Name: whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution
Uploaded: 2018-03-29T15:00:00
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우리 실험실 관리 K. 길 감사, 기술 지원, 제이 호킨스와 직원의 국립 보건원 (NIH) 건물 50 동물 마우스 관심과 R. 리드와 지원에 대 한 시설과 관리 지원에 대 한 F. Baldrey. 공유 감사 미 링크를 사와 M. Udey에 또한 그들의 귀 피부 해 부 프로토콜, 편집 도움말 및 줄기 세포 연구실의 구성원에 대 한 명. 화상 및 기술 도움말 및 사려깊은 토론에 대 한 신경-혈관 생물학. 토니 야 마자 키 과학 진흥 (JSP) NIH-KAITOKU에 대 한 일본 사회에 의해 지원 되었다. 이 작품은 국가 심 혼, 폐, 혈액 연구소 (HL005702-11 사원)의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다

이 섹션에서 모든 실험 국가 심 혼, 폐 및 혈액 연구소 (NHLBI) 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인에서 수행 했다.
1. 성인 마우스 귀 피부 컬렉션
<ol><li>닫힌된 챔버에 이산화탄소 (CO2) 노출 성인 쥐를 안락사 고 자 궁 탈으로는 안락사를 확인 합니다. 참고: 실험 안락사 방법에 대 한 국립 보건원 (NIH) 지침을 따릅니다.</li>
	<li>베이스에서 귀 부하 고 35 x 10 m m2 ...

<ol>
	<li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin.">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li><li>Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+confocal+microscopy+for+vascular+branching+morphogenesis.">Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).</li><li>Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunohistochemical+analysis+for+embryonic+limb+skin+vasculature:+a+model+system+to+study+vascular+branching+morphogenesis+in+embryo.">Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Myeloid+Progenitors+Differentiate+into+Pericytes+through+TGF-beta+Signaling+in+Developing+Skin+Vasculature.">Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature.</a> Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).</li><li>Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel-dependent+recruitment+of+sympathetic+axons:+looking+for+innervation+in+all+the+right+places.">Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places.</a> J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve-derived+CXCL12+and+VEGF-A+regulate+the+patterning+of+arterial+vessel+branching+in+developing+limb+skin.">Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin.</a> Dev Cell. 24, 359-371 (2013).</li><li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology.">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> J Vis Exp. , e51749 (2014).</li><li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+Whole+Mount:+A+Novel+Processing+and+Imaging+Protocol+for+Thick,+Three-dimensional+Tissue+Cross-sections+of+Skin.">Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin.</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>Liakath-Ali, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+skin+phenotypes+revealed+by+a+genome-wide+mouse+reverse+genetic+screen.">Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen.</a> Nat Commun. 5, 3540 (2014).</li><li>Gunawan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methyltransferase+Ezh2+controls+cell+adhesion+and+migration+through+direct+methylation+of+the+extranuclear+regulatory+protein+talin.">The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin.</a> Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).</li><li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+skin+disease+for+drug+discovery.">Animal models of skin disease for drug discovery.</a> Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).</li><li>Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atopic+dermatitis.">Animal models of atopic dermatitis.</a> J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).</li><li>Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoriasis:+what+we+have+learned+from+mouse+models.">Psoriasis: what we have learned from mouse models.</a> Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).</li><li>Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+challenges+of+chronic+wounds:+searching+for+an+optimal+animal+model+to+recapitulate+their+complexity.">Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity.</a> Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).</li><li>O'Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+diabetic+neuropathy.">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> ILAR J. 54, 259-272 (2014).</li><li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Mount+Adult+Ear+Skin+Imaging+Reveals+Defective+Neuro-Vascular++Branching+Morphogenesis+in+Obese+and+Type+2+Diabetic+Mouse+Models.">Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models.</a> Sci Rep. 8, (2018).</li></ol>

이 프로토콜 성인 귀 피부 신경-혈관 구조와 면역 세포 분포의 분석에 대 한 전체-마운트 immunonohistochemical 영상을 설명합니다. 우리는이 방법은 장점이 수많은 실험 연구자 분기 morphogenesis 주변 신경 및 혈관의 패턴화와 면역 세포와 머리를 포함 하 여 피부 구성의 3 차원 분포 연구에 대 한 생각 모 공입니다. 화상의 결과 추가 정량 분석에 대 한 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 측정할 수 있습니다...

피부는 3 개의 층으로 이루어져: 표 피, 진 피 및 hypodermis. 그것은 줄기 세포 유지 보수, 차별화, 및 개발으로 재생, tumorigenesis, 및 성인에서 염증 morphogenesis 공부를 모델 시스템으로 사용 되었습니다. 피부 나가도록 풍부한 이며 innervated 주변 신경 및 혈관 시스템의 개발은 잘 조정 되도록 합니다.
우리는 이전 여러 라벨 그대로 주변 신경 및 혈관 그들의 세포질 구성 요소1,2,3, 를 포함 하 여 공부를 함께 전체-마운트 배아 피부 이미징 기술을 증명 하고있다 4: 감각 축 삭, 공감 축 삭, Schwann 신경 세포, 내 피 세포, pericytes, 및 혈관에 혈관 부드러운 근육 세포 (VSMCs). 신생, 동안 기본 모 세관 네트워크 집중적인 혈관 개장 겪 습와 계층적 혈관 분기 네트워크로 개발. 개발 진 피 하거나 hypodermis 동맥 말 초 감각 신경 및 혈관 분기 다음 동맥에 인접 한 양식. 계층적 혈관 네트워크는 철저 하 게 VSMCs 덮여, 후 교감 신경 따라 확장 하 고 큰 직경 혈관1,,56을 자극. 개발 신경 및 혈관 시스템 사이 가까운 협회에 중요성에도 불구 하 고 주요 질문 성인에서 다양 한 병 적인 상황에서 신경-혈관 네트워크에 어떻게 해결 되었습니다. 3-차원 고해상도 영상 해부학 인식할 수 분기 morphogenesis 및 패터 닝 pathogenesis 감사 필요가 있다.
성인 마우스 피부에서 신경 및 혈관 morphogenesis 조직 섹션 얼룩에 의해 일반적으로 분석 된다. 다른 연구 주변 신경 및 혈관, 모 낭, 피지 선 땀 샘, 및 arrector pili 근육7,,89시각화 하 피부 전체 마운트 이미지를 사용 했습니다. 그러나, 성인 피부 두께 전체 깊이에 피부를 분석 하기 어려운 하 게 했다.
현재 연구에서 우리는 이러한 과제를 극복 하기 위해 성인 귀 피부의 새로운 고해상도 전체 마운트 이미징 개발. 귀 피부는 쉽게 액세스할 수 해 부 및 피부 이후 전체 마운트 이미징에 대 한 그것의 전체 깊이 통해. 따라서, 포괄적인 부 량 측정, 피부에 주변 신경 및 혈관 시스템의 3 차원 구조를 비교에 적용 될 수 있는 간단 하 고 매우 재현 방법입니다. 우리는 큰 직경 혈관 주변 감각 및 교감 신경의 맞춤 성인 피부에서 유지 됩니다 설명 했다. 이 프로토콜의 목표는 분기 morphogenesis, 및 주변 신경 및 혈관, 뿐만 아니라 염증 등 다양 한 조건에서 성인 마우스 모델에서 세포 수준에서 면역 세포 분포의 패턴을 시각화 하 고 재생입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>KD Medical</td>
			<td>RGE-3210</td>
			<td>PBS, without Ca2+/Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td>HBSS, with Ca2+/Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>PFA, fixative, diluted in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210064</td>
			<td>Component of blocking/washing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson Immuno research</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>Component of blocking/washing buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved fine tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>RS-5047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tweezers</td>
			<td>Integra Miltex Vantage</td>
			<td>V918-782, V918-784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Unit 0.45 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>157-0045</td>
			<td>For filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Coviden</td>
			<td>8881501400</td>
			<td>For filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter Unit 0.22 mm</td>
			<td>Millex-GV</td>
			<td>SLGVR04NL</td>
			<td>For filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P36934</td>
			<td>Anti-fade mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td>For sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CC 2017</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Graphics editor software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustrator CC 2017</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>Graphics editor software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PECAM-1 (CD31) antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB1398Z</td>
			<td>Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PECAM-1 (CD31) antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553369</td>
			<td>Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-aSMA antibody conjugated with cy-3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6198</td>
			<td>Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-EphB1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-9319</td>
			<td>Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-neuron-specific Class III b-tubulin (Tuj1)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB18207</td>
			<td>Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tuj1 antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MBP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB40390</td>
			<td>Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB152</td>
			<td>Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Peripherin antibody</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB1530</td>
			<td>Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD11b antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA74G</td>
			<td>Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD45 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-0451-85</td>
			<td>Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD3 antibody</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1477T</td>
			<td>Rat IgG1, immune cell marker, 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD45R (B220) antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-0452</td>
			<td>Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11122</td>
			<td>Rabbit polyclonal, 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab13970</td>
			<td>Chicken polyclonal, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-b-gal antibody</td>
			<td>Cappel</td>
			<td>55976</td>
			<td>Rabbit polyclonal, 1:5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab62341</td>
			<td>Rabbit polyclonal, 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11034</td>
			<td>Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647</td>
			<td>Jackson Immuno research</td>
			<td>127-605-160</td>
			<td>Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594</td>
			<td>Jackson Immuno research</td>
			<td>112-585-167</td>
			<td>Rat polyclonal secondary antibody, 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21136</td>
			<td>Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution

여기, 우리는 전체 산 성인 귀 피부 세포 수준에서 면역 세포 분포 뿐 아니라 포괄적인 3 차원 신경-혈관 분기 morphogenesis 패턴화, 공부 하 기술 이미징의 프로토콜 제시. 성인 조직에 주변 신경 및 혈관 해 부 구조 분석 기능 신경-혈관 배선 및 상처 치유 등의 병 적인 상태에 신경-혈관 변성의 이해에 몇 가지 통찰력을 제공합니다. 매우 유익한 모델 시스템으로 우리 해 부에 쉽게 접근할 수 있는 성인 귀 피부에 우리의 연구를 집중 했다. 전체 피부, 말 초 신경 (감각 축 삭, 공감 축 삭, Schwann 세포), 혈관 (내 피 세포와 혈관 평활 근 세포에서에서 세포 구성 성분의 정확한 묘사를 제공 하는 우리의 간단 하 고 재현 가능한 프로토콜 ), 그리고 선 동적인 세포. 우리는이 프로토콜 주변 신경 및 혈관에 있는 형태학 적 이상 뿐만 아니라 다른 병 적인 조건 하에서 성인 귀 피부에 염증을 조사 하는 방법을 포장 됩니다 믿습니다.

성인 마우스 후부 귀 피부 (그림 1A)와 귀 앞쪽 피부 (그림 1B) 했다 αSMA (레드), Tuj1 (녹색), 항 체와 함께 immunostained 및 PECAM-1 (파란색). 후부 피부 immunostained 신경-면역 배포 CD11b (적색) 및 MBP (녹색), Tuj1 (파란색)와 (그림 2A)에 항 체를 사용 하 여 공부를 했다. CD11b의+ 염증 세포, 대 식 세포를 포함 하 ?...

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Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

여기, 분기 morphogenesis 면역 세포 분포 뿐만 아니라 주변 신경 및 혈관의 패턴을 시각화 수 있습니다 전체 성인 마우스 귀 피부에 높은 해상도 전체 마운트 이미징 방법을 설명 합니다.

성인 귀 피부에 대 한 전체 실장 Confocal 현미경 검사 법: 신경-혈관 분기 Morphogenesis 및 면역 세포 분포를 연구 하는 모델 시스템

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

The overall goal of this procedure is to visualize branching morphogenesis and patterning of peripheral nerves and blood vessels, as well as immune cell distribution. This method can help answer key questions in the fields of neurobiology, vascular biology, and immunology by illuminating morphological abnormalities in peripheral nerves and blood vessels, as well as inflammation. The main strength of this technique is that we can visualize the cellular components of peripheral nerves, blood vessels, and immune cells in the skin over its entire depth and can compare three-dimensional architecture on nervous and vascular systems.This method can provide insight into neuro-vasculature structures and immune cell distribution in juvenile to adult mice under normal and pathology conditions. After euthanizing adult mice according to the text protocol, dissect the ear from the base, and place it in a 35-by-10-millimeter Petri dish containing two milliliters of HBSS. Then, use scissors to briefly trim the hairs.Carefully peel the posterior and anterior skin away from the intervening cartilage. Transfer each section of skin separately to a 24-well plate containing one milliliter of ice-cold, fresh 4%PFA in PBS per well. Then, flatten the skin in the PFA.Next, fix the posterior and anterior skin with cartilage at four degrees Celsius for one hour. Then, use one milliliter of PBS to wash the skin three times for five minutes with gentle mixing at room temperature. Transfer the skin with cartilage to the bottom of a 35-by-10-millimeter Petri dish.Use fine curved forceps to peel off the cartilage from the anterior skin. Then, cut off the base region, which is folded and has adipose and connective tissues. Using the same forceps, carefully remove the hairs, adipose tissue, and connective tissue from the inside of the posterior skin.Use PBS to keep the skin wet. To carry out whole-mount immunohistochemical staining, transfer the posterior and anterior skin to a 24-well plate containing one milliliter of 10%heat-inactivated serum blocking buffer per well. Incubate the skin with gentle mixing at room temperature for 30 minutes.Dilute the primary antibodies in the blocking buffer as described in the text protocol, and add 150 microliters of primary antibodies in blocking buffer to the well. Then, transfer the posterior and anterior skin to new wells containing primary antibodies. Incubate the skin with gentle mixing at four degrees Celsius overnight.The following day, after transferring the skin to new wells or aspirating the primary antibodies, add one milliliter of 2%serum in PBS with 0.2%Triton X-100. Wash the samples with gentle mixing at room temperature for 15 minutes. Repeat the wash two more times.In the meantime, prepare secondary antibodies in 10%blocking buffer and filter the antibody solutions through a 0.22-micrometer PVDF membrane syringe filter connected to a one-milliliter syringe. Centrifuge the solution at 13, 000 times gravity for 10 minutes to remove aggregated particles of the secondary antibodies from the blocking buffer, adding 150 microliters of secondary antibodies in blocking buffer to the new well. Transfer the skin to the well containing secondary antibodies.Wrap the 24-well plate in aluminum foil to protect it from light, and incubate the skin with gentle mixing at room temperature for one hour. Add one milliliter of 2%serum washing buffer. Then, transfer the posterior and anterior skin to the wells containing washing buffer.Wrap the plate, and wash the samples with gentle mixing at room temperature for 15 minutes. Repeat the wash two more times. Place the skin on the bottom of a 35-by-10-millimeter Petri dish.Then, under a stereo microscope with low illumination to minimize photo bleaching, use fine curved forceps to carefully remove the hairs, adipose tissue, connective tissue, dust, and fibers from the inside of the skin. Use PBS to keep the skin wet. With forceps, transfer the posterior and anterior skin, with the inside facing up, on an adhesive microscope slide.Use forceps to flatten the skin. Mount the skin in a liquid anti-fade mounting medium to avoid photo-bleaching and preserve fluorescent signals. Make sure that no air bubbles are on or around the skin.Store the stained skin sample slides in the dark overnight at room temperature to allow the mounting medium to get firm. Then, use nail polish to seal the coverslip to the slide, and store it at four degrees Celsius for long-term storage. To carry out confocal microscopy, set up appropriate lasers for fluorophores.A confocal microscope with three laser sources is used in this experiment. Image the samples under a 10X objective, and use the sequential scan tool, which simultaneously excites triple-stained samples, to avoid and reduce any overlap. In this experiment, adult mouse posterior ear skin and anterior ear skin were immunostained with antibodies to alpha-SMA, Tuj1, and PECAM-1.The posterior skin was immunostained to study neuroimmune distribution using antibodies to CD11b and MBP, together with Tuj1. Finally, as shown here, distribution of CD11b-positive inflammatory cells, including macrophages, was detected at a single-cell resolution. While attempting this procedure, it's important to remember to handle your skin with care and to gently and slowly remove the hairs, adipose tissue, and connective tissue from the inside of the ear skin before mounting.This technique will pave the way for researchers to study branching morphogenesis and patterning of peripheral nerves and blood vessels, as well as three-dimensional distribution of skin components, including immune cells in juvenile to adult mouse models. Thanks for watching. Good luck with your experiments.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

애벌레 Zebrafish의 피부에 유도 GAL4 / UAS 식 시스템을 사용하여 선천성 면역과 종양 전 세포 상호 작용의 라이브 영상

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

연구

발생학

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

성인 피부 섬유 아 세포에서 인슐린 분비 세포를 얻을 수있는 안전하고 간단한 방법으로 성적인 변환

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

수평 한 전체적인 거치 : 피부의 두껍고, 3 차원 조직 단면도를위한 비발 한 가공 그리고 화상 진찰 의정서

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

성인 피부 조직에서 기본 인간의 Keratinocytes를 분리 하는 단순 하 고 효율적인 방법

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

연구 조직 이식에 세균성 부착을 병렬 플레이트 관류 시스템의 생체 외에서 모델

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

전체 산 Epifluorescence를 사용 하 여 마우스 Embryogenesis 동안 심장 챔버의 분석

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

전체 얼룩말 배아의 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위한 레이어형 장착 방법

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

혈관 발달에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 iPSC-ECs의 제브라피시 배아 및 튜브 형성 분석에서 시투 혼성화에 대한 전체 마운트

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...