Name: a protein microarray assay for serological determination of antigen-specific antibody responses following clostridium difficile infection
Uploaded: 2018-06-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection at JoVE.com

Это исследование было поддержано Гермес стипендий Негм Ola и Таня Монаган и через отдельное финансирование от центра Ноттингема пищеварительной заболеваний и NIHR Ноттингем пищеварительной заболеваний биомедицинских научно-исследовательского центра.

1. Подготовка Microarray пластины
<ol><li>Разбавить C. difficile антигены с буфером печати [PBS-анимации Трегалоза (50 мм)] в оптимальной концентрации, (который был предварительно перед запуском пациента sera): токсин (200 мкг/мл) и токсинном B (100 мкг/мл), pCDTb (200 мкг/мл) и очищенная родной весь SLPs, производн?...

<ol>
	<li>Negm, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+humoral+immune+responses+to+Clostridium+difficile.-specific+antigens+by+protein+microarray+analysis.">Profiling humoral immune responses to Clostridium difficile.-specific antigens by protein microarray analysis.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 22 (9), 1033-1039 (2015).</li><li>Monaghan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+subclass-specific+binding+and+neutralizing+antibodies+against+Clostridium+difficile.+toxins+in+adult+cystic+fibrosis+sera:+possible+mode+of+immunoprotection+against+symptomatic+C.+difficile+infection.">High prevalence of subclass-specific binding and neutralizing antibodies against Clostridium difficile. toxins in adult cystic fibrosis sera: possible mode of immunoprotection against symptomatic C. difficile infection.</a> Clinical and Experimental Gastroenterology. 10, 169-175 (2017).</li><li>Negm, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+antibodies+against+Clostridium+difficile.+are+present+in+intravenous+immunoglobulin+and+are+retained+in+humans+following+its+administration.">Protective antibodies against Clostridium difficile. are present in intravenous immunoglobulin and are retained in humans following its administration.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 188 (3), 437-443 (2017).</li><li>Monaghan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OC-058+A+protein+microarray+assay+for+predicting+severe+outcomes+in+Clostridium+difficile+infection.">OC-058 A protein microarray assay for predicting severe outcomes in Clostridium difficile infection.</a> Gut. 66, 31 (2017).</li><li>Bacon, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+G+directed+against+toxins+A+and+B+of+Clostridium+difficile+in+the+general+population+and+patients+with+antibiotic-associated+diarrhea.">Immunoglobulin G directed against toxins A and B of Clostridium difficile in the general population and patients with antibiotic-associated diarrhea.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 18 (4), 205-209 (1994).</li><li>Viscidi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+antibody+response+to+toxins+A+and+B+of+Clostridium+difficile.">Serum antibody response to toxins A and B of Clostridium difficile.</a> The Journal of Infectious Diseases. 148 (1), 93-100 (1983).</li><li>Salcedo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulin+therapy+for+severe+Clostridium+difficile+colitis.">Intravenous immunoglobulin therapy for severe Clostridium difficile colitis.</a> Gut. 41 (3), 366-370 (1997).</li><li>Abougergi, M. S., Kwon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulin+for+the+treatment+of+Clostridium+difficile+infection:+a+review.">Intravenous immunoglobulin for the treatment of Clostridium difficile infection: a review.</a> Digestive Diseases and Sciences. 56 (1), 19-26 (2011).</li><li>Shah, N., Shaaban, H., Spira, R., Slim, J., Boghossian, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulin+in+the+treatment+of+severe+Clostridium+difficile+colitis.">Intravenous immunoglobulin in the treatment of severe Clostridium difficile colitis.</a> Journal of Global Infectious Diseases. 6 (2), 82-85 (2014).</li><li>Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymptomatic+carriage+of+Clostridium+difficile+and+serum+levels+of+IgG+antibody+against+toxin+A.">Asymptomatic carriage of Clostridium difficile and serum levels of IgG antibody against toxin A.</a> The New England Journal of Medicine. 342 (6), 390-397 (2000).</li><li>Solomon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+in+patients+with+Clostridium+difficile+infection+correlates+with+host+pro-inflammatory+and+humoral+immune+responses.">Mortality in patients with Clostridium difficile infection correlates with host pro-inflammatory and humoral immune responses.</a> Journal of Medical Microbiology. 62, 1453-1460 (2013).</li><li>Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+antibody+response+to+toxin+A+and+protection+against+recurrent+Clostridium+difficile+diarrhoea.">Association between antibody response to toxin A and protection against recurrent Clostridium difficile diarrhoea.</a> Lancet. 357 (9251), 189-193 (2001).</li><li>Leav, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+anti-toxin+B+antibody+correlates+with+protection+from+recurrent+Clostridium+difficile+infection+(CDI).">Serum anti-toxin B antibody correlates with protection from recurrent Clostridium difficile infection (CDI).</a> Vaccine. 28 (4), 965-969 (2010).</li><li>Drudy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antibody+response+to+surface+layer+proteins+in+Clostridium+difficile+infection.">Human antibody response to surface layer proteins in Clostridium difficile infection.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 41 (3), 237-242 (2004).</li><li>Bauer, M. P., Nibbering, P. H., Poxton, I. R., Kuijper, E. J., van Dissel, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+immune+response+as+predictor+of+recurrence+in+Clostridium+difficile+infection.">Humoral immune response as predictor of recurrence in Clostridium difficile infection.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 (12), 1323-1328 (2014).</li><li>Wilcox, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bezlotoxumab+for+prevention+of+recurrent+Clostridium+difficile+infection.">Bezlotoxumab for prevention of recurrent Clostridium difficile infection.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (4), 305-317 (2017).</li><li>Leuzzi, R., Adamo, R., Scarselli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccines+against+Clostridium+difficile.">Vaccines against Clostridium difficile.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 10 (6), 1466-1477 (2014).</li><li>Ghose, C., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prospect+for+vaccines+to+prevent+Clostridium+difficile+infection.">The prospect for vaccines to prevent Clostridium difficile infection.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 29 (1), 145-162 (2015).</li><li>Henderson, M., Bragg, A., Fahim, G., Shah, M., Hermes-DeSantis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+safety+and+efficacy+of+vaccines+as+prophylaxis+for+Clostridium+difficile+infections.">A review of the safety and efficacy of vaccines as prophylaxis for Clostridium difficile infections.</a> Vaccines. 5 (3), (2017).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips.">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li><li>Delehanty, J. B., Ligler, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+printing+functional+protein+microarrays.">Method for printing functional protein microarrays.</a> BioTechniques. 34 (2), 380-385 (2003).</li><li>Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+protein+microarrays.">Overview of protein microarrays.</a> Current Protocols in Protein Science. , 21 (2013).</li><li>Huang, Y., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+array-based+approaches+for+biomarker+discovery+in+cancer.">Protein array-based approaches for biomarker discovery in cancer.</a> Genomics, Proteomics &amp; Bioinformatics. 15 (2), 73-81 (2017).</li><li>Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+humoral+immune+response+to+infectious+agents+using+high-density+protein+microarrays.">Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays.</a> Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).</li><li>Bacarese-Hamilton, T., Mezzasoma, L., Ardizzoni, A., Bistoni, F., Crisanti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serodiagnosis+of+infectious+diseases+with+antigen+microarrays.">Serodiagnosis of infectious diseases with antigen microarrays.</a> Journal of Applied Microbiology. 96 (1), 10-17 (2004).</li><li>Davies, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+the+humoral+immune+response+to+infection+by+using+proteome+microarrays:+high-throughput+vaccine+and+diagnostic+antigen+discovery.">Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (3), 547-552 (2005).</li><li>Wadia, P. P., Sahaf, B., Miklos, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+antigen+microarrays+for+serum/plasma+antibody+detection.">Recombinant antigen microarrays for serum/plasma antibody detection.</a> Methods in Molecular Biology. 723, 81-104 (2011).</li><li>Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+in+high-content+functional+protein+microarrays.">Applications in high-content functional protein microarrays.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 30, 21-27 (2016).</li><li>Crompton, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prospective+analysis+of+the+Ab+response+to+Plasmodium+falciparum+before+and+after+a+malaria+season+by+protein+microarray.">A prospective analysis of the Ab response to Plasmodium falciparum before and after a malaria season by protein microarray.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6958-6963 (2010).</li><li>Khodakov, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oligonucleotide+microarray+for+multiplex+real-time+PCR+identification+of+HIV-1,+HBV,+and+HCV.">An oligonucleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-1, HBV, and HCV.</a> BioTechniques. 44 (2), 241-246 (2008).</li><li>Ryabinin, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+oligonucleotide+microarray+for+sub-typing+of+Influenza+A+virus.">Universal oligonucleotide microarray for sub-typing of Influenza A virus.</a> PLoS One. 6 (4), 17529 (2011).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+acute+respiratory+syndrome+diagnostics+using+a+coronavirus+protein+microarray.">Severe acute respiratory syndrome diagnostics using a coronavirus protein microarray.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4011-4016 (2006).</li><li>Cleton, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spot+the+difference:+development+of+a+syndrome+based+protein+microarray+for+specific+serological+detection+of+multiple+flavivirus+infections+in+travelers.">Spot the difference: development of a syndrome based protein microarray for specific serological detection of multiple flavivirus infections in travelers.</a> PloS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003580 (2015).</li><li>Liu, Y., Yu, F., Huang, H., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+recombinant+antigen+array+for+simultaneous+detection+of+viral+antibodies.">Development of recombinant antigen array for simultaneous detection of viral antibodies.</a> PLoS One. 8 (9), 73842 (2013).</li><li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+array+identification+of+protein+markers+for+serodiagnosis+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">Protein array identification of protein markers for serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection.</a> Scientific Reports. 5, 15349 (2015).</li><li>Mannsperger, H. A., Gade, S., Henjes, F., Beissbarth, T., Korf, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPPanalyzer:+analysis+of+reverse-phase+protein+array+data.">RPPanalyzer: analysis of reverse-phase protein array data.</a> Bioinformatics. 26 (17), 2202-2203 (2010).</li><li>Monaghan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+antibody+and+memory+B-cell+responses+to+C.+difficile-associated+diarrhoea,+inflammatory+bowel+disease+and+cystic+fibrosis.">Circulating antibody and memory B-cell responses to C. difficile-associated diarrhoea, inflammatory bowel disease and cystic fibrosis.</a> PLoS One. 8 (9), 74452 (2013).</li><li>Grainger, D. W., Greef, C. H., Gong, P., Lochhead, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+microarray+surface+chemistries.">Current microarray surface chemistries.</a> Methods in Molecular Biology. 381, 37-75 (2007).</li><li>Wellhausen, R., Seitz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facing+current+quantification+challenges+in+protein+microarrays.">Facing current quantification challenges in protein microarrays.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, (2012).</li><li>Guo, A., Zhu, X. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+critical+role+of+surface+chemistry+in+protein+microarrays.">The critical role of surface chemistry in protein microarrays.</a> Functional Protein Microarrays in Drug Discovery. , (2007).</li></ol>

В этом протоколе мы показали, что microarray является подходящей платформой для определения гуморального иммунного ответа до C. difficile белков антигенов в пациента сыворотки (рисунки 3 и 6) и коммерческие препараты IVIg (рис. 5). Мы также продемонстрировали, ч?...

Этот протокол описывает разработки и проверки assay microarray Роман и индивидуальных белков для обнаружения и полу количественной оценки бактериальный штамм и антителом изотипа конкретных ответов на антигены C. difficile . Мы успешно используем наши C. difficile-assay microarray конкретные как перспективный новый инструмент для композиционных bioanalysis специфическое антитело содержание пациента сыворотки1,2, подготовка IVIg3, и выявление особенностей антитела, которые коррелируют с неблагоприятные исходы в CDI4. Мы демонстрируем, как образцы сыворотки biobanked и коммерческие препараты IVIg могут быть проанализированы на microarray слайды, позволяя высокое качество воспроизводимых профилирование C. difficile возбудителя специфические антитела ответов в этот assay.
Многие здоровые дети и взрослые имеют обнаружить сыворотке антител IgG и IgA C. difficile токсинов A и B5,6. Считается, что они возникают после временной экспозиции во время младенчества и после воздействия C. difficile в зрелом возрасте. По этой причине был поликлональных IVIg используется для лечения как периодических, так и молниеносный CDI7,8,9-лейбл. Однако его окончательного роль и режим действий остается неясным. Несколько исследований показали, что гуморального иммунного ответа на C. difficile токсинов играет роль в болезни презентации и результат. В частности бессимптомных больных показывают увеличение сыворотка анти-токсин IgG концентрации по сравнению с пациентами, которые разрабатывают симптоматической болезни10. Очевидном Ассоциация сообщила средний анти-токсин IgG титры и смертности от всех причин 30-день11. Несколько докладов также показали связь с защитой от повторения и антитела ответы на токсин A, B и несколько не токсин антигены (Cwp66, Cwp84, Флик, FliD и поверхностный слой белки (SLPs))12,13 , 14 , 15. Эти соображения стимулировали развитие первая пассивная иммунотерапия наркотиков таргетинга C. difficile токсин B (bezlotuxumab), который недавно был одобрен в США продуктов питания и медикаментов и европейские лекарства Агентство по предотвращению периодических CDI16. Стратегии вакцинации с использованием рекомбинантного токсин фрагменты или инактивированные токсины, также в настоящее время в развитие17,18,19. Эти новые терапевтические подходы, несомненно, будет стимулировать требование для оценки гуморального иммунного ответа на нескольких антигенов в больших выборок.
Сегодня существует заметное отсутствие коммерчески доступных высок объём анализов способны одновременно оценки бактериальный штамм и антителом изотипа конкретные ответы на антигены C. difficile . Есть неудовлетворенные потребности в разработке таких анализов для облегчения будущих исследований и клинического применения. Microarrays протеина являются метод для иммобилизации большое количество индивидуально очищенные белки как пространственно организованный массив пятен на микроскопические поверхность на основе слайдов с помощью робототехнической системы, которая может быть либо контакта20 или не контакт Печать инструмент21. Пятна могут представлять собой сложные смеси, например lysates клетки, антитела, гомогенатах ткани, эндогенного или рекомбинантных белков пептиды, выделениями или наркотиков22,23.
Технология microarray протеина имеет явные преимущества над стандартной внутренней ELISA методы, которые традиционно использовались для оценки анти -C. difficile антитела ответов. К ним относятся расширение возможностей для обнаружения широкий спектр мульти изотип специфических антител против более обширная группа белковых мишеней, сокращение объема требований для антигенов, проб и реагентов и расширение возможностей для включения большего количество технических реплицирует, помимо нескольких внутреннего контроля качества (QC) меры1. Microarrays поэтому более чувствительным, точные и воспроизводимые и имеют больший динамический диапазон. Эти факторы делают microarrays дешевле и потенциально выгодные альтернативы ELISAs для крупномасштабных обнаружения известных белков. Однако недостатки технологии microarray главным образом результатом большой авансовые расходы, связанные с созданием группы высокоочищенных антигенов и создание технологической платформы.
Microarrays протеина широко использовались в последние два десятилетия как средство диагностики и базовые исследования в клинических приложений. Приложения включают в себя выражения протеина профилирования, исследование ферментов субстрат отношения, скрининг биомаркеров, анализ хост микробных взаимодействий и профилирование антитела специфика23,24, 25,26,27,28. Созданы многие новые microarrays белка/антиген возбудителя, в том числе малярией (Plasmodium)29, ВИЧ-130, гриппа31, тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС)32, вирусные геморрагические лихорадки33 , Герпесвирусы34и35туберкулеза.
Настоящий Протокол относится к созданию легко операционных C. difficile реактивной антигена assay microarray, которая позволяет точной, точной и конкретной количественной оценки multi изотип и штамм специфические антитела ответы на C. несговорчивый антигенов в сыворотки и поликлональными IVIg. Здесь мы включить представителя результаты, относящиеся к приемлемым microarray пробирного производительность по сравнению с ELISA, а также анализа точности и воспроизводимости профили. Этот assay может быть дальнейшее развитие для профилирования других клинических образцов и устанавливает новый стандарт для исследований в молекулярные основы CDI.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1827px;" width="1826">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">BioRobotics MicroGrid II arrayer</td>
			<td style="width:296px;">Digilab, Malborough, MA, USA</td>
			<td style="width:296px;">N/A</td>
			<td style="width:836px;">Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scanner InnoScan 710.</td>
			<td>Innopsys</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MAPIX software version 7.2.0</td>
			<td>Innopsys</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Measure signal intensities of the spots.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon contact pin</td>
			<td>Parallel Synthesis Technologies</td>
			<td>SMT-P75</td>
			<td>Print the samples onto the slides.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific Nalgene Desiccator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>41102426</td>
			<td>To store the new and printed slides.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">384-well plate</td>
			<td>Genetix</td>
			<td>X7022UN</td>
			<td>To prepare the antigens.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate cover</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>CLS6570-100EA</td>
			<td>To reduce evaporation of the samples.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aminosilane slides</td>
			<td>Schott,&#160; Germany</td>
			<td>1064875</td>
			<td>The slide of choice for printing the antigens.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide holders</td>
			<td>GraceBio Labs, USA</td>
			<td>204862</td>
			<td>Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells .&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Candida albicans lysate</td>
			<td>NIBSC</td>
			<td>PR-BA117-S</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetanus Toxoid&#160;</td>
			<td>Athens Research and Technology</td>
			<td>04/150</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090707</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090707-1</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090707-2</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090707-3</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090707-4</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090701</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090701-1M</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090701-2M</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma</td>
			<td>&#160;Athens research and&#160; technology&#160;&#160;</td>
			<td>16-16-090713</td>
			<td>Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>BA-3080</td>
			<td>Goat anti- human IgG (&#947;-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9052-08&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9060-08&#160;&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9210-08&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgG4 pFc&#39;-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9190-08&#160;&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat - Biotinylated</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>BA-3030</td>
			<td>Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgA1-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9130-08</td>
			<td>Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgA2-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9140-08&#160;&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Human IgM-BIOT</td>
			<td>Southern Biotec</td>
			<td>9020-08&#160;</td>
			<td>Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2 mm syringe filter</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>723-2520</td>
			<td>Filter the 5% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>A7284</td>
			<td>Use 5% BSA for blocking the slides.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody diluent</td>
			<td>Dako, UK</td>
			<td>S3022</td>
			<td>To dilute the serum and the secondary antibody.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin Cy5</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>SA1011</td>
			<td>Detection of the immune reaction.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087)</td>
			<td>Toxins Group, Public Health England</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain)</td>
			<td>Toxins Group, Public Health England</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb</td>
			<td>University of Bath&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td>Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins</td>
			<td>Dublin City University&#160;</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vigam (IVIg preparation 1)</td>
			<td>Nottingham University Hospitals NHS Trust</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Privigen (IVIg preparation 2)</td>
			<td>Nottingham University Hospitals NHS Trust</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Intratect (IVIg preparation 3)</td>
			<td>Nottingham University Hospitals NHS Trust</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protein microarray assay for serological determination of antigen-specific antibody responses following clostridium difficile infection

Мы предоставляем подробный обзор assay microarray романный протеин высокой пропускной способностью для определения анти -Clostridium difficile уровни антител в человеческой сыворотки и отдельных препаратов поликлональных внутривенного иммуноглобулина (IVIg). Протокол описывает методологические этапы подготовки проб, печать массивов, процедуры анализа и анализа данных. Кроме того этот протокол может быть дальнейшее развитие для включения различных клинических образцов, включая плазмы и клеточной supernatants культуры. Мы покажем, как microarray протеина может использоваться для определения сочетания изотипа (IgG, IgA, IgM), подкласс (IgG1 IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), и штамм специфических антител к высоко очищенный целый C. difficile токсинов A и B (toxinotype 0, штамм ВПИ 10463, ribotype-087), токсин B от C. difficile токсин B-только выражая штамм (CCUG 20309), предшественник формы фрагмента B бинарный токсин, pCDTb, ribotype специфических всей поверхности слой белков (SLPs; 001, 002, 027) и контролировать белков (столбняка Анатоксин и Candida albicans). В ходе эксперимента, microarrays проверяются с сывороток от физических лиц с C. difficile инфекции (CDI), лица с кистозный фиброз (CF) без диареи, здоровые элементы (HC) и от частных лиц до и пост IVIg терапии для лечение CDI, комбинированного иммунодефицита расстройства и хронических воспалительных демиелинизирующих polyradiculopathy. Мы сталкиваемся с существенные различия между группами пациентов, коммерческие препараты IVIg, и сера до и следующие внутривенное узкоспециализированного нейтрализации токсинов и multi изотип специфическое антитело уровней. Кроме того существует существенная корреляция между microarray и энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) для уровней IgG антитоксин в образцах сыворотки. Эти результаты показывают, что microarray может стать перспективным средством для профилирования антитела ответы на антигены C.difficile прививку или инфицированных людей. С дальнейшего уточнения антигена панелей и снижением издержек производства мы ожидаем, что технология microarray дна может помочь оптимизировать и выберите наиболее клинически полезным immunotherapies C. difficile инфицирования пациента конкретным образом.

Рисунок 1 иллюстрирует блок-схемы, описывающие основные шаги в протоколе описаны. Рисунок 2 показывает тестов корреляции Спирмена, демонстрируя значительное соглашение между microarray и ELISA IgG и IgA анти-токсин A и B уровней в сыворотке пациент...

Watch this Scientific Journal Video about A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection at JoVE.com

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

Эта статья описывает метод простой протеина microarray для профилирования гуморального иммунного ответа группе 7-plex высоко очищенный Clostridium difficile антигенов в человеческой сыворотки. Протокол может быть продлено определение специфического антитела ответов в подготовке поликлональных внутривенного иммуноглобулина.

Microarray Assay протеина для серологических определения антиген специфические антитела ответы следующие Clostridium difficile инфекции

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Антиген Конкретные В Vivo Убийство методом с использованием меченых клеток CFSE Целевая

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Использование Пан-Вирусные Microarray анализ (Virochip), чтобы экран клинических образцов для вирусных патогенов

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

Колоректального рака на поверхности клеток белков профилировки с Microarray антитела и флуоресценции мультиплексирования

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority ...

Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation

Транс-естественных условиях отложенного типа анализа гиперчувствительности к антигену Специальное регулирование

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host ...

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Культивирование и поддержка<em&gt; Clostridium несговорчивый</em&gt; В анаэробной среде

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Всего животного визуализации и проточной цитометрии методы анализа антиген-специфических CD8 + Т-клеточные ответы после вакцинации наночастиц

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Цефоперазон обработанных мышей Модель Клинически значимых<em&gt; Clostridium несговорчивый</em&gt; Штамм R20291

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Обнаружение и обогащение редких антиген-специфических B Клетки для анализа фенотипа и функции

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Протокол для характеристики морфологических изменений<em&gt; Сложный Clostridium</em&gt; В ответ на лечение антибиотиками

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

В естественных условиях Assay для обнаружения антиген специфические Т-лимфоцитов цитолитического функции с помощью вакцинации модели

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...