Name: a simple, rapid, and quantitative assay to measure repair of dna-protein crosslinks on plasmids transfected into mammalian cells
Uploaded: 2018-03-05T15:00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health (ES023350). Lisa Chesner wordt ondersteund door opleiding Grant 5T32HL007741. Wij danken Natalia Tretyakova (Universiteit van Minnesota) en Ashis Basu (Universiteit van Connecticut) en hun leden van de lab voor ondersteuning en technisch advies tijdens de vroege en tussenstadia van dit werk.

1. generatie van DPC-bevattende plasmide
<ol><li>80 pmol van oligonucleotide met een 8-oxoguanine-residu (20 µL) combineren met 10 eenheden van T4 polynucleotide kinase (1 µL) in 10 x ligase buffer (5 µL). Voeg water om te bereiken van een totaal volume van 50 µL en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten in een verwarmd waterbad.<ol>
<li>Combineer de gefosforyleerd oligonucleotide (50 µL), 80 pmol van single-stranded DNA (80 μL), 100 eenheden Taq polymerase (20 µL) in 10 x Taq reactie buffer (25 µL), 100 mM ATP (20 µL), 10 mM dNTPs (20 µL), NEB buffer 2 (25 µL) en 8 µg BSA (20 µL) tot in totaal 260 µL. Incubate de monster in een thermocycler ingesteld op 75 ° C gedurende 15 minuten gevolgd door 37 ° C gedurende 5 minuten. Voeg vervolgens toe 60 U van T4 polymerase (20 µL), 8.000 U T4 ligase (20 µL), 100 mM ATP (20 µL), 10 mM dNTPs (20 µL), NEB buffer 2 (15 µL) en 8 µg BSA (20 µL) optellen van 375 µL. Incubeer de reactie 's nachts bij 37 ° C (figuur 1A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Maak een mengsel van 50:50 buffer-verzadigd fenol: chloroform. Toevoegen van gelijke hoeveelheden van elk onderdeel, mix, en spin in een tafelblad centrifuge op 21,130 x g voor 5 min. Chloroform stations water uit de buffer-verzadigd fenol vormen twee lagen: een bovenste, waterige laag en een bodem, organische laag. 375 µL van de lagere, organische laag toevoegen aan de primer extensie reactie, mix, en draaien in een tafelblad centrifuge op 21,130 x g gedurende 5 minuten. Let op: Fenol en chloroform zijn gevaarlijke stoffen en voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om het contact met de ogen of de huid vermijden.<ol>
<li>Na centrifugeren, zorgvuldig halen de toplaag en meng met ammoniumacetaat toegevoegd aan een eindconcentratie van 0,3 M gevolgd door 2 volumes van 100% ethanol. Bewaar de oplossing bij-20 ° C gedurende ten minste 30 min of 's nachts.</li>
		<li>Draai het monster in een centrifuge tafelblad bij 15.000 x rpm bij 4 ° C voor 10 min. verwijderen het supernatant en wassen van de pellet in 1 mL 70% ethanol. Draai het monster in een centrifuge tafelblad bij 15.000 x rpm bij 4 ° C voor 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 100 ÂµL van water.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Combineren van 50 µL van DNA uit de vorige stap met 16 µL 6 x gel-laden kleurstof en 34 µL water en onderworpen aan op een 0,8% laag-smelt agarose de Elektroforese van gel met ethidiumbromide 0,5 µg/mL. De gel op 2 V/cm op gel in werking een 10-cm gedurende 6 uur in 1 x TAE buffer. Accijnzen de supercoiled band met een scheermesje en weeg het gel-segment (figuur 1A). Voer een positieve controle om te dienen als een marker voor waar de covalent gesloten, supercoiled DNA migreert. Let op: Ethidiumbromide is een mutagene stof en voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om het contact met de huid vermijden. Ook is het belangrijk om de tijd die het plasmide monster wordt blootgesteld aan UV teneinde de vorming van UV photoproducts te minimaliseren.<ol>
<li>Het verteren van het gel-segment door 10% de buffer van de reactie van de β-agarase voor elke mg gel gewicht toe te voegen. Incubeer bij 65 ° C gedurende 10 minuten en laat afkoelen tot 42 ° C. Voeg 10 U van β-agarase en Incubeer bij 42 ° C gedurende 1 uur.</li>
		<li>Volgende incubatie, het volume meten ammoniumacetaat toevoegen om een eindconcentratie van 0,3 M en chill op ijs voor 15 min. Centrifuge bij 15.000 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, verzamelen het supernatant en 2 delen isopropanol toevoegen. Chill op-20 ° C's nachts.</li>
		<li>Centrifugeer het gezuiverde, supercoiled DNA gedurende 10 minuten bij 15.000 x rpm in een centrifuge tafelblad bij 4 ° C en resuspendeer de pellet in 40 ÂµL van water.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dwarslijn 12 pmol (15 µL) van DNA tot 36 pmol van oxoguanine glycosylase (1 µL) in buffer met 100 mM NaCl (3 µL), 1 mM MgCl2 (3 µL), 20 mM Tris-HCl pH 7,0 (6 µL), en 10 mM natrium cyanoborohydride (2 µL) tot een eindvolume van 30 µL bij 37 ° C gedurende 30 min26. 1 µL van kruisverwijzende monster verwijderen en Verdun in 500 ÂµL van water om te dienen als een 0 h gegevens wijs en analyseren op PCR in stap 3.</li>
</ol>2. kCl/SDS neerslag
<ol><li>Om te visualiseren crosslinking efficiëntie, verteren beperking 1 µg van de plasmide kruisverwijzende met 1 μL BspDI in 10 x buffer bij 37 ° C gedurende 1 uur voor het genereren van twee verschillende formaat DNA-fragmenten. Opmerking: Één fragment worden kruisverwijzende aan proteïne (4.4 kb) en de andere niet (2,8 kB) (figuur 1B).<ol>
<li>Verdeel de monsters doormidden, SDS toevoegen aan zowel een eindconcentratie van 0,5% en Incubeer bij 65 ° C gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Toevoegen van KCl (eindconcentratie 100 mM) naar een van de monsters en incubeer op ijs gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Centrifugeer beide monsters bij 12.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en het supernatant draaien op een agarose gel te schatten het percentage vervoeging van eiwitten aan DNA12. Opmerking: KCl/SDS neerslag wordt gebruikt voor kwaliteitscontrole, geen substraat voorbereiding.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. de transfectie in zoogdiercellen
<ol><li>1 dag vóór de transfectie, plaat 0,5 x 106 cellen per putje in een 6-well-plate. De volgende dag, meng 1,5 µg (30 µL) van de plasmide DPC-bevattende (uit stap 1.6) met 300 µL van de serum-vrije cultuur media. Meng in een andere buis, 12 µL van transfectiereagens en 300 µL van de serum-vrije cultuur media. Combineer 300 µL van verdunde DNA met 300 µL van verdunde transfectiereagens en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. 250 µL van de complexen toevoegen aan elk van de twee putten en incubeer gedurende een minimum van 1 uur bij 37 ° C.</li>
	<li>Na incubatie, verwijderen van media, voeg 1 mL 0,6% SDS/0.01 M EDTA, Incubeer bij kamertemperatuur voor 10-15 min. schrapen de cellen met behulp van een rubberen politieagent en overbrengen naar een 1,5 mL microfuge buis. Voeg 200 µL van 5 M NaCl (eindconcentratie van 1 M), omkeren zachtjes 5 keer en Incubeer bij 4 ° C's nachts27.</li>
	<li>Centrifugeer de monsters bij 21,130 x g in een centrifuge tafelblad bij 4 ° C gedurende 30 minuten, het supernatant, ethanol neerslag verzamelen zoals hierboven beschreven en resuspendeer in 50 µL van water.</li>
</ol>4. SSPE-qPCR
<ol><li>Meng 1 µL van herstelde DNA van elk tijdstip (inclusief 0 h), 2 x SYBR groene PCR master mix (30 µL), 27 ÂµL van water, en 1 µL (100 pMol) primer ter aanvulling van het deel van de schade van de plasmide (Primer R, Figuur 2). Uitvoeren van PCR met behulp van de volgende voorwaarden: eerste pre smelt gedurende 10 minuten op 90 ° C, gevolgd door 8 cycli van: 90 ° C, 15 s, 65 ° C, 1 min. Bij de voltooiing van de cyclus 8 Voeg 1 µL (100 pMol) van de tweede primer optellen 60 µL (Primer L, Figuur 2)28 (Zie Tabel van materialen voor reagens details).</li>
	<li>Voeg 1 µL van onversterkte worden DNA verhaald op elk tijdstip (inclusief 0 h), 2 x master mix (30 µL), 27 ÂµL van water, en 1 µL van elke primer (100 pMol) 60 µL optellen.</li>
	<li>Een 96-Wells PCR plaat met de monsters van stap 4.1 en 4.2 (20 µL per putje, in drievoud) laden en uitvoeren van qPCR voor 30 cycli met gebruik van de hierboven beschreven voorwaarden.</li>
	<li>Het gemiddelde van de CT-waarden uit elke verzameling van drievoudige monsters. Aftrekken van de CT-waarden gegenereerd in stap 4.1 van die in stap 4.2 te verkrijgen van de delta CT waarde voor elk monster. Aftrekken het tijdstip 0 h van de waarde van de delta CT om elke achtergrond (Zie Vertegenwoordiger resultaten sectie voor een gedetailleerde beschrijving) te verwijderen.</li>
	<li>De delta CT waarde omzetten in percentage reparatie met behulp van de formule: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57413/57413eq1v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tretyakova, N. Y., Groehler, A., Ji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-Protein+Cross-links:+Formation,+Structural+Identities,+and+Biological+Outcomes.">DNA-Protein Cross-links: Formation, Structural Identities, and Biological Outcomes.</a> Accounts of chemical research. 48 (6), 1631-1644 (2015).</li><li>Barker, S., Weinfeld, M., Murray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-protein+crosslinks:+their+induction,+repair,+and+biological+consequences.">DNA-protein crosslinks: their induction, repair, and biological consequences.</a> Mutat Res. 589 (2), 111-135 (2005).</li><li>At Groehler, A. t., Degner, A., Tretyakova, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Tools+to+Characterize+DNA-Protein+Cross-Linking+by+Bis-Electrophiles.">Mass Spectrometry-Based Tools to Characterize DNA-Protein Cross-Linking by Bis-Electrophiles.</a> Basic Clin Pharmacol Toxicol. 121, 63-77 (2016).</li><li>Barker, S., Weinfeld, M., Zheng, J., Li, L., Murray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mammalian+proteins+cross-linked+to+DNA+by+ionizing+radiation.">Identification of mammalian proteins cross-linked to DNA by ionizing radiation.</a> J Biol Chem. 280 (40), 33826-33838 (2005).</li><li>Dizdaroglu, M., Gajewski, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+hydroxyl+radical-induced+formation+of+a+DNA-protein+cross-link+involving+thymine+and+lysine+in+nucleohistone.">Structure and mechanism of hydroxyl radical-induced formation of a DNA-protein cross-link involving thymine and lysine in nucleohistone.</a> Cancer Res. 49 (13), 3463-3467 (1989).</li><li>Chvalova, K., Brabec, V., Kasparkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+the+formation+of+DNA-protein+cross-links+by+antitumor+cisplatin.">Mechanism of the formation of DNA-protein cross-links by antitumor cisplatin.</a> Nucleic Acids Res. 35 (6), 1812-1821 (2007).</li><li>Speit, G., Schutz, P., Merk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+repair+of+formaldehyde-induced+DNA-protein+crosslinks+in+repair-deficient+human+cell+lines.">Induction and repair of formaldehyde-induced DNA-protein crosslinks in repair-deficient human cell lines.</a> Mutagenesis. 15 (1), 85-90 (2000).</li><li>Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+DNA-protein+crosslink+repair.">Mechanisms of DNA-protein crosslink repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).</li><li>Kohn, K. W., Erickson, L. C., Ewig, R. A., Friedman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+DNA+from+mammalian+cells+by+alkaline+elution.">Fractionation of DNA from mammalian cells by alkaline elution.</a> Biochemistry. 19 (15), 4629-4637 (1976).</li><li>Ewig, R. A., Kohn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair+in+mouse+leukemia+L1210+cells+treated+with+nitrogen+mustard,+1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea,+and+other+nitrosoureas.">DNA damage and repair in mouse leukemia L1210 cells treated with nitrogen mustard, 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea, and other nitrosoureas.</a> Cancer Res. 37, 2114-2122 (1977).</li><li>Ewig, R. A., Kohn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-protein+cross-linking+and+DNA+interstrand+cross-linking+by+haloethylnitrosoureas+in+L1210+cells.">DNA-protein cross-linking and DNA interstrand cross-linking by haloethylnitrosoureas in L1210 cells.</a> Cancer Res. 38, 3197-3203 (1978).</li><li>Zhitkovich, A., Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+sensitive+assay+to+detect+DNA-protein+crosslinks+in+intact+cells+and+in+vivo.">A simple, sensitive assay to detect DNA-protein crosslinks in intact cells and in vivo.</a> Carcinogenesis. 13 (8), 1485-1489 (1992).</li><li>Chiu, S. M., Sokany, N. M., Friedman, L. R., Oleinick, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+processing+of+ultraviolet+or+ionizing+radiation-induced+DNA-protein+cross-links+in+Chinese+hamster+cells.">Differential processing of ultraviolet or ionizing radiation-induced DNA-protein cross-links in Chinese hamster cells.</a> Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med. 46 (6), 681-690 (1984).</li><li>Merk, O., Reiser, K., Speit, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chromate-induced+DNA-protein+crosslinks+with+the+comet+assay.">Analysis of chromate-induced DNA-protein crosslinks with the comet assay.</a> Mutat Res. 471 (1-2), 71-80 (2000).</li><li>Loeber, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+DNA-protein+cross-linking+by+antitumor+nitrogen+mustards.">Proteomic analysis of DNA-protein cross-linking by antitumor nitrogen mustards.</a> Chem Res Toxicol. 22 (6), 1151-1162 (2009).</li><li>Gherezghiher, T. B., Ming, X., Villalta, P. W., Campbell, C., Tretyakova, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1,2,3,4-Diepoxybutane-induced+DNA-protein+cross-linking+in+human+fibrosarcoma+(HT1080)+cells.">1,2,3,4-Diepoxybutane-induced DNA-protein cross-linking in human fibrosarcoma (HT1080) cells.</a> J Proteome Res. 12 (5), 2151-2164 (2013).</li><li>Groehler, A. t., Villalta, P. W., Campbell, C., Tretyakova, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+DNA-Protein+Cross-Linking+by+Phosphoramide+Mustard+and+Nornitrogen+Mustard+in+Human+Cells.">Covalent DNA-Protein Cross-Linking by Phosphoramide Mustard and Nornitrogen Mustard in Human Cells.</a> Chem Res Toxicol. 29 (2), 190-202 (2016).</li><li>Kiianitsa, K., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+assay+for+DNA-protein+covalent+complexes+in+living+cells.">A rapid and sensitive assay for DNA-protein covalent complexes in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 41 (9), e104 (2013).</li><li>Kiianitsa, K., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+isolation,+identification+and+quantification+of+DNA-protein+adducts+by+ELISA-based+RADAR+assay.">Ultrasensitive isolation, identification and quantification of DNA-protein adducts by ELISA-based RADAR assay.</a> Nucleic Acids Research. 42 (13), e108 (2014).</li><li>Stingele, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+Regulation+of+DNA-Protein+Crosslink+Repair+by+the+DNA-Dependent+Metalloprotease+SPRTN.">Mechanism and Regulation of DNA-Protein Crosslink Repair by the DNA-Dependent Metalloprotease SPRTN.</a> Molecular Cell. 64 (4), 688-703 (2016).</li><li>Vaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloprotease+SPRTN/DVC1+Orchestrates+Replication-Coupled+DNA-Protein+Crosslink+Repair.">Metalloprotease SPRTN/DVC1 Orchestrates Replication-Coupled DNA-Protein Crosslink Repair.</a> Mol Cell. 64, 704-719 (2016).</li><li>Maskey, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spartan+deficiency+causes+accumulation+of+Topoisomerase+1+cleavage+complexes+and+tumorigenesis.">Spartan deficiency causes accumulation of Topoisomerase 1 cleavage complexes and tumorigenesis.</a> Nucleic Acids Res. 45 (8), 4564-4576 (2017).</li><li>Lessel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+SPRTN+cause+early+onset+hepatocellular+carcinoma,+genomic+instability+and+progeroid+features.">Mutations in SPRTN cause early onset hepatocellular carcinoma, genomic instability and progeroid features.</a> Nature Genetics. 46 (11), 1239-1244 (2014).</li><li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+excision+repair+eliminates+unique+DNA-protein+cross-links+from+mammalian+cells.">Nucleotide excision repair eliminates unique DNA-protein cross-links from mammalian cells.</a> J Biol Chem. 282 (31), 22592-22604 (2007).</li><li>Ahn, B., Kang, D., Kim, H., Wei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+mitomycin+C+cross-linked+DNA+in+mammalian+cells+measured+by+a+host+cell+reactivation+assay.">Repair of mitomycin C cross-linked DNA in mammalian cells measured by a host cell reactivation assay.</a> Mol Cells. 18 (2), 249-255 (2004).</li><li>Fromme, J. C., Bruner, S. D., Yang, W., Karplus, M., Verdine, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product-assisted+catalysis+in+base-excision+DNA+repair.">Product-assisted catalysis in base-excision DNA repair.</a> Nat Struct Biol. 10 (3), 204-211 (2003).</li><li>Hirt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+extraction+of+polyoma+DNA+from+infected+mouse+cell+cultures.">Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures.</a> J Mol Biol. 26 (2), 365-369 (1967).</li><li>Lee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+repair+of+DNA+damage+in+cell+lines+and+human+peripheral+blood+mononuclear+cells.">Monitoring repair of DNA damage in cell lines and human peripheral blood mononuclear cells.</a> Anal Biochem. 365 (2), 246-259 (2007).</li><li>Sikorsky, J. A., Primerano, D. A., Fenger, T. W., Denvir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+reduces+Taq+DNA+polymerase+fidelity+and+PCR+amplification+efficiency.">DNA damage reduces Taq DNA polymerase fidelity and PCR amplification efficiency.</a> Biochemical and biophysical research communications. 355 (2), 431-437 (2007).</li><li>Wickramaratne, S., Mukherjee, S., Villalta, P. W., Scharer, O. D., Tretyakova, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+sequence-specific+DNA-protein+conjugates+via+a+reductive+amination+strategy.">Synthesis of sequence-specific DNA-protein conjugates via a reductive amination strategy.</a> Bioconjug Chem. 24 (9), 1496-1506 (2013).</li><li>George, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+nucleotide+excision+repair+in+a+helicase-deficient+XPD+mutant+from+intragenic+suppression+by+a+trichothiodystrophy+mutation.">Restoration of nucleotide excision repair in a helicase-deficient XPD mutant from intragenic suppression by a trichothiodystrophy mutation.</a> Mol Cell Biol. 21 (21), 7355-7365 (2001).</li><li>Minko, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Repair+of+DNA-Polypeptide+Cross-Links+by+the+UvrABC+Nuclease.">Initiation of Repair of DNA-Polypeptide Cross-Links by the UvrABC Nuclease.</a> Biochemistry. 44 (8), 3000-3009 (2005).</li><li>Minko, I. G., Zou, Y., Lloyd, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incision+of+DNA-protein+crosslinks+by+UvrABC+nuclease+suggests+a+potential+repair+pathway+involving+nucleotide+excision+repair.">Incision of DNA-protein crosslinks by UvrABC nuclease suggests a potential repair pathway involving nucleotide excision repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, (2002).</li><li>Reardon, J. T., Sancar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+DNA-polypeptide+crosslinks+by+human+excision+nuclease.">Repair of DNA-polypeptide crosslinks by human excision nuclease.</a> PNAS. 103, 4056-4061 (2006).</li><li>Lopez-Mosqueda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPRTN+is+a+mammalian+DNA-binding+metalloprotease+that+resolves+DNA-protein+crosslinks.">SPRTN is a mammalian DNA-binding metalloprotease that resolves DNA-protein crosslinks.</a> eLife. 5, e21491 (2016).</li><li>Stingele, J., Schwarz, M. S., Bloemeke, N., Wolf, P. G., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-dependent+protease+involved+in+DNA-protein+crosslink+repair.">A DNA-dependent protease involved in DNA-protein crosslink repair.</a> Cell. 158 (2), 327-338 (2014).</li><li>Duxin, J. P., Dewar, J. M., Yardimci, H., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+a+DNA-Protein+Crosslink+by+Replication-Coupled+Proteolysis.">Repair of a DNA-Protein Crosslink by Replication-Coupled Proteolysis.</a> Cell. 159 (2), 346-357 (2014).</li><li>Stingele, J., Habermann, B., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-protein+crosslink+repair:+proteases+as+DNA+repair+enzymes.">DNA-protein crosslink repair: proteases as DNA repair enzymes.</a> Trends in Biochemical Sciences. 40 (2), 67-71 (2015).</li><li>Potter, H., Heller, R., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+by+Electroporation.">Transfection by Electroporation.</a> Current protocols in molecular biology. , (2003).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De SSPE-qPCR-methode biedt talrijke voordelen ten opzichte van andere benaderingen door het onderzoek van de reparatie van een homogene populatie met een enkele, gedefinieerde DPC laesie. Het is opmerkelijk dat naast de controle van de identiteit van de eiwitten en het soort chemische dwarslijn gebruikt voor het aansluiten van het eiwit tot het DNA, het mogelijk is te eenvoudig manipuleren de context van de volgorde waarin de DPC laesie wordt ingevoerd. We hebben onderzocht de invloed op DPC reparatie van invoering van de laesie op ofwel de sjabloon of onderdeel van een plasmide stroomafwaarts van een actieve promotor locus codering. Evenzo zijn wij bezig het onderzoek naar de invloed op DPC reparatie van replicatie met behulp van een M13 plasmide met een SV40 oorsprong van replicatie in HEK293T cellen transfected. De bepaling die hierin worden beschreven direct maatregelen DPC reparatie, in tegenstelling tot andere strategieën zoals host cel reactivering dat niet indirect schattingen reparatie activiteit24,25. Daarnaast is het systeem is robuust, gevoelig en kwantitatieve. In tegenstelling tot andere systemen, die meten DPC verwijdering, deze test detecteert alleen volledige reparatie gebeurtenissen, dat wil zeggen, het vereist niet alleen dat de DPC laesie worden verwijderd, maar dat de integriteit van de duplex DNA worden volledig hersteld17. Dit komt doordat de abasic sites en krasjes of onderbrekingen in de phosphodiester-backbone de bepaling zo effectief als de oorspronkelijke DPC laesie29 blokkeren.
Hoewel dit verslag richt zich op een bepaald soort DPC, dat werd opgericht door natriumboorhydride overlapping van een enzym reactie tussenliggende, wij ontwikkelen momenteel benaderingen om te bestuderen van de reparatie van DPCs waarbij andere eiwitten en letsels waarbij de eiwit-koppeling aan het DNA vindt plaats via de nucleoside-base, in plaats van de positie van ribose. Met behulp van reductieve aminatie, hebben we eiwit en peptide crosslinks gekoppeld aan de guanine of cytosine base van een DNA primer30. Deze oligonucleotides werden gezuiverd tot homogeniteit en gebruikt voor het genereren van supercoiled plasmiden met DNA-eiwitten en DNA-peptide crosslinks. Terwijl de efficiëntie van deze reacties wordt enigszins verminderd ten opzichte van dat van de oxoguanine glycosylase dwarslijn aanpak in detail hierboven beschreven, ze waren toch succesvol en toestaan dat het onderzoek van de reparatie van deze substraten in wild-type en nucleotide excisie reparatie-deficiënte zoogdieren cellijnen. Ook hebben we de SSPE-qPCR-bepaling gebruikt om te studeren van de reparatie van oxoguanine laesies en een synthetische ribose-cholesterol-conjugaat, die eerder werd getoond worden gerepareerd via de cellulaire nucleotide excisie reparatie machines31. Zoals Figuur 2 grafisch verbeeldt, reparatie van een laesie dat blokken primer uitbreiding door de polymerase Taq kan, in principe, worden gemeten met behulp van de bepaling van de SSPE-qPCR.
Huidige modellen van DPC reparatie suggereren dat grotere DPCs (> 10 kDa) zijn onderworpen aan Proteolytische verwerking tot kleinere peptide laesie voorafgaand aan verwijdering32,33,34. Meest waarschijnlijke kandidaten die verantwoordelijk is voor deze proteolyse zijn het proteasoom of een specifieke protease in menselijke cellen, genaamd Spartan20,21,35,,36,,37, 38. verdere onderzoek naar de rol van deze proteasen kunnen worden uitgevoerd met gebruikmaking van de SSPE-qPCR bepaling. Proteasoom-remmers kunnen worden gebruikt om de cellen vóór transfectie met DPC-bevattende substraten voorbehandeling. Anderzijds kon Spartaanse vechtpartij cellijnen zijn transfected met beschadigde plasmiden ophelderen van haar rol in proteolyse van grotere DPCs.
Ongeacht de methode die is gebruikt voor het maken van de dwarslijn of van de aard van de DNA-laesie, is benadrukt dat de SSPE-qPCR-methodologie kritisch afhankelijk van de capaciteit is voor het genereren van aanzienlijke hoeveelheden van homogene DPC-plasmide substraat. Stappen essentieel voor deze analyse omvatten zuivering van covalent, gesloten-cirkelvormige plasmide na primer extensie te elimineren om het even welk gejat of lineaire plasmide moleculen. Deze verontreinigingen moeten worden weggewerkt om ervoor te zorgen dat eventuele latere DPC reparatie waargenomen geen gevolg van nick-gericht of dubbele-strand break geleide herstelsynthese is. Niet verkrijgen van voldoende hoeveelheden supercoiled DNA na primer extensie reacties kan worden overwonnen door het variëren van de verhouding van oligonucleotide naar single-stranded DNA. Een andere belangrijke stap voor de SSPE-qPCR-methode, is het crosslinking rendement van de eiwitten aan het plasmide. In deze studie, een efficiënte, enzymatische reactie werd gebruikt om dwarslijn het eiwit glycosylase oxoguanine op een laesie van de 8-oxo-guanine. Sub optimale crosslinking kan worden verbeterd door het variëren van de hoeveelheid eiwit toegevoegd aan de reactie.
Hoewel de resultaten in dit verslag beschreven vertrouwden op lipofection te introduceren DPC reparatie substraten in ontvangende cellen, er is geen reden, een priori, andere methoden van de transfections kunnen niet worden gebruikt. We hebben voorstudies uitgevoerd en nageleefd dat electroporation39 kan ook worden gebruikt. Echter het is vermeldenswaard dat in onze ervaring, electroporation transfectie efficiëntie wordt verminderd in vergelijking met lipofection, en we vonden het nodig om DNA van de vervoerder (maximaal 5 µg) naast de 1,5 µg DPC substraat te verkrijgen van de gegevens van de reparatie. Over het geheel genomen biedt de hierboven beschreven methode van SSPE-qPCR een innovatieve manier om uitsluitend DPC reparatie op plasmide DNA te onderzoeken en het genereren van nieuw inzicht in de reactie van DNA schade.

Hierin beschreven wordt een PCR-gebaseerde assay genoemd SSPE-qPCR. Het doel van deze methode is te kwantificeren DPC reparatie op plasmide die DNA transfected in reparatie ontoereikend en bedreven zoogdiercellen. Deze test is zeer flexibel, snel, kwantitatieve en direct maatregelen reparatie activiteit. Hoewel dit verslag richt zich op het gebruik van deze methode om te studeren reparatie van DPCs, illustreren resultaten hieronder dat reparatie van een laesie die blokkeert polymerase Taq kan worden bestudeerd met behulp van deze methode.
De grondgedachte achter de ontwikkeling van deze methode is inzicht te krijgen in de mechanismen waardoor zoogdiercellen reparatie DPCs. In tegenstelling tot andere soorten DNA-beschadiging zijn DPCs enorm divers1,2. Studies hebben aangetoond dat honderden cellulaire eiwitten kruisverwijzende DNA en dat voor elke proteïne die er zijn, in principe, talrijke aminozuur zijketens die covalent op cellulaire DNA3kunnen worden aangesloten kunnen worden. Daarnaast zijn er talloze chemische bevestigingspunten voor eiwitten op de ruggengraat van DNA, met inbegrip van verschillende posities op de honken nucleotide alsmede op de ribose suiker4,5. Deze chemische diversiteit verhoogt het vooruitzicht dat verschillende biochemische pathways kunnen worden ingeroepen om te herstellen van verschillende soorten DPCs. Het was met deze bezorgdheid in het achterhoofd dat de SSPE-qPCR assay werd ontwikkeld.
Verscheidene technieken zijn ontwikkeld om het inzicht in de moleculaire biologie van cellulaire DPC reparatie. Het volgende overzicht van de belangrijkste benaderingen die zijn ontwikkeld, met een samenvatting van de belangrijkste sterke en zwakke punten elke bezitten. Het is benadrukt dat terwijl deze samenvatting is gewijd aan studies van DPC reparatie in zoogdiercellen cultuur systemen, belangrijke bijdragen aan het huidige model van DPC reparatie zijn aangebracht met microbiële en cel-vrije systemen die niet in dit besproken worden manuscript.
Misschien is de eenvoudigste strategie die kan worden genomen om inzicht in de genetica van DPC reparatie te beoordelen van de respectieve gevoeligheid voor celdood waargenomen in wild-type en gemuteerde cellen blootgesteld aan agentia die DPCs6,7 induceren. Deze strategie is relatief snel, goedkoop, en vereist geen gespecialiseerde deskundigheid voorbij de capaciteit uit te voeren fundamentele cel cultuur technieken. Tegenwicht deze voordelen zijn talrijke beperkingen aan deze benadering, met inbegrip van de volgende. Ten eerste, de bepaling niet direct meet DNA-herstel. De werkhypothese ten grondslag liggen aan deze strategie is dat mutaties in de genen coderend voor relevante reparatie eiwitten van het DNA inactiveren resultaten in een opeenstapeling van DNA die triggers geprogrammeerde celdood schade. Echter kunnen, mutaties in de genen coderend voor niet-DNA-reparatie eiwitten in principe, verbeteren (of verminderen) cellulaire gevoeligheid voor xenobioticum-veroorzaakte celdood. Ten tweede, agenten die DPCs steevast maakt andere soorten DNA-beschadiging veroorzaken (één uitzondering is 5-aza-2'-deoxycytadine, maar deze agent put ook cellulaire methyltransferase niveau8). Daarom is het denkbaar dat verbeterde cellulaire overgevoeligheid voor de agent in kwestie gebreken in reparatie van interstrand crosslinks of andere laesies kan weerspiegelen. Ten derde, zoals hierboven vermeld, DPCs vertegenwoordigen een enorm heterogene klasse bestaat uit verschillende soorten chemische crosslinks, waarbij verschillende eiwit partners. Het is mogelijk dat terwijl de reparatie van een of meer subtypen van deze letsels kan worden gewijzigd in een bepaalde genetische achtergrond, dit verschil niet voldoende zijn kan om aanzienlijk veranderen cellulaire overgevoeligheid voor dood veroorzaakt door deze agent. Kortom, terwijl deze strategie een aantrekkelijke uitgangspunt vormt, benadruk de beperkingen hierboven beschreven het belang van het nastreven van andere, meer directe methoden om te bestuderen van de kinetiek van DPC reparatie.
Een aantal verwante benaderingen hebben ontwikkeld om dit doel te bereiken. Bijvoorbeeld, hebben de onderzoekers methodes onderscheid maken tussen "vrije" DNA en 'eiwit gebonden' DNA9,10,11ontwikkeld. Met behulp van deze benaderingen, is het mogelijk om te vergelijken steady-state niveaus van DPCs of na blootstelling aan een agent DPC-producerende in verschillende genetische achtergronden. De twee strategieën die zijn wijdst gebruikt betrekken DPC-bevattende DNA scheiden van gratis DNA met een nitrocellulose membraan bindende strategie of KCl/SDS neerslag12,13. Bij de aanpak van de voormalige zijn cellen lysed en doorgegeven door een nitrocellulose filter. Omdat nitrocellulose eiwit bindt, behoudt het filter eiwit gekoppelde DNA, mooi gratis DNA te passeren. In de laatste strategie wordt eiwit gebonden DNA gescheiden van gratis DNA, gebaseerd op het feit dat SDS aan eiwit maar niet DNA bindt, en kan worden versneld door de toevoeging van KCl. Bijgevolg wordt DNA eiwit gekoppelde onoplosbare, terwijl niet-afhankelijke DNA in oplossing blijft. DPC-bevattende DNA kan vervolgens worden quantitated met behulp van radiolabeled thymidine (als cellen waren aanvankelijk metabolisch aangeduid) of door een DNA-selectieve fluorescente kleurstof zoals Hoechst 33258. Deze methoden zijn reproduceerbaar en vereisen een klein aantal stappen. Ze bieden echter geen informatie over de aard van de chemische dwarslijn waardoor eiwitten aan DNA is gekoppeld. Bovendien, het is belangrijk op te merken, deze tests kunnen overschatten DPC herstellen door het ten onrechte scoren onvolledig reparatie, dat wil zeggen, Proteolytische verwerking aan kleinere DNA-peptide crosslinks die niet mag zoals gemakkelijk gevangen of, als bonafide DNA geprecipiteerde reparatie.
Komeet testen kunnen worden gebruikt om te visualiseren DPC vorming in cellen14. In deze experimenten, de aanwezigheid van DPCs afname DNA migratie, die vervolgens kan worden teruggedraaid door de voorbehandeling met proteïnase K. De lengte van de staart kan daarom worden gebruikt om te schatten van DPC vorming. Echter, zoals hierboven vermeld, DPC-vormende drugs maken andere soorten DNA-beschadiging die staartlengte kon veranderen. Dit protocol is ook zeer technisch en vereist expertise en opleiding in confocale beeldbewerking.
Massaspectrometrie kan worden gebruikt om te studeren DPC reparatie kinetiek na behandeling met crosslinking agenten15,16,17. Deze experimenten cellen met DPC-vormende stoffen behandelen en isoleren van DPCs via Biotine vangen of fenol: chloroform (1:1) extractie. Massaspectrometrie kan vervolgens worden gebruikt om te identificeren van de kruisverwijzende eiwitten of kwantificeren van het bedrag van de DPCs gevormd na verloop van tijd. Het grote voordeel van deze aanpak is de aard van de geproduceerde gegevens. Het is mogelijk om juist de catalogus de soorten eiwitten die worden kruisverwijzende na blootstelling aan een xenobioticum, echter dit protocol is duur, tijdrovend en wordt beperkt door de aard van de dwarslijn die kan worden ontdekt.
Maizels et al. ontwikkeld een gevoelige 'RADAR' (snelle aanpak van DNA adduct herstel) assay voor het kwantificeren van de immunodetection van DNA-proteïne adducten evenals een ELISA gebaseerde RADAR assay18,19. Deze tests zijn vooral handig voor het overvullen van DNA-proteïne tussenproducten die Transient vormen in cellen en het genereren van monsters geschikt voor massaspectrometrie te identificeren van nieuwe eiwitten adducten. Deze immunodetection-test is afhankelijk van de beschikbaarheid van antilichamen tegen het vangen van de DNA-proteïne dwarslijn en daarom mogelijk niet voor het opsporen van aangetaste DNA-peptide adducten dat formulier tijdens reparatie van. Onlangs, een specifieke DPC herstel traject gekoppeld aan DNA-replicatie en een metalloprotease van de DNA-afhankelijke Spartan werd ontdekt in welk DPCs proteolyzed naar kleinere peptiden tijdens reparatie20,21 zijn. Erfelijke mutaties in dit gen worden geassocieerd met Ruijs-Aalfs syndroom bij de mens, een ziekte die wordt gekenmerkt door instabiliteit van het genoom, voortijdige veroudering en leverkanker22. Muizen met genetisch gemanipuleerde Spartaanse gene defecten weergeven soortgelijke fenotypen23
Gastheercel reactivering van transcriptionele activiteit is gebruikt voor het bestuderen van de reparatie van gedefinieerde laesies aanwezig op transfected plasmide DNA substraten24,25. In deze experimenten, met DPCs (of andere soorten DNA laesies) plasmide dat het blokkeren van de transcriptie van een verslaggever, zoals luciferase, zijn transfected in cellen. Metingen van de luminescentie genomen 24-72 uur later zijn vervolgens gecorreleerd met DPC herstellen. Echter deze indirecte reparatie-tests voor het opsporen van reparatie gebeurtenissen eerder dan 24 h na transfectie van niet in staat zijn en geen onderscheid tussen RNA polymerase bypass van gedeeltelijk gerepareerde substraten en volledige reparatie.
Elk van de hierboven beschreven methoden heeft voordelen en heeft bijgedragen tot het huidige model van DPC reparatie. Echter de SSPE-qPCR assay omzeilt enkele van de beperkingen die zijn gekoppeld aan deze andere benaderingen en bijgevolg meer specifieke inzicht DPC herstelmechanismes kan verschaffen. Bijvoorbeeld, kan de SSPE-qPCR bepaling direct meten reparatie van site-specific DPCs op DNA in intact zoogdiercellen. Deze methode is veelzijdig en is gebruikt voor het verkrijgen van reparatie resultaten na transfectie in hamster en menselijke cellijnen. De transfectie van het plasmide kan worden uitgevoerd met behulp van lipofection of electroporation in gekweekte zoogdiercellen cellijnen. Het zorgt er ook voor dat enige reparatie van gedefinieerde DPCs wordt gemeten, en niet van andere soorten DNA-beschadiging door meeste DPC-vormende agenten veroorzaakt. De SSPE-qPCR is gemakkelijk uit te voeren, goedkoop, en snel. Resultaten verkregen met behulp van deze test hebben zo spoedig 2 h post transfectie reparatie gebeurtenissen gedetecteerd. Met behulp van deze methode, kunnen variabelen die invloed op DPC reparatie resultaten hebben kunnen bestudeerd worden in een gevoelige en efficiënte wijze. Bijvoorbeeld, heeft de rol van transcriptie in DPC reparatie nog strikt worden geëvalueerd. Als gevolg van de flexibiliteit van de SSPE-qPCR test, kan het crosslinking-site van het DPC worden gemanipuleerd om deze vraag. Bovendien kan de invoering van een oorsprong van replicatie in het DPC-bevattende plasmide inspelen op de invloed van replicatie op DPC reparatie worden gebruikt. Bovendien kunnen meerdere crosslinks op het plasmide te bestuderen van de verschillen in de reparatie van een enkele DPC versus meerdere crosslinks worden gemaakt. Dit zijn vragen die zou moeilijk te beantwoorden met behulp van de chromosomale DNA maar kunnen gemakkelijk worden aangepakt met behulp van de bepaling van de SSPE-qPCR. Over het algemeen de SSPE-qPCR bepaling vereist gezuiverd, plasmide DNA in microgram hoeveelheden met een laesie van een bekende locatie. Adducten naast DPC kan worden gebruikt in deze test, echter moet de laesie kunnen blokkeren extensie door Taq polymerase.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="657">
	<tbody>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:215px;">8-oxoguanine modified oligo</td>
			<td style="width:157px;">Midland Certified Reagent Company</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">Sequence: 5&#8217;AGGGTTTTCCA (8-oxo-dG)TCACGACGTT 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">T4 PNK</td>
			<td style="width:157px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0201S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Single-stranded M13</td>
			<td style="width:157px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N4040S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Taq polymerase</td>
			<td style="width:157px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0267L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">ATP, 100mM</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0441</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">dNTP Mix, 10mM each</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0192</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">BSA</td>
			<td style="width:157px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">B9001S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">T4 polymerase</td>
			<td style="width:157px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0203L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">T4 ligase</td>
			<td style="width:157px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">&#946;-agarase</td>
			<td style="width:157px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0392S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Oxoguanine glycosylase 1</td>
			<td style="width:157px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0241S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td style="width:157px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4309155</td>
			<td style="width:167px;">green PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">Primer R</td>
			<td style="width:157px;">UMN Genomic Center</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">5&#8217;CGGCTCGTATGTTGTGTG 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Primer L</td>
			<td style="width:157px;">UMN Genomic Center</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">5&#8217; GCTGCAAGGCGATTAAGT 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Lipofectamine Reagent</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">18324-012</td>
			<td>transfection reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">BspD1</td>
			<td style="width:157px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0557S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NEB buffer 2</td>
			<td style="width:157px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">B7002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">StepOnePlus Real Time PCR System</td>
			<td style="width:157px;">Applied Biosystems</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">UltraPure Buffer-Saturated Phenol</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15513-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Chloroform, reagent ACS, spectro grade</td>
			<td style="width:157px;">ACROS</td>
			<td style="width:119px;">40463-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple, rapid, and quantitative assay to measure repair of dna-protein crosslinks on plasmids transfected into mammalian cells

Het doel van deze methode is om een kwantitatieve, flexibele en snelle techniek te onderzoeken de kinetiek van DNA-proteïne dwarslijn (DPC) reparatie in zoogdieren cellijnen. In plaats van wereldwijd keuring verwijdering van xenobioticum-geïnduceerde of spontane chromosomale DPC-verwijdering, onderzoekt deze test de reparatie van een laesie van het homogene, chemisch welbepaalde specifiek geïntroduceerd op een site binnen een plasmide DNA substraat. Nog belangrijker is, is deze aanpak vermijdt het gebruik van radioactieve stoffen en is niet afhankelijk van dure of hoogst gespecialiseerde technologie. In plaats daarvan, is het afhankelijk van standaard recombinant DNA procedures en wijd-beschikbaar real-time, kwantitatieve polymerase kettingreactie (qPCR) instrumentatie. Gezien de inherente flexibiliteit van de strategie gebruikt, de grootte van de proteÃ¯ne kruisverwijzende, evenals de aard van de chemische binding en de precieze DNA kan sequentie context van de bijlage-site worden gevarieerd om aan te pakken van de respectieve bijdragen van deze parameters voor de algehele efficiëntie van DPC reparatie. Met behulp van deze methode, plasmiden met een sitespecifieke DPC transfected waren in cellen en lage moleculaire gewicht DNA ving op verschillende tijden na transfectie. Herstelde DNA is vervolgens onderworpen aan strand-specifieke primer extensie (SSPE) met behulp van een aanvulling op het beschadigde onderdeel van de plasmide primer. Sinds de DPC laesie blokken polymerase van DNA Taq, kan de verhouding van de gerepareerde te un-gerepareerde DNA worden kwantitatief beoordeeld met behulp van qPCR. Cyclus-drempelwaarden (CT) worden gebruikt om te berekenen percentage reparatie op verschillende tijdstippen in de respectieve cellijnen. Deze SSPE-qPCR-methode kan ook worden gebruikt om te beoordelen kwantitatief de reparatie kinetiek van elk DNA adduct dat blokken Taq polymerase.

Om gebruik te maken van de bepaling van de SSPE-qPCR om te evalueren van de cellulaire reparatie van het DPC, moet een voldoende hoeveelheid (µg bedragen) kwalitatief hoogwaardige DPC reparatie substraat worden voorbereid. Voor het verkrijgen van dit product, was een met een 8-oxoguanine-residu oligonucleotide ontharde aan aanvullende single-stranded DNA, primer uitgebreid en gel gezuiverd om ervoor te zorgen dat alleen covalent, gesloten circulaire product werd gebruikt voor transfections (figuur 1a). dit verslag concentreert zich op substraten waarin natriumboorhydride-overlapping wordt gebruikt voor het maken van een covalente dwarslijn tussen recombinante menselijke oxoguanine glycosylase en een ribose-eenheid op een double-stranded circulaire plasmide molecuul, hoewel analoog benaderingen kan worden gebruikt voor het verkrijgen van chemisch divers DPC substraten. De oxoguanine glycosylase/natriumboorhydride overlapping strategie is vooral aantrekkelijk gezien de extreem hoog rendement van het crosslinking reactie. Zoals blijkt uit figuur 1B, KCl/SDS neerslag uitgevoerd op een substraat DPC, die had zijn verteerd in twee fragmenten selectief en kwantitatief bijna uitgeput het fragment van DNA de DPC herbergen. Deze resultaten steun de conclusie dat in wezen 100% van de plasmide substraat moleculen een eiwit dwarslijn bevatten.
De bepaling van de SSPE-qPCR beschreven in de sectie Protocol maakt gebruik van CT-waarden die zijn gegenereerd door de qPCR voor de berekening van het percentage van DPC reparatie na transfectie in zoogdiercellen. Zoals uit Figuur 2 blijkt, blokkeert de dwarslijn eiwit polymerase Taq uit te breiden van de 'R' primer gegloeid aan de DPC-bevattende bundel. Een tweede, kritische kenmerk van deze test is de opneming van acht rondes van SSPE Reacties (met behulp van de R-primer) vóór het uitvoeren van de bepaling van de qPCR. Terwijl onbeschadigd (of gerepareerde) DNA zal worden uitgebreid tijdens deze SSPE reacties, zal maken van een bindende site voor de downstream 'L' primer, beschadigde DNA (of onvolledig gerepareerde DNA) niet worden verlengd. Bijgevolg verhoogt SSPE de overvloed van elk onderdeel van het onbeschadigd (of gerepareerde) door eight-fold. Dit betekent dat gerepareerd monsters waarin de stap SSPE is verricht voorafgaand aan de qPCR zal een CT-waarde dat drie eenheden lager is dan die verkregen voor een identieke monster waarin SSPE is niet uitgevoerd vóór de qPCR (Figuur 2) weergeven. Het verschil van de drie-eenheid in de CT-waarden waargenomen voor de twee behandelingen, aangeduid als ΔCT, weerspiegelt het feit dat 8 = 23. Deze delta CT waarde kan worden gebruikt voor het berekenen van de cellulaire DNA herstellen activiteit met behulp van de formule: percentage DNA-herstel = (2ΔCT /23) x 100. Controle experimenten bevestigd dat een delta CT waarde van ongeveer 3 consequent werd waargenomen wanneer onbeschadigd substraat plasmiden werden onderworpen aan SSPE-qPCR (gegevens niet worden weergegeven).
Tabel 1 toont voorbeelden CT-waarden die zijn gegenereerd uit DPC-bevattende plasmide ondergronden die waren hersteld van fibroblasten van Chinese hamsters longkanker 3 h en 8 h na transfectie (tabel 1A), evenals tijd van nul monsters, dat wil zeggen, monsters die waren voorbereid zoals beschreven in de sectie Protocol, maar niet transfected in cellen (tabel1B). De tabel bevat ook de ΔCT en procent repareren waarden (berekend met de formule 2ΔCT/23 x 100) verkregen van deze monsters. Zoals geïllustreerd in tabel 1A, het percentage reparatie berekend op basis van monsters geoogst 3 h en 8 h na transfectie was 66% en 93%, respectievelijk. Deze waarden worden dan afgetrokken daaruit verkregen analyse van het monster 0 h om het percentage herstellen. Tabel 1B beeldt CT waarden voor twee verschillende 0 h monsters waarin efficiënte crosslinking was of niet is bereikt vóór de transfectie. Efficiënt resulteerde kruisverwijzende monster in een delta CT waarde van 0,8, overwegende dat een slecht kruisverwijzende monster in een delta CT waarde van 2,5 resulteerde. Tot op heden is het niet gelukt is om precies de bron van het signaal van de 0.8 achtergrond in het efficiënt kruisverwijzende 0 h monster. Het is onwaarschijnlijk dat deze achtergrond een laag niveau van beide spontane DPC-verwijdering weerspiegelt, of is als gevolg van een laag niveau van Taq polymerase 'omzeilen' synthese door de DPC laesie: uitgebreide experimenten uitgevoerd op hoogst gezuiverde single-stranded M13 substraat consequent leverde een delta CT waarde van ongeveer 0.8, achtergrond dat wil zeggen, in wezen identiek is aan dit' ' extensie gezien in DPC-bevattende substraten. Daarom is het waarschijnlijk dat er een kleine mate van mis priming van de 'R' primer tijdens SSPE, die resultaten in de generatie van een kleine hoeveelheid product dat vervolgens kan worden versterkt is wanneer de 'L' primer is toegevoegd, en qPCR uitgevoerd. Streven deze achtergrond door het manipuleren van PCR voorwaarden hebben, tot op heden niet in geslaagd om dit gebrek te verhelpen. Echter, de strategie van de aftrekken hierboven beschreven toelaat nauwkeurige schatting van DPC reparatie activiteit. Het is de moeite waard constaterend dat inefficiënte crosslinking van het eiwit op het plasmide zal resulteren in een verhoogde achtergrond waarde. Dit is in de voorbeeldgegevens die in tabel 1B waar inefficiënte eiwit-DNA crosslinking in een hogere delta CT waarde voor tijd 0 resulteerde afgebeeld. Daarom worden steevast controle experimenten uitgevoerd alvorens aan te vangen transfections en substraten met delta CT waarden verheven boven de 0.8 drempel worden verwijderd. Zoals vermeld in het qPCR-protocol, is elk monster verdeeld in 3 wells pipetting samenhang te waarborgen. Deze wordt gerepliceerd zijn dan gemiddeld voor de CT-waarde voor dat monster. Repliceert dat afwijken meer dan ± 0,1 zijn geëlimineerd uit de gegevensset. Als alle drie replicaat-organismen meer dan ± 0,1 van elkaar afwijken, is de SSPE-qPCR assay redone tot consistente waarden worden verkregen. De ervaring leert dat ten minste 3 onafhankelijke transfections moeten worden uitgevoerd om betrouwbare gemiddelden die vervolgens kunnen worden onderworpen aan statistische analyse om te bepalen van de invloed van verschillende parameters op DPC reparatie efficiëntie te verkrijgen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57413/57413fig1.jpg"> Figuur 1. Generatie van een plasmide DPC-bevattende. (A) een oligonucleotide met een 8-oxo-guanine-residu (rood) is gegloeid om single-stranded DNA (vet zwarte cirkel) en uitgebreid tot het maken van double-stranded plasmide (primer extensie product aangegeven door onderbroken lijn). Na elektroforese in ethidiumbromide, is de band overeenkomt met supercoiled DNA (rode vak) weggesneden uit een lage-smelt agarose gel en verteerd met β-agarase. Rijstroken: moleculair gewicht (1) marker, (2) single-stranded DNA, (3) double-stranded DNA, (4) primer uitgebreide steekproef. (B) Oxoguanine glycosylase (afgekort tot hOGG1, afgebeeld als een oranje cirkel) is kruisverwijzende aan het residu van de 8-oxo-guanine via natrium cyanoborohydride en de resulterende DPC substraat verteerd voor het genereren van een 2.800 base-paar, gratis fragment van DNA en een 4.400 basenpaar fragment gekoppeld aan het eiwit. SDS is toegevoegd aan het monster die vervolgens is verdeeld in twee delen, waarvan één is behandeld met KCl en gecentrifugeerd tot sediment DPC-bevattende DNA (afgebeeld als een oranje pellet). Het supernatant van dit laatste voorbeeld (afgebeeld als blauwe vloeistof in de centrifugebuis) en het monster niet blootgesteld aan KCl zijn onderworpen aan de Elektroforese van het gel. Rijstroken: (1) molecuulgewicht marker, (2) + (3) -KCl, KCl. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57413/57413fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57413/57413fig2.jpg"> Figuur 2: kwantificering van beschadigde plasmide via SSPE-qPCR. Plasmide-DNA is gedenatureerd en een aanvulling vormen op het beschadigde onderdeel (R) primer is gegloeid en uitgebreid. Dit proces wordt herhaald voor een totaal van 8 cycli. Met een beschadigde substraat (boven), Taq polymerase is geblokkeerd door de DPC laesie en zal niet tot volledige lengte product strengen. In tegenstelling, zal een gerepareerde substraat (onder), polymerase Taq opstellen full-length product strengen met de bindende site voor primer L. Na 8 cycli, primer L wordt toegevoegd en cyclus drempelwaarden worden bepaald met behulp van qPCR. Voorbeeld amplificatie resultaten voor beschadigde en onbeschadigd substraten worden geïllustreerd aan de rechterkant met de rode lijn vertegenwoordigen van DNA die onderging primer extensie voorafgaand aan qPCR en blauw vertegenwoordigen DNA dat geen primer uitgebreid voorafgaand aan qPCR. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57413/57413fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Tabel 1A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Tijd</td>
			<td rowspan="2">-Primer extensie</td>
			<td rowspan="2">+ Verlenging primer</td>
			<td rowspan="2">Δ CT</td>
			<td>Percentage reparatie</td>
		</tr>
<tr>
<td>(2ΔCT/23x 100)</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 h</td>
			<td>23,5</td>
			<td>21.1</td>
			<td>2.4</td>
			<td>66</td>
		</tr>
<tr>
<td>8 h</td>
			<td>29.4</td>
			<td>26.5</td>
			<td>2.9</td>
			<td>93</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tabel 1B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Tijd</td>
			<td rowspan="2">-Primer extensie</td>
			<td rowspan="2">+ Verlenging primer</td>
			<td rowspan="2">Δ CT</td>
			<td>Percentage achtergrond</td>
		</tr>
<tr>
<td>(2ΔCT/23x 100)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 h</td>
			<td>15,4-inch</td>
			<td>14.6</td>
			<td>0.8</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 h</td>
			<td>15,4-inch</td>
			<td>12.9</td>
			<td>2.5</td>
			<td>71</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: berekening procent herstellen met behulp van CT-waarden die zijn gegenereerd uit de SSPE-qPCR. (A) reparatie van een substraat DPC-bevattende transfected in V79 Chinese hamster Long fibroblasten 3 h en 8 h na transfectie. (B) SSPE-qPCR van 0 h monsters niet in cellen transfected. In één monster de efficiency van de reactie van het crosslinking tussen DNA en oxoguanine glycosylase was hoog (in dit voorbeeld leverde een lage delta CT-waarde) terwijl in het andere monster de efficiëntie van eiwit crosslinking laag was (in dit voorbeeld leverde een relatief hoge delta CT waarde). Zie tekst van Vertegenwoordiger resultaten voor meer informatie.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells at JoVE.com

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

Een eenvoudige, snelle en kwantitatieve bepaling aan maatregel reparatie van DNA-proteïne Crosslinks op plasmiden Transfected in zoogdiercellen

Het doel van dit protocol is te kwantificeren van het herstel van gedefinieerde DNA-proteïne crosslinks op plasmide DNA. Lesioned plasmiden zijn transfected in ontvangende zoogdieren cellijnen en laag-moleculair gewicht geoogst op meerdere tijd punten na transfectie. DNA repair kinetiek worden gekwantificeerd aan de hand van strand-specifieke primer uitbreiding gevolgd door qPCR.

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

Tools om de rol van de Architectural eiwit HMGB1 Bestudeer in de verwerking van Helix vervormen, site-specifieke DNA InterStrand Crosslinks

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Selectieafhankelijke en onafhankelijke generatie van CRISPR / Cas9-gemedieerde Gene Knockouts in zoogdiercellen

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Een standaard methodiek te onderzoeken ter plaatse mutageniteit als een functie van punt mutatie reparatie gekatalyseerd door CRISPR/Cas9 en SsODN in menselijke cellen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation om te studeren In Vivo cellulaire reacties op eenvoudige en complexe DNA-schade

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

Aanpassing van hybridisatie inname van chromatine-geassocieerde eiwitten voor Proteomics op zoogdiercellen

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Formaldehyde-bijgewoonde isolatie van regelgevende elementen maatregel chromatine toegankelijkheid in zoogdiercellen

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

De Replica Set, methode: Een High-throughput benadering van kwantitatief maatregel Caenorhabditis elegans levensduur

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetische manipulatie van Dictyostelium discoideum cellen op basis van de selectie en de groei van bacteriën

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

Chromatische immunoprecipitatie test met behulp van Micrococcal nucleasen in zoogdiercellen

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Massa spectrometrie gebaseerde Proteomics Analyses met behulp van de OpenProt Database te onthullen nieuwe eiwitten vertaald uit niet-canonieke Open lezing Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...