीन microarray परख के विकास और सत्यापन का वर्णन करता है । हम सफलतापूर्वक रोगी सीरा1,2, IVIg3की तैयारी में विशिष्ट एंटीबॉडी सामग्री के संयोजनीय विश्लेषण के लिए एक होनहार नए उपकरण के रूप में हमारे सी डिफीसाइलविशेष microarray परख का उपयोग करें, और CDI4में गरीब परिणामों के साथ सहसंबंधी एंटीबॉडी विशिष्टताओं की पहचान । हम प्रदर्शन कैसे IVIg के सीरम नमूने और वाणिज्यिक तैयारियों microarray स्लाइड पर विश्लेषण किया जा सकता है, उच्च गुणवत्ता reproducible सी डिफीसाइल रोगज़नक़ के इस परख में विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं की अनुमति ।
कई स्वस्थ बच्चों और वयस्कों सी. डिफीसाइल विषाक्त पदार्थों को एक और बी5,6को detectable सीरम आईजीजी और IgA एंटीबॉडी है । ये बचपन के दौरान क्षणिक जोखिम निंनलिखित उठता है और वयस्कता में सी डिफीसाइल के लिए जोखिम के बाद लगा रहे हैं । इस कारण से, polyclonal IVIg बंद इस्तेमाल किया गया है लेबल दोनों आवर्तक और अचानक CDI7,8,9के इलाज के लिए । हालांकि, अपनी निश्चित भूमिका और कार्रवाई की विधा अस्पष्ट बनी हुई है । कई अध्ययनों से पता चला है कि विनोदी प्रतिरक्षा सी. डिफीसाइल विषाक्त पदार्थों को प्रतिक्रिया रोग प्रस्तुति और परिणाम में एक भूमिका निभाता है । विशेष रूप से, स्पर्शोन्मुख रोगियों एक बढ़ी सीरम विरोधी विष एक आईजीजी एकाग्रता रोगियों जो रोगसूचक रोग10का विकास की तुलना में दिखाते हैं । एक प्रत्यक्ष संघ औसत विरोधी विष एक आईजीजी titers और 30 दिन सभी कारण मृत्यु11के लिए सूचित किया गया है । कई रिपोर्टों को भी एक पुनरावृत्ति और एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं के खिलाफ एक संरक्षण के साथ एक सहयोग से पता चला है विष ए, बी, और कई गैर विष एंटीजन (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD, और सतह परत प्रोटीन (SLPs))12,13 , 14 , 15. इन टिप्पणियों ने प्रथम निष्क्रिय immunotherapy औषध लक्ष्यीकरण सी. डिफीसाइल विष बी (bezlotuxumab) के विकास को प्रेरित है, जिसे हाल ही में अमेरिका के खाद्य एवं औषधि प्रशासन और यूरोपीयन औषधियों द्वारा अनुमोदित किया गया है आवर्तन CDI की रोकथाम के लिए एजेंसी16. निष्क्रिय विषाक्त पदार्थों या रिकॉमबिनेंट विष टुकड़े का उपयोग टीकाकरण रणनीतियों भी वर्तमान में विकास के तहत कर रहे हैं17,18,19. इन नए चिकित्सीय दृष्टिकोण निस्संदेह बड़े नमूना आकार में एकाधिक प्रतिजनों के लिए विनोदी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के मूल्यांकन के लिए आवश्यकता को प्रोत्साहित करेंगे ।
आज, वहां व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उच्च प्रवाह एक साथ बैक्टीरियल तनाव और isotype-विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं का आकलन करने में सक्षम परख की एक उल्लेखनीय कमी सी डिफीसाइल एंटीजन है । वहां एक unmet के लिए ऐसी परख विकसित करने के लिए भविष्य के अनुसंधान के प्रयासों और नैदानिक अनुप्रयोगों की सुविधा की जरूरत है । प्रोटीन microarrays एक विधि एक रोबोटिक प्रणाली का उपयोग करके एक सूक्ष्म स्लाइड पर धब्बे की एक विशेष रूप से संगठित सरणी के रूप में व्यक्तिगत रूप से शुद्ध प्रोटीन की बड़ी संख्या को स्थिर करने के लिए कर रहे हैं, जो या तो एक संपर्क20 या एक गैर संपर्क किया जा सकता है मुद्रण उपकरण21. स्पॉट सेल lysates, एंटीबॉडी, ऊतक homogenates, अंतर्जात या रिकॉमबिनेंट प्रोटीन या पेप्टाइड्स, शरीर के तरल पदार्थ या22,23दवाओं के रूप में जटिल मिश्रण का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं ।
प्रोटीन microarray प्रौद्योगिकी मानक में घर एलिसा तकनीक है, जो परंपरागत रूप से विरोधीसी. डिफीसाइल एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं का आकलन किया गया है पर अलग लाभ प्रदान करता है । ये प्रोटीन लक्ष्य की एक अधिक व्यापक पैनल के खिलाफ बहु isotype-विशिष्ट एंटीबॉडी की एक सीमा का पता लगाने के लिए एक वृद्धि की क्षमता शामिल, प्रतिजनों, नमूनों के लिए कम मात्रा आवश्यकताओं, और रिएजेंट, और एक बढ़ाया करने के लिए एक बड़ा शामिल करने की क्षमता तकनीकी प्रतिकृतियों की संख्या, एकाधिक आंतरिक गुणवत्ता नियंत्रण (QC) उपायों1के अलावा । Microarrays इसलिए अधिक संवेदनशील हैं, सही है, और reproducible और एक अधिक गतिशील रेंज है । इन कारकों microarrays ज्ञात प्रोटीन के बड़े पैमाने पर पता लगाने के लिए एलिसा के लिए एक सस्ता और संभावित अनुकूल विकल्प बनाते हैं । हालांकि, microarray प्रौद्योगिकी के नुकसान मुख्य रूप से बड़ी ऊपर-सामने अत्यधिक शुद्ध एंटीजन के एक पैनल की स्थापना और तकनीकी मंच की स्थापना के साथ जुड़े लागत से परिणाम है ।
प्रोटीन microarrays बड़े पैमाने पर नैदानिक अनुप्रयोगों में एक नैदानिक और बुनियादी अनुसंधान उपकरण के रूप में पिछले दो दशकों में इस्तेमाल किया गया है । विशिष्ट अनुप्रयोगों प्रोटीन अभिव्यक्ति profiling, एंजाइम-सब्सट्रेट संबंधों, के अध्ययन में शामिल है मार्कर स्क्रीनिंग, मेजबान के विश्लेषण-सूक्ष्म जीव बातचीत, और रूपरेखा एंटीबॉडी विशिष्टता23,24, 25,26,27,28. कई नए रोगज़नक़ प्रोटीन/प्रतिजन microarrays स्थापित किया गया है, सहित मलेरिया (प्लाज्मोडियम)29, एचआईवी-130, इंफ्लूएंजा31, गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम (सार्स)३२, वायरल रक्तस्रावी बुखार३३ , herpesviruses३४, और तपेदिक३५।
वर्तमान प्रोटोकॉल एक आसान संचालन सी डिफीसाइल प्रतिक्रियाशील प्रतिजन microarray परख की स्थापना से संबंधित है, जो सटीक, सटीक, और सी के लिए बहु isotype और तनाव विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं के विशिष्ट ठहराव सक्षम बनाता है । डिफीसाइल एंटीजन में सीरा और polyclonal IVIg है । साथ ही, हम प्रतिनिधि एक स्वीकार्य microarray परख प्रदर्शन से संबंधित परिणाम जब एलिसा की तुलना में शामिल है और साथ ही परख परिशुद्धता और reproducibility प्रोफाइल । इस परख आगे प्रोफ़ाइल अंय नैदानिक नमूनों को विकसित किया जा सकता है और CDI के आणविक आधार में अनुसंधान के लिए एक नया मानक सेट ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1827px;" width="1826">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">BioRobotics MicroGrid II arrayer</td>
			<td style="width:296px;">Digilab, Malborough, MA, USA</td>
			<td style="width:296px;">N/A</td>
			<td style="width:836px;">Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scanner InnoScan 710.</td>
			<td>Innopsys</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MAPIX software version 7.2.0</td>
			<td>Innopsys</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Measure signal intensities of the spots.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon contact pin</td>
			<td>Parallel Synthesis Technologies</td>
			<td>SMT-P75</td>
			<td>Print the samples onto the slides.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific Nalgene Desiccator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>41102426</td>
			<td>To store the new and printed slides.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">384-well plate</td>
			<td>Genetix</td>
			<td>X7022UN</td>
			<td>To prepare the antigens.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate cover</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>CLS6570-100EA</td>
			<td>To reduce evaporation of the samples.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aminosilane slides</td>
			<td>Schott,&#160; Germany</td>
			<td>1064875</td>
			<td>The slide of choice for printing the antigens.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide holders</td>
			<td>GraceBio Labs, USA</td>
			<td>204862</td>
			<td>Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells .&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Candida albicans lysate</td>
			<td>NIBSC</td>
			<td>PR-BA117-S</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetanus Toxoid&#160;</td>
			<td>Athens Research and Technology</td>
			<td>04/150</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090707</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090707-1</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090707-2</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090707-3</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090707-4</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090701</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090701-1M</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090701-2M</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090713</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>BA-3080</td>
			<td>Goat anti- human IgG (&#947;-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9052-08&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9060-08&#160;&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9210-08&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgG4 pFc&#39;-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9190-08&#160;&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat - Biotinylated</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>BA-3030</td>
			<td>Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgA1-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9130-08</td>
			<td>Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgA2-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9140-08&#160;&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgM-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9020-08&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 mm syringe filter</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td>Filter the 5% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>A7284</td>
			<td>Use 5% BSA for blocking the slides.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody diluent</td>
			<td>Dako, UK</td>
			<td>S3022</td>
			<td>To dilute the serum and the secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin Cy5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>SA1011</td>
			<td>Detection of the immune reaction.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087)</td>
			<td>Toxins Group, Public Health England</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain)</td>
			<td>Toxins Group, Public Health England</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb</td>
			<td>University of Bath&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td>Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins</td>
			<td>Dublin City University&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vigam (IVIg preparation 1)</td>
			<td>Nottingham University Hospitals NHS Trust</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Privigen (IVIg preparation 2)</td>
			<td>Nottingham University Hospitals NHS Trust</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Intratect (IVIg preparation 3)</td>
			<td>Nottingham University Hospitals NHS Trust</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protein microarray assay for serological determination of antigen-specific antibody responses following clostridium difficile infection

हम एंटी के निर्धारण के लिए एक उपंयास उच्च प्रवाह प्रोटीन microarray परख का एक विस्तृत सिंहावलोकन प्रदान-क्लोस्ट्रीडियम डिफीसाइल एंटीबॉडी स्तर मानव सीरा में और polyclonal नसों में immunoglobulin (IVIg) की अलग तैयारी में । प्रोटोकॉल methodological नमूना तैयारी में शामिल कदम, arrays, परख प्रक्रिया के मुद्रण, और डेटा विश्लेषण का वर्णन करता है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल और प्लाज्मा और सेल संस्कृति supernatants सहित विविध नैदानिक नमूनों को शामिल करने के लिए विकसित किया जा सकता है । हम बताएंगे कि कैसे प्रोटीन microarray isotype का एक संयोजन का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (आईजीजी, IgA, आईजीएम), उपवर्ग (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), और तनाव विशिष्ट एंटीबॉडी को अत्यधिक शुद्ध पूरे ग. डिफीसाइल विषाक्त पदार्थों a और B (toxinotype 0, तनाव VPI १०४६३, ribotype ०८७), विष b से एक C. डिफीसाइल विष-b-केवल व्यक्त तनाव (CCUG २०३०९), बाइनरी विष का एक बी टुकड़ा का प्रणेता रूप, pCDTb, ribotype-विशिष्ट साबुत सतह परत प्रोटीन (SLPs; 001, 002, 027), और नियंत्रण प्रोटीन (टिटनेस टोक्शहॉइड और Candida albicans) । प्रयोग के दौरान, microarrays डिफीसाइल संक्रमण (CDI) के साथ व्यक्तियों से सीरा के साथ जांच कर रहे हैं, दस्त के बिना सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) के साथ व्यक्तियों, स्वस्थ नियंत्रण (कोर्ट), और व्यक्तियों से पूर्व और के बाद IVIg चिकित्सा के लिए CDI के उपचार, संयुक्त इम्यूनो विकार, और जीर्ण भड़काऊ demyelinating polyradiculopathy । हम रोगी समूहों के बीच विष बेअसर efficacies और बहु isotype विशिष्ट एंटीबॉडी स्तर में महत्वपूर्ण मतभेद, IVIg की वाणिज्यिक तैयारी, और सीरा से पहले और निंनलिखित IVIg प्रशासन मुठभेड़ । इसके अलावा, सीरम नमूनों में आंतीटोक्षिण आईजीजी स्तरों के लिए microarray और एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) के बीच एक महत्वपूर्ण संबंध है । इन परिणामों का सुझाव है कि microarray टीका या संक्रमित मनुष्यों में C. डिफीसाइल एंटीजन को एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं की रूपरेखा के लिए एक आशाजनक उपकरण बन सकता है । प्रतिजन पैनलों और उत्पादन लागत में कमी के आगे शोधन के साथ, हम आशा करते है कि microarray प्रौद्योगिकी अनुकूलन में मदद कर सकते है और एक रोगी विशेष तरीके से सी डिफीसाइल संक्रमण के लिए सबसे नैदानिक उपयोगी immunotherapies का चयन करें ।

चित्र 1 वर्णित प्रोटोकॉल में प्रमुख चरणों का वर्णन करने वाला फ़्लोचार्ट दिखाता है । चित्रा 2 स्पीमरन सहसंबंध परीक्षण से पता चलता है microarray और एलिसा के बीच आईजीजी और IgA वि?...

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A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

यह आलेख वर्णन करता है कि मानव सीरा में अत्यधिक शुद्ध क्लोस्ट्रीडियम डिफीसाइल प्रतिजनों के एक 7-plex पैनल के लिए विनोदी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की रूपरेखा के लिए एक सरल प्रोटीन microarray विधि । प्रोटोकॉल polyclonal नसों में immunoglobulin की तैयारी में विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं के निर्धारण के लिए बढ़ाया जा सकता है ।

क्लोस्ट्रीडियम डिफीसाइल संक्रमण के बाद प्रतिजन-विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं के सीरम वैज्ञानिक निर्धारण के लिए एक प्रोटीन Microarray परख

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

This method may help with optimizing and selecting clinically useful immunotherapies for Clostridium difficile infection in a patient-specific manner, and elucidating human immune responses to Clostridium difficile. The main advantage of this technique is that it enables accurate and simultaneous quantification of multi isotype and strain-specific antibody responses to C.difficile antigens. Generally, individuals that are new to this method will struggle because expertise is required in establishing and optimizing a panel of highly purified antigens, and setting up the technological platform.Visual demonstration of this method is critical, as methodological list types involved in preparing the microwave plate, arrays printing, a safe procedure, and the data analysis require attention to the details. Demonstrating some of the procedure will be by Sam Greenwood, a technician from my laboratory. To begin, dilute Clostridium difficile antigens and printing buffer to optimum concentration.Next, transfer 10 microliters of antigen solution to a 384 well plate. Cover the plate with a plate seal, and centrifuge at 300 times gravity for five minutes at room temperature. For microarray printing, use a hand-held gas burner to heat the silicon PIN three times for two seconds each.Then, rinse the silicon PIN in clean water three times for three seconds each. Place the microarray plate in the loading cartridge of an arrayer. Eject the tray, and then place the amino silane slides in the slide tray and press the OK button to turn the vacuum on.Insure that all of the slides are secured, and then click OK.Return the tray to the origin, and close the lid. Next, launch the appropriate program and go to File, then Microarraying Parameters, then Open. Select Clostridium difficile file for printing all antigens in quadruplicate.Under this window, open the Source tab to indicate sample storage, and Target tab to input microarray details. Then, open the Options tab to select the washing tool. Under the General tab of Run Preferences, on the TAS applications suite toolbar, select Wash at start of run, and Wash at end of run.Open the Climate tab, and set the humidity level between 55 to 60%Now start the run, and periodically check the arrayer to insure proper functioning. After printing, carefully place the printed slides in a slide holder with 16 multi-well chambers. Then add 100 microliters of 5%BSAT to each block.Cover the slides and incubate for one hour at room temperature with shaking. Use 120 microliters of PBST to wash each block five times for one minute each with shaking. Next, thaw out the serum samples obtained from C difficile infected patients and healthy controls on ice for 20 minutes.Add commercially available antibody diluent to the master block, and then add samples to the master block and mix. Discard the washing buffer and add 100 microliters of each diluted sample to the experimental blocks. For the negative control block, add 100 microliters of only the antibody diluent.Then, incubate the slides for one hour at room temperature with gentle shaking. Next, use 120 microliters of PBST to wash each block five times for three minutes each with shaking. Then add 100 microliters of biotinylated goat anti-Human antibody diluted in antibody diluent to each block.Cover the slides and incubate for one hour at room temperature with gentle shaking. Use 120 microliters of PBST to wash each block five times for three minutes each with shaking. Next, add 100 microliters of streptavidin SY5 conjugate diluted in 5%BSAT, in a ratio of one to two thousand to each block.Cover the slides with foil and incubate for 15 minutes at room temperature with gentle shaking. Wash the slides first with 120 microliters of PBST five times for one minute each, and then wash them two more times for one minute each with PBS. To dry the slides, spin them for five minutes at 300 times gravity.Turn the laser scanner on 30 minutes prior to scanning, to allow it to warm up. Then place the slide in the scanner with the printed surface facing up until the plate light turns solid green. Next, press the Settings button.On the first tab, insure that the Automatic scrolling and Barcode are unchecked. Then, set the Pixel size to 10, Scan Mode to Medium, Acquisition to 635 only, Acquisition Mode to Manual, gain to 20, and power to low. On the second tab, insure that the slide type is unlabeled.On the third tab, set the Focus setting to Auto focus. Press the import grid button to select the appropriate array list associated with the scanned image. Then, press the autofind button to align the grid to the spots on the slide.Finally, press the Quantification Process button to measure the fluorescence intensity of each spot. Then, save the results in an appropriate format for further analysis. In this protocol, a protein microarray is compared with ELISA to assess the reproducibility between these two techniques.The Spearman correlation coefficient analysis shows significant agreement between the microarray and ELISA for detecting IgG Anti-toxin A, and Anti-toxin B levels in serum samples. Intro assay and inter assay reproducibility of the protein micro array are calculated using the serum samples of seven patients. The samples analyzed on two different array slides against Toxin A, Toxin B, SLP001, SLP002, SLP027, Toxin B from Toxin B only producing strain CCUG, and pCDTb antigens reveal good reproducibility.A protein microarray is performed to detect an isotype-specific antibody response against Clostridium difficile toxins. The serum samples of patients and healthy individuals are used to detect the levels of IgG and IgA against Toxin A, Toxin B, Toxin B from a Clostridium difficile Toxin B only expressing strain, and precursor form of a B fragment of binary toxin. Once mastered, this technique can be done in seven hours.The quality control experiment, different parameters such as selection of appropriate surface chemistry, printing buffers, blocking buffers, and dilutions of serum samples and secondary antibodies should be evaluated before running samples. Printing a high-quality array requires a good understanding of the array or software to adjust the printing of parameters according to the experimental protocol. It is crucial to maintain optimum performance of the arrayer, and a dust-free environment throughout the experiment.This technique will pave the way for researchers in the field of immunology and molecular biology, in terms of characterizing humoral immune responses to infection, and discovering serodiagnostic antigens. Don't forget that working with infected blood samples and bacterial toxins can be hazardous. In general, in laboratory, safety and standard precautions should always be taken into consideration while performing this procedure.

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