Name: a simple, rapid, and quantitative assay to measure repair of dna-protein crosslinks on plasmids transfected into mammalian cells
Uploaded: 2018-03-05T15:00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells at JoVE.com

Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından (ES023350) finanse edildi. Lisa Chesner eğitim Grant 5T32HL007741 tarafından desteklenir. Natalia Tretyakova (Minnesota Üniversitesi) ve Kaan Basu (Connecticut Üniversitesi) ve laboratuvar üyeleri destek ve teknik danışmanlık sırasında erken ve ara aşamalarını Bu eser için teşekkür ederiz.

1. nesil DPC içeren plazmid
<ol><li>8-oxoguanine kalıntı (20 µL) içeren Oligonükleotid 80 pmol T4 polinükleotit kinaz (1 µL) 10 x ligaz arabelleği (5 µL) 10 ünite ile birleştirir. Toplam hacmi 50 µL ulaşmak ve 30 dk içinde ısıtmalı su banyosu için 37 ° C'de kuluçkaya su ekleyin.<ol>
<li>Fosforile Oligonükleotid (50 µL), tek iplikçikli DNA'ın 80 pmol birleştirmek (80 μL), 100 adet Taq polimeraz (20 µL) 10 x Taq reaksiyon arabelleği (25 µL), 100 mM ATP (20 µL), 10 mM dNTPs (20 µL), NF'leri arabellek 2 (25 µL) ve 8 µg BSA (260 µL. Toplam 20 µL) Incubate örnek bir thermocycler 15dk 37 ° C 5 min için takip için 75 ° C'de ayarla. Sonra 60 U T4 polimeraz (20 µL), 8.000 U T4 ligaz (20 µL), 100 mM ATP ekleyin (20 µL), 10 mM dNTPs (20 µL), NF'leri arabellek 2 (15 µL) ve 8 µg BSA (375 toplam 20 µL) µL. kuluçkaya tepki gecede 37 ° C'de (şekil 1A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>50: 50 arabellek doymuş fenol: kloroform karışımı oluşturun. Her bileşen, mix, eşit miktarda ekleyin ve 5 dk. iki katmanı oluşturmak için arabellek doymuş fenol kloroform sürücüler sudan 21,130 x g de masa üstü santrifüj içinde spin: bir üst, sulu katman ve alt, organik katmanı. Daha düşük, organik tabakasının 375 µL astar uzantısı tepki, mix, ekleyin ve 5 min için masa üstü santrifüj 21,130 x g de spin. Dikkat: Fenol ve kloroform tehlikeli maddeler ve deri ve gözleri ile temasını engellemek için önlemler alınmalıdır.<ol>
<li>Santrifüjü, dikkatle üst tabaka ayıklamak ve 0,3 M % 100 etanol 2 cilt tarafından takip son bir konsantrasyon ekledi amonyum asetat ile karıştırın. -20 ° c en az 30 dk ya da bir gecede çözüm saklayın.</li>
		<li>15.000 x devir / dakikada 4 ° C, Masa üstü santrifüj 10 dk. Kaldır için örnekte süpernatant spin ve Pelet 1 mL % 70 etanol yıkayın. 5 dk. süpernatant kaldırmak ve Pelet su 100 µL içinde resuspend bir masa üstü santrifüj 4 ° C'de 15.000 x rpm'de örnekte spin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>16 µL 6 x jel-yükleme boya ile önceki adımdaki DNA ve 34 µL su 50 µL birleştirin ve 0,5 µg/mL arasında etidyum bromür içeren Jel Elektroforez % 0.8 düşük-melt özel olarak tabi. Jel 2 V/cm 10 cm jel 6 h 1 x TAE arabelleği için çalıştırın. Bir tıraş bıçağı ve tartmak jel dilim (şekil 1A) kullanarak supercoiled grup tüketim. Nerede geçirir kovalent kapalı, supercoiled DNA için bir işaretleyici olarak hizmet için olumlu bir denetimi çalıştırın. Dikkat: Bir alkil etidyum bromür olduğunu ve cilt ile temasını engellemek için önlemler alınmalıdır. Ayrıca, plazmid örnek için UV UV photoproducts oluşumunu azaltmak için maruz kalan süresini en aza indirmek önemlidir.<ol>
<li>Jel dilim için her mg jel ağırlığının % 10 β-agarase tepki arabelleği ekleyerek sindirmek. 65 ° c 10 dk ve serin ile 42 ° c için kuluçkaya 10 U β-agarase / ekleyin ve 1 h için 42 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Aşağıdaki kuluçka, birimin tedbir ve 0,3 M ve chill son konsantrasyon 15 dk. santrifüj oda sıcaklığında 15 dak için 15.000 x g de buzda amonyum asetat eklemek, süpernatant toplamak ve isopropanol, 2 cilt ekleyin. -20 ° C'de gecede chill.</li>
		<li>Arıtılmış, supercoiled DNA 10 dk 4 ° C'de bir masa üstü santrifüj 15.000 x rpm'de santrifüj kapasitesi ve Pelet su 40 µL içinde resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>36 pmol oxoguanine glycosylase (1 µL) 100 mM NaCl içeren arabellekte için Crosslink 12 pmol (15 µL) DNA'ın (3 µL), 1 mM MgCl2 (3 µL), son hacmi için 37 ° C'de 30 µL ulaşmak için 20 mM Tris-HCl pH 7,0 (6 µL) ve 10 mM sodyum cyanoborohydride (2 µL) 30 dk26. Çapraz Örnek 1 µL kaldırın ve 0 bir veri noktası ve 3. adımda PCR üzerinde analiz h olarak hizmet için su 500 µL oranında seyreltin.</li>
</ol>2. kCl/SDS Yağış
<ol><li>Crosslinking verimliliği görselleştirmek için kısıtlama sindirmek için iki farklı boyutta DNA parçaları oluşturmak 1 h 37 ° C'de 10 x arabellekte 1 μL BspDI ile çapraz plazmid 1 µg. Not: Çapraz protein (4,4 kb) bir parçası olacak ve diğer-ecek değil (2,8 kB) (şekil 1B).<ol>
<li>Örnekleri, ikiye bölmek hem son konsantrasyonu % 0,5 SDS ekleyin ve 10 dk 65 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>KCl ekleyin (son toplama 100 mM) birine örnekleri ve 5 min için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>Her iki örnekleri 4 ° C'de 5 min için 12.000 x g, santrifüj kapasitesi ve yüzde konjugasyon bir protein DNA12tahmin etmek için bir özel jel supernatants çalıştırın. Not: KCl/SDS yağış kalite kontrol, yüzey hazırlık için kullanılır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. memeli hücre içine transfection
<ol><li>1 gün önce transfection, plaka 0.5 x 106 hücreler/6-şey tabak içinde iyi. Ertesi gün, 1,5 µg (30 µL) ile 300 µL serum serbest kültür ortamının (Kimden adım 1.6) DPC içeren plazmid, karıştırın. Başka bir tüp içinde 12 µL transfection reaktif ve 300 µL serum serbest kültür ortamının karıştırın. Seyreltilmiş DNA'ın 300 µL seyreltilmiş transfection reaktif 300 µL ile birleştirin ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. 250 µL kompleksleri, her iki kuyu ekleyin ve en az 1 h 37 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>Kuluçka, medyayı çıkarın, % 0.6 SDS/0,01 M EDTA, 1 mL ekleyin ve 10-15 dk. kazımak için bir lastik polis kullanarak hücreleri oda sıcaklığında kuluçkaya ve 1.5 mL microfuge tüp aktarmak. Yavaşça 5 kere 5 M NaCl (1 M son konsantrasyon), ters çevir'i 200 µL ekleyin ve 4 ° C gece27, kuluçkaya.</li>
	<li>21,130 x g bir masa üstü santrifüj 4 ° C'de 30 dk içinde de örnekler santrifüj kapasitesi, yukarıda açıklandığı gibi süpernatant, etanol çökelti toplamak ve su 50 µL içinde resuspend.</li>
</ol>4. SSPE-qPCR
<ol><li>Her zaman noktası (dahil olmak üzere 0 h), 2 x SYBR yeşil PCR ana mix (30 µL), 27 µL su ve 1 µL (100 pMol) astar plazmid (astar R, Şekil 2) hasar strand tamamlayıcı kurtarılan DNA'ın 1 µL karıştırın. Aşağıdaki koşullar kullanarak PCR gerçekleştirmek: ilk 8 döngüleri tarafından takip 90 ° C'de 10 dakika öncesi eritebilir: 90 ° C, 15 s, 65 ° C, 1 dak. Döngüsü bitiminde 8 1 µL (100 pMol) ikinci astar 60 µL (astar L, Şekil 2)28 Toplam Ekle ( Tablo malzemeleri reaktif Ayrıntılar için bakınız).</li>
	<li>Mix 1 µL unamplified, her zaman noktası (dahil olmak üzere 0 h), 2 x ana mix (30 µL), su 27 µL ve her astar (100 pMol) 60 µL toplam 1 µL DNA kurtarıldı.</li>
	<li>Adım 4.1 ve 4.2 (20 µL/kuyuda, nüsha) örnekleri ile bir 96-şey PCR plaka yüklemek ve qPCR 30 döngüleri yukarıda açıklanan koşullar kullanarak gerçekleştirmek.</li>
	<li>Her el onaylatılacak örnekleri CT değerleri ortalama. Adım 4.1 alanındaki bu adım 4.2 delta her örnek için CT değer elde etmek için oluşturulmuş CT değerleri çıkarmak. Herhangi bir arka plan (ayrıntılı bir açıklama için bkz: Temsilcisi sonuçları bölümü) kaldırmak için delta CT değeri 0 h zaman noktasından çıkarın.</li>
	<li>Delta CT değeri yüzde onarım formülü kullanarak dönüştürmek: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57413/57413eq1v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tretyakova, N. Y., Groehler, A., Ji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-Protein+Cross-links:+Formation,+Structural+Identities,+and+Biological+Outcomes.">DNA-Protein Cross-links: Formation, Structural Identities, and Biological Outcomes.</a> Accounts of chemical research. 48 (6), 1631-1644 (2015).</li><li>Barker, S., Weinfeld, M., Murray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-protein+crosslinks:+their+induction,+repair,+and+biological+consequences.">DNA-protein crosslinks: their induction, repair, and biological consequences.</a> Mutat Res. 589 (2), 111-135 (2005).</li><li>At Groehler, A. t., Degner, A., Tretyakova, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Tools+to+Characterize+DNA-Protein+Cross-Linking+by+Bis-Electrophiles.">Mass Spectrometry-Based Tools to Characterize DNA-Protein Cross-Linking by Bis-Electrophiles.</a> Basic Clin Pharmacol Toxicol. 121, 63-77 (2016).</li><li>Barker, S., Weinfeld, M., Zheng, J., Li, L., Murray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mammalian+proteins+cross-linked+to+DNA+by+ionizing+radiation.">Identification of mammalian proteins cross-linked to DNA by ionizing radiation.</a> J Biol Chem. 280 (40), 33826-33838 (2005).</li><li>Dizdaroglu, M., Gajewski, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+hydroxyl+radical-induced+formation+of+a+DNA-protein+cross-link+involving+thymine+and+lysine+in+nucleohistone.">Structure and mechanism of hydroxyl radical-induced formation of a DNA-protein cross-link involving thymine and lysine in nucleohistone.</a> Cancer Res. 49 (13), 3463-3467 (1989).</li><li>Chvalova, K., Brabec, V., Kasparkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+the+formation+of+DNA-protein+cross-links+by+antitumor+cisplatin.">Mechanism of the formation of DNA-protein cross-links by antitumor cisplatin.</a> Nucleic Acids Res. 35 (6), 1812-1821 (2007).</li><li>Speit, G., Schutz, P., Merk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+repair+of+formaldehyde-induced+DNA-protein+crosslinks+in+repair-deficient+human+cell+lines.">Induction and repair of formaldehyde-induced DNA-protein crosslinks in repair-deficient human cell lines.</a> Mutagenesis. 15 (1), 85-90 (2000).</li><li>Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+DNA-protein+crosslink+repair.">Mechanisms of DNA-protein crosslink repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).</li><li>Kohn, K. W., Erickson, L. C., Ewig, R. A., Friedman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+DNA+from+mammalian+cells+by+alkaline+elution.">Fractionation of DNA from mammalian cells by alkaline elution.</a> Biochemistry. 19 (15), 4629-4637 (1976).</li><li>Ewig, R. A., Kohn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair+in+mouse+leukemia+L1210+cells+treated+with+nitrogen+mustard,+1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea,+and+other+nitrosoureas.">DNA damage and repair in mouse leukemia L1210 cells treated with nitrogen mustard, 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea, and other nitrosoureas.</a> Cancer Res. 37, 2114-2122 (1977).</li><li>Ewig, R. A., Kohn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-protein+cross-linking+and+DNA+interstrand+cross-linking+by+haloethylnitrosoureas+in+L1210+cells.">DNA-protein cross-linking and DNA interstrand cross-linking by haloethylnitrosoureas in L1210 cells.</a> Cancer Res. 38, 3197-3203 (1978).</li><li>Zhitkovich, A., Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+sensitive+assay+to+detect+DNA-protein+crosslinks+in+intact+cells+and+in+vivo.">A simple, sensitive assay to detect DNA-protein crosslinks in intact cells and in vivo.</a> Carcinogenesis. 13 (8), 1485-1489 (1992).</li><li>Chiu, S. M., Sokany, N. M., Friedman, L. R., Oleinick, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+processing+of+ultraviolet+or+ionizing+radiation-induced+DNA-protein+cross-links+in+Chinese+hamster+cells.">Differential processing of ultraviolet or ionizing radiation-induced DNA-protein cross-links in Chinese hamster cells.</a> Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med. 46 (6), 681-690 (1984).</li><li>Merk, O., Reiser, K., Speit, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chromate-induced+DNA-protein+crosslinks+with+the+comet+assay.">Analysis of chromate-induced DNA-protein crosslinks with the comet assay.</a> Mutat Res. 471 (1-2), 71-80 (2000).</li><li>Loeber, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+DNA-protein+cross-linking+by+antitumor+nitrogen+mustards.">Proteomic analysis of DNA-protein cross-linking by antitumor nitrogen mustards.</a> Chem Res Toxicol. 22 (6), 1151-1162 (2009).</li><li>Gherezghiher, T. B., Ming, X., Villalta, P. W., Campbell, C., Tretyakova, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1,2,3,4-Diepoxybutane-induced+DNA-protein+cross-linking+in+human+fibrosarcoma+(HT1080)+cells.">1,2,3,4-Diepoxybutane-induced DNA-protein cross-linking in human fibrosarcoma (HT1080) cells.</a> J Proteome Res. 12 (5), 2151-2164 (2013).</li><li>Groehler, A. t., Villalta, P. W., Campbell, C., Tretyakova, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Covalent+DNA-Protein+Cross-Linking+by+Phosphoramide+Mustard+and+Nornitrogen+Mustard+in+Human+Cells.">Covalent DNA-Protein Cross-Linking by Phosphoramide Mustard and Nornitrogen Mustard in Human Cells.</a> Chem Res Toxicol. 29 (2), 190-202 (2016).</li><li>Kiianitsa, K., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+assay+for+DNA-protein+covalent+complexes+in+living+cells.">A rapid and sensitive assay for DNA-protein covalent complexes in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 41 (9), e104 (2013).</li><li>Kiianitsa, K., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+isolation,+identification+and+quantification+of+DNA-protein+adducts+by+ELISA-based+RADAR+assay.">Ultrasensitive isolation, identification and quantification of DNA-protein adducts by ELISA-based RADAR assay.</a> Nucleic Acids Research. 42 (13), e108 (2014).</li><li>Stingele, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+Regulation+of+DNA-Protein+Crosslink+Repair+by+the+DNA-Dependent+Metalloprotease+SPRTN.">Mechanism and Regulation of DNA-Protein Crosslink Repair by the DNA-Dependent Metalloprotease SPRTN.</a> Molecular Cell. 64 (4), 688-703 (2016).</li><li>Vaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloprotease+SPRTN/DVC1+Orchestrates+Replication-Coupled+DNA-Protein+Crosslink+Repair.">Metalloprotease SPRTN/DVC1 Orchestrates Replication-Coupled DNA-Protein Crosslink Repair.</a> Mol Cell. 64, 704-719 (2016).</li><li>Maskey, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spartan+deficiency+causes+accumulation+of+Topoisomerase+1+cleavage+complexes+and+tumorigenesis.">Spartan deficiency causes accumulation of Topoisomerase 1 cleavage complexes and tumorigenesis.</a> Nucleic Acids Res. 45 (8), 4564-4576 (2017).</li><li>Lessel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+SPRTN+cause+early+onset+hepatocellular+carcinoma,+genomic+instability+and+progeroid+features.">Mutations in SPRTN cause early onset hepatocellular carcinoma, genomic instability and progeroid features.</a> Nature Genetics. 46 (11), 1239-1244 (2014).</li><li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+excision+repair+eliminates+unique+DNA-protein+cross-links+from+mammalian+cells.">Nucleotide excision repair eliminates unique DNA-protein cross-links from mammalian cells.</a> J Biol Chem. 282 (31), 22592-22604 (2007).</li><li>Ahn, B., Kang, D., Kim, H., Wei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+mitomycin+C+cross-linked+DNA+in+mammalian+cells+measured+by+a+host+cell+reactivation+assay.">Repair of mitomycin C cross-linked DNA in mammalian cells measured by a host cell reactivation assay.</a> Mol Cells. 18 (2), 249-255 (2004).</li><li>Fromme, J. C., Bruner, S. D., Yang, W., Karplus, M., Verdine, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product-assisted+catalysis+in+base-excision+DNA+repair.">Product-assisted catalysis in base-excision DNA repair.</a> Nat Struct Biol. 10 (3), 204-211 (2003).</li><li>Hirt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+extraction+of+polyoma+DNA+from+infected+mouse+cell+cultures.">Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures.</a> J Mol Biol. 26 (2), 365-369 (1967).</li><li>Lee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+repair+of+DNA+damage+in+cell+lines+and+human+peripheral+blood+mononuclear+cells.">Monitoring repair of DNA damage in cell lines and human peripheral blood mononuclear cells.</a> Anal Biochem. 365 (2), 246-259 (2007).</li><li>Sikorsky, J. A., Primerano, D. A., Fenger, T. W., Denvir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+reduces+Taq+DNA+polymerase+fidelity+and+PCR+amplification+efficiency.">DNA damage reduces Taq DNA polymerase fidelity and PCR amplification efficiency.</a> Biochemical and biophysical research communications. 355 (2), 431-437 (2007).</li><li>Wickramaratne, S., Mukherjee, S., Villalta, P. W., Scharer, O. D., Tretyakova, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+sequence-specific+DNA-protein+conjugates+via+a+reductive+amination+strategy.">Synthesis of sequence-specific DNA-protein conjugates via a reductive amination strategy.</a> Bioconjug Chem. 24 (9), 1496-1506 (2013).</li><li>George, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+nucleotide+excision+repair+in+a+helicase-deficient+XPD+mutant+from+intragenic+suppression+by+a+trichothiodystrophy+mutation.">Restoration of nucleotide excision repair in a helicase-deficient XPD mutant from intragenic suppression by a trichothiodystrophy mutation.</a> Mol Cell Biol. 21 (21), 7355-7365 (2001).</li><li>Minko, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Repair+of+DNA-Polypeptide+Cross-Links+by+the+UvrABC+Nuclease.">Initiation of Repair of DNA-Polypeptide Cross-Links by the UvrABC Nuclease.</a> Biochemistry. 44 (8), 3000-3009 (2005).</li><li>Minko, I. G., Zou, Y., Lloyd, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incision+of+DNA-protein+crosslinks+by+UvrABC+nuclease+suggests+a+potential+repair+pathway+involving+nucleotide+excision+repair.">Incision of DNA-protein crosslinks by UvrABC nuclease suggests a potential repair pathway involving nucleotide excision repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, (2002).</li><li>Reardon, J. T., Sancar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+DNA-polypeptide+crosslinks+by+human+excision+nuclease.">Repair of DNA-polypeptide crosslinks by human excision nuclease.</a> PNAS. 103, 4056-4061 (2006).</li><li>Lopez-Mosqueda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPRTN+is+a+mammalian+DNA-binding+metalloprotease+that+resolves+DNA-protein+crosslinks.">SPRTN is a mammalian DNA-binding metalloprotease that resolves DNA-protein crosslinks.</a> eLife. 5, e21491 (2016).</li><li>Stingele, J., Schwarz, M. S., Bloemeke, N., Wolf, P. G., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-dependent+protease+involved+in+DNA-protein+crosslink+repair.">A DNA-dependent protease involved in DNA-protein crosslink repair.</a> Cell. 158 (2), 327-338 (2014).</li><li>Duxin, J. P., Dewar, J. M., Yardimci, H., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+a+DNA-Protein+Crosslink+by+Replication-Coupled+Proteolysis.">Repair of a DNA-Protein Crosslink by Replication-Coupled Proteolysis.</a> Cell. 159 (2), 346-357 (2014).</li><li>Stingele, J., Habermann, B., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-protein+crosslink+repair:+proteases+as+DNA+repair+enzymes.">DNA-protein crosslink repair: proteases as DNA repair enzymes.</a> Trends in Biochemical Sciences. 40 (2), 67-71 (2015).</li><li>Potter, H., Heller, R., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+by+Electroporation.">Transfection by Electroporation.</a> Current protocols in molecular biology. , (2003).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

SSPE-qPCR yöntemi bir tek, tanımlı DPC lezyonu içeren homojen bir nüfus tamiri incelenerek diğer yaklaşımlar çok sayıda avantaj sunar. Bu protein ve protein DNA için bağlanmak için kullanılan kimyasal crosslink türü kimlik kontrol ek olarak, bu kolayca DPC lezyon tanıtıldı sıra içerik işlemek mümkün olduğunu dikkat çekicidir. Biz de lezyon şablonu tanıtan veya iplikçik etkin bir promotor odağı, nehrin aşağısında bir plazmid kodlama DPC onarım etkisi incelemiş bulunuyoruz. Benzer şekilde, DPC onarım HEK293T hücrelere transfected çoğaltma SV40 kökeni içeren bir M13 plazmid kullanarak çoğaltma etkisi soruşturma sürecinde olan. Tahlil burada doğrudan dolaylı olarak tahminleri etkinlik24,25onarmak konak hücre yeniden etkinleştirme gibi diğer stratejileri karşı önlemler DPC onarım nitelendirdi. Buna ek olarak, güçlü, hassas ve nicel sistemidir. DPC kaldırma ölçmek, diğer sistemleri aksine bu tahlil, yalnızca tam onarım olaylar, Yanialgılar, sadece DPC lezyon kaldırılması ancak çift yönlü DNA bütünlüğünü tamamen olmak17geri gerektirir. Bunun nedeni abasic siteleri ve rumuz veya sonu fosfodiester omurgasında tahlil özgün DPC lezyon29olarak etkili bir şekilde engellemek.
Bu rapor belirli bir enzim reaksiyon borhidrür yakalama tarafından ara oluşturuldu, DPC türüne odaklanır iken şu anda yaklaşımlar içeren diğer proteinler ve lezyonlar hangi DPC tamiri çalışma gelişmekte olan protein bağlantı DNA riboz konumu yerine nükleozit Bankası gerçekleşir. İndirgeyici amination kullanarak, sitozin ve guanin bağlı protein ve peptid Glossar oluşturduğunuz temel bir DNA astar30. Bu oligonucleotides homojenliği için saflaştırılmış ve supercoiled plazmid DNA-protein ve DNA-peptid Glossar içeren oluşturmak için kullanılan. Bu tepkiler verimliliğini biraz bu yukarıda ayrıntılı olarak açıklanan oxoguanine glycosylase crosslink yaklaşımın göre azalır iken, onlar yine de başarılı oldun ve vahşi-türü olarak bu yüzeylerde tamiri muayene izin ve nükleotid eksizyon tamir-eksik memeli hücre hatları. Biz de oxoguanine lezyonlar ve via hücresel nükleotid eksizyon tamir makineleri31onarılması için daha önce gösterilen bir sentetik riboz-kolesterol eşlenik tamir çalışmaya SSPE-qPCR tahlil kullandık. Şekil 2 grafik olarak tasvir gibi herhangi bir lezyon SSPE-qPCR tahlil kullanarak blok astar uzantısı Taq polimeraz tarafından prensip olarak ölçülen onarın.
DPC onarım mevcut modelleri önermek daha büyük DPC (> 10 kDa) daha küçük peptid lezyon kaldırma32,33,34önce için proteolitik işleme tabi tutulmaktadır. En olası adaylar için bu proteolizis sorumlu proteasome veya insan hücrelerinde Spartan20,21,35,36,37, adlı özel bir proteaz vardır 38. bu proteaz rolleri daha fazla soruşturma yürütülen SSPE-qPCR tahlil kullanarak. Proteasome inhibitörleri hücreleri DPC içeren yüzeylerde ile transfection önce pretreat için kullanılabilir. Alternatif olarak, Spartalı devirme hücre hatları daha büyük DPC proteolizis rolünü aydınlatmak için hasarlı Plasmid'ler ile transfected.
Crosslink oluşturmak için kullanılan yöntem bakılmaksızın veya DNA lezyon doğanın SSPE-qPCR metodoloji eleştirel homojen DPC-plazmid substrat önemli miktarda oluşturma yeteneği bağlıdır vurgulayarak değer değerdir. Adımlar için bu analiz dahil arıtma kovalent temel, kapalı-daire plazmid herhangi arakladım ortadan kaldırmak için astar uzantısı takip veya doğrusal plazmid molekülleri. Bu kirleticiler gözlenen herhangi bir sonraki DPC onarım nick yönettiği veya iki iplikçikli sonu yönetmen onarım işlemleri nedeniyle değil emin olmak için ortadan kaldırılmalıdır. Supercoiled DNA astar uzantısı tepkiler takip yeterli miktarda elde etmek için başarısızlık Oligonükleotid tek iplikçikli DNA için oranını değiştirerek üstesinden. SSPE-qPCR yöntemi için başka bir önemli adım plazmid protein crosslinking verimliliği olduğunu. Bu çalışmada, verimli, enzimatik reaksiyon kullanılan crosslink oxoguanine glycosylase protein bir 8-oxo-guanin lezyon için için. Alt optimum çapraz reaksiyon eklendi protein miktarı değişen tarafından geliştirilebilir.
Bu raporda açıklanan sonuçlar lipofection alıcı hücreye DPC onarım yüzeylerde tanıtmak dayanıyordu, neden yok, bir temanın, diğer transfections yöntemleri değil istihdam olabilir. Biz ön çalışmalar gerçekleştirilen ve gözlenen bu elektroporasyon39 de kullanılabilir. Ancak, bu deneyim dikkati çekiyor, elektroporasyon transfection verimliliği lipofection ile karşılaştırıldığında azalır ve onarım verileri elde etmek için (en çok 5 µg) taşıyıcı DNA DPC substrat 1,5 µg ek olarak kullanmak gerekli bulduk. Genel olarak, yukarıda açıklanan SSPE-qPCR yöntemi sadece DPC onarım plazmid DNA üzerinde incelemek ve DNA hasarı yanıt içine yeni bir bakış açısı oluşturmak için yenilikçi bir yol sağlar.

Burada açıklanan PCR tabanlı tahlil SSPE-qPCR olarak adlandırılır. Bu yöntemin amacı plazmid DNA onarım eksik ve yetkin memeli hücre içine transfected DPC onarım ölçmek etmektir. Bu tahlil hızlı, nicel, son derece esnek, ve doğrudan önlemler etkinlik. Bu rapor DPC tamiri eğitim için bu yöntem kullan seçeneğine odaklanır iken, sonuçları aşağıda sunulan herhangi bir lezyon engelleyen Taq polimeraz Bu metodoloji kullanarak okudu olabilir o tamiri göstermektedir.
Hangi aracılığıyla DPC memeli hücreleri tamir mekanizmaları bir anlayış kazanmak için bu yöntem geliştirilmesi arkasındaki mantığı olduğunu. DNA hasar diğer türlerinden farklı olarak, DPC kitlesel farklı1,2vardır. Çalışmalar yüzlerce proteinlerin kovalent hücresel DNA3' e bağlı olmak çok sayıda amino asit yan zincirleri vardır, ilke olarak, her protein için DNA ve çapraz olabilir göstermiştir. Buna ek olarak, proteinler de dahil olmak üzere çeşitli kademelerde nükleotit bazlar yanı sıra riboz şeker4,5DNA omurga üzerine için çok sayıda kimyasal ek puan vardır. Bu kimyasal çeşitlilik farklı biyokimyasal yollar farklı DPC onarmak için güvenerek umudu yükseltir. SSPE-qPCR tahlil geliştirilmiştir akılda bu endişe ile yapıldı.
Moleküler Biyoloji, hücresel DPC onarma anlayış kazanmak için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Aşağıda her sahip büyük bir özeti ile güçlü ve zayıf yönlerini geliştirilmiştir önemli yaklaşımlar genel bir bakış sağlar. Bu Özet memeli hücre kültürü sistemlerinde DPC onarım çalışmaları üzerinde duruluyor olsa da, DPC onarım mevcut model önemli katkılar bu konuda açıklanan değil mikrobiyal ve boş hücre sistemleri kullanarak yapılmadığını vurgulayarak değer olduğunu el yazması.
Belki de DPC onarım genetik bir anlayış kazanmak için alınabilecek en kolay strateji DPC6,7neden acentelere maruz vahşi tipi ve mutant hücrelerdeki gözlenen hücre ölümü için ilgili duyarlılık değerlendirmek etmektir. Bu strateji nispeten hızlı, ucuz ve temel hücre kültürü teknikleri gerçekleştirmesini ötesinde özel uzmanlık gerektirmez. Bu avantajları dengelemek aşağıdaki gibi bu yaklaşımın çok sayıda sınırlamalardır. İlk olarak, tahlil doğrudan DNA tamiri ölçmek değil. Bu stratejinin temel çalışma ihracı ilgili DNA onarım proteinler kodlama genlerdeki mutasyonlar DNA bir birikimi sonuçlarında bu Tetikleyicileri programlanmış hücre ölümü zarar varsayılır. Ancak, DNA tamiri protein kodlama genlerdeki mutasyonlar prensipte geliştirmek (azaltmak hücresel duyarlılık xenobiotic indüklenen hücre ölümü veya). İkinci olarak, DPC kaçınılmaz oluşturmak aracıları diğer türleri DNA hasar neden (tek işlemdir 5-aza-2'-deoxycytadine, ama bu aracı da hücresel metiltransferaz düzeyleri8depletes). Sonuç olarak, bu söz konusu aracı gelişmiş hücresel hipersensitivite kusurları tamir interstrand Glossar veya diğer lezyonlar yansıtıyor olabilir akla yatkın. Üçüncü olarak, yukarıda belirtildiği gibi DPC kimyasal Glossar, farklı türde oluşan büyük ölçüde türdeş olmayan bir sınıf içeren farklı protein ortakları temsil eder. Onarım bu lezyonların alt türlerinden bir veya daha fazla belirli bir genetik arka plan değişmiş olabilir iken, bu fark önemli ölçüde ölüme bu Aracısı tarafından indüklenen hücresel aşırı duyarlılık değiştirmek yeterli olmayabilir mümkündür. Bu strateji çekici bir başlangıç noktası temsil ederken Özet olarak, yukarıda özetlenen sınırlamalar DPC onarım Kinetik çalışmaya diğer, daha doğrudan yöntemleri takip önemini vurgulayın.
İlgili yaklaşımlar bir dizi bu hedefe ulaşmak için geliştirilmiştir. Örneğin, müfettişler 'ücretsiz' DNA ve protein bağlı DNA9,10,11arasında ayırt etmek için yöntemler geliştirdik. Bu yaklaşımları kullanarak, kararlı durum düzeyleri DPC veya aşağıdaki maruz kalma bir DPC üreten acentası farklı genetik geçmişleri ile karşılaştırmak mümkündür. En yaygın kullanılan iki strateji DPC içeren DNA nitroselüloz membran bağlama stratejisini veya KCl/SDS yağış12,13kullanarak ücretsiz DNA'dan ayırarak gerektirir. Eski yaklaşımda hücreleri lysed ve nitroselüloz filtreden geçirilen. Nitroselüloz protein bağlar için filtre ücretsiz DNA geçmesine izin DNA, protein bağlantılı korunur. SDS protein ama değil DNA bağlar ve buna ek olarak KCl tarafından çöktürülmüş dayalı aslında bu ikinci stratejisinde protein bağlı DNA ücretsiz DNA'dan ayrılır. Sonuç olarak, ilişkisiz DNA çözüm içinde kalırken protein bağlı DNA çözünmez hale gelir. DPC içeren DNA sonra quantitated (hücreleri başlangıçta metabolik olarak etiketli ise) radiolabeled timidin kullanarak veya bir DNA-seçici floresan boya Höchst 33258 gibi. Bu yöntemler tekrarlanabilir ve küçük birkaç adım gerektirir. Ancak, onlar protein DNA'yı iliştirilmesi kimyasal crosslink, doğa ile ilgili bilgi vermeyin. Ayrıca, bu deneyleri DPC onarmak yanlışlıkla eksik tamir, Yani, alay-e doğru kolayca tuzağa veya, çöktürülmüş iyi niyetli DNA gibi olmayabilir daha küçük DNA-peptid Glossar proteolitik puanlama tarafından aşırı tahmin unutmamak önemlidir onarım.
Kuyruklu yıldız deneyleri hücreleri14oluşumunda DPC görselleştirmek için kullanılabilir. Bu deneylerde DPC varlığı azaltmak sonra İndinavir K. pretreating tarafından geri alınabilir DNA geçiş Bu nedenle, kuyruk uzunluğu DPC oluşumu tahmin etmek için kullanılabilir. Ancak, yukarıda belirtildiği gibi DPC oluşturan uyuşturucu olan kuyruk uzunluğu değiştirmek DNA hasar diğer türleri oluşturun. Bu iletişim kuralı da son derece teknik ve eğitim confocal görüntülemede ve uzmanlık gerektirir.
Kütle spektrometresi DPC onarım Kinetik crosslinking ajanlar15,16,17ile tedavi aşağıdaki çalışma için kullanılabilir. Bu deneyler DPC oluşturmayan ajanlar hücrelerle tedavi ve biotin yakalama veya fenol: kloroform (1:1) çıkarma DPC yalıtır. Kütle spektrometresi sonra çapraz proteinler tanımlamak veya zaman içinde oluşan DPC miktarda quantitate için kullanılabilir. Bu yaklaşımın önemli avantajı üretilen veri doğasıdır. Tam olarak maruz kalma bir xenobiotic, ancak, bu iletişim kuralını takip etmek haline protein türleri pahalı, zaman alıcı ve tespit edilebilir crosslink türüne göre sınırlı katalog mümkündür.
Maizels ve ark. geliştirilen bir hassas 'RADAR' (hızlı yaklaşım DNA adduct kurtarma) tahlil immunodetection DNA-protein quantitate adducts yanı sıra bir ELISA tabanlı RADAR tahlil18,19. Geçici hücrelerde formu ve örnekleri kütle spektroskopisi yeni protein tanımlamak uygun oluşturmak DNA-protein ara ürün bindirme adducts için bu deneyleri özellikle yararlı olur. Bu immunodetection tahlil DNA-protein crosslink yakalamak için antikorlar kullanılabilirliğine dayanır ve bu nedenle, bozulmuş DNA-peptid oluşturan onarım sırasında adducts algılama yeteneğine sahip olmayabilir. Son zamanlarda, belirli bir DPC DNA ikileşmesi ve hangi DPC proteolyzed daha küçük peptidler için onarım20,21sırasında olan bir DNA-bağımlısı metalloprotease Spartalı keşfedilmiştir bağlantılı yolu onarın. Devralınan mutasyonlar bu gen Ruijs-Aalfs Sendromu genomik istikrarsızlık, erken yaşlanma ve karaciğer kanseri22ile karakterize bir hastalık insanlarda, ile ilişkilidir. Fareler genetiği Spartan gen kusurları ile benzer fenotipleri23görüntüler.
Transkripsiyon etkinlik konak hücre reaktivasyonu tanımlanmış lezyonlar transfected plazmid DNA yüzeylerde24,25tarihinde mevcut tamiri çalışma kullanılmaya başlanmıştır. Bu deneylerde, plazmid DPC (veya diğer tip-in DNA lezyonlar) içeren bu luciferase gibi bir muhabir transkripsiyon engellemek, hücrelere transfected. Alınan 24-72 saat sonra sonra ilişkili mısınız DPC ile ışıldama ölçümleri onarın. Ancak, bu dolaylı onarım deneyleri 24 saat sonrası transfection'den önceki onarım olayları tespit aciz ve kısmen onarılan yüzeylerde, RNA polimeraz yan yol ve tam onarım ayırt edemez.
Yukarıda açıklanan yöntemlerin her birinin avantajları vardır ve DPC onarım, geçerli modeli katkıda bulunmuştur. Ancak, SSPE-qPCR tahlil bu diğer yaklaşımlar ile ilgili sınırlamalar birkaç kaçınmanızı sağlar ve sonuç olarak daha özel DPC tamir mekanizmaları içgörü sağlayabilir. Örneğin, SSPE-qPCR tahlil doğrudan siteye özgü DPC sağlam memeli hücrelerde DNA tamiri ölçebilirsiniz. Bu yöntem çok yönlü ve transfection hamster ve insan hücre satırlarını takip onarım sonuçları elde etmek için kullanılır. Plazmid transfection lipofection veya elektroporasyon kültürlü memeli hücre hatlarında kullanılarak gerçekleştirilebilir. Ayrıca tek tanımlanmış DPC tamiri ölçülür ve DNA hasar değil diğer türleri çoğu DPC oluşturan aracılar tarafından indüklenen sağlar. SSPE-qPCR yapmak kolay, ucuz ve hızlı. Bu tahlil kullanarak elde edilen sonuçlar onarım olaylar 2 h sonrası transfection gibi erken tespit etti. Bu yöntemi kullanarak, DPC onarım sonuçları etkileyebilecek değişkenleri hassas ve verimli bir şekilde okudu. Örneğin, transkripsiyon DPC tamir rolü titizlikle değerlendirilmesi henüz. SSPE-qPCR tahlil esneklik nedeniyle DPC crosslinking sitenin bu soruyu çözmek için manipüle edilebilir. Buna ek olarak, çoğaltma DPC taşıyan plazmid içine bir menşe giriş çoğaltma DPC tamir etkisini gidermek için kullanılabilir. Ayrıca, birden çok Glossar plazmid birden çok Glossar karşı tek bir DPC tamiri farklılıkları incelemek için oluşturulabilir. Kromozom DNA'yı kullanarak cevap vermek zor olurdu ama kolayca SSPE-qPCR tahlil kullanarak ele alınması sorular bunlar. Genel olarak, SSPE-qPCR tahlil saf, plazmid DNA bilinen bir konuma bir lezyon içeren mikrogram miktarda gerektirir. Adducts yanı sıra DPC bu assay olarak kullanılabilir, ancak, lezyon Taq polimeraz tarafından uzantısı engelleme yeteneğinin olması gerekir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="657">
	<tbody>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:215px;">8-oxoguanine modified oligo</td>
			<td style="width:157px;">Midland Certified Reagent Company</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">Sequence: 5&#8217;AGGGTTTTCCA (8-oxo-dG)TCACGACGTT 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">T4 PNK</td>
			<td style="width:157px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0201S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Single-stranded M13</td>
			<td style="width:157px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">N4040S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Taq polymerase</td>
			<td style="width:157px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0267L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">ATP, 100mM</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0441</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">dNTP Mix, 10mM each</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0192</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">BSA</td>
			<td style="width:157px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">B9001S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">T4 polymerase</td>
			<td style="width:157px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0203L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">T4 ligase</td>
			<td style="width:157px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">&#946;-agarase</td>
			<td style="width:157px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0392S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Oxoguanine glycosylase 1</td>
			<td style="width:157px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0241S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td style="width:157px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4309155</td>
			<td style="width:167px;">green PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">Primer R</td>
			<td style="width:157px;">UMN Genomic Center</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">5&#8217;CGGCTCGTATGTTGTGTG 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Primer L</td>
			<td style="width:157px;">UMN Genomic Center</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">5&#8217; GCTGCAAGGCGATTAAGT 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Lipofectamine Reagent</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">18324-012</td>
			<td>transfection reagent&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">BspD1</td>
			<td style="width:157px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0557S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NEB buffer 2</td>
			<td style="width:157px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">B7002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">StepOnePlus Real Time PCR System</td>
			<td style="width:157px;">Applied Biosystems</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">UltraPure Buffer-Saturated Phenol</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15513-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Chloroform, reagent ACS, spectro grade</td>
			<td style="width:157px;">ACROS</td>
			<td style="width:119px;">40463-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple, rapid, and quantitative assay to measure repair of dna-protein crosslinks on plasmids transfected into mammalian cells

Bu yöntemin amacı, DNA-protein crosslink (DPC) onarma memeli hücre hatlarında Kinetik incelemek için esnek, hızlı ve nicel bir tekniği sağlamaktır. Genel olarak xenobiotic kaynaklı veya spontan kromozom DPC kaldırma kaldırılması raporlaması yerine, bu tahlil özel bir site içinde bir plazmid DNA substrat adlı tanıttı homojen, kimyasal olarak tanımlı bir lezyon tamiri inceliyor. Önemlisi, bu yaklaşımın radyoaktif malzemelerin kullanımı önler ve pahalı ya da son derece uzman teknolojiye bağımlı değildir. Bunun yerine, standart rekombinant DNA yordamlar ve yaygın olarak kullanılan gerçek zamanlı, nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) araçları kullanır. Kullanılan strateji doğal esnekliğini, çapraz protein boyutunu, hem de kimyasal ile bağlantısını ve hassas DNA doğası göz önüne alındığında sıra bağlam eki sitenin ilgili katkıları bu adrese değiştirilebilir parametreleri DPC onarım genel verimliliği. Bu yöntemi kullanarak, plazmid siteye özgü bir DPC içeren hücrelere transfected ve çeşitli zamanlarda sonrası transfection, düşük moleküler ağırlıklı DNA kurtarıldı. Kurtarılan DNA sonra bir astar plazmid hasarlı strand tamamlayıcı kullanarak strand özgü astar uzantısı (SSPE) tabi tutulur. DPC lezyon blok Taq DNA polimeraz beri un tamir için tamir DNA oranı kantitatif qPCR kullanarak tespit edilebilir. Döngüsü eşik (CT) değerler ilgili hücre hatları çeşitli zaman noktalarda yüzde onarmak hesaplamak için kullanılır. Bu SSPE-qPCR yöntemi kantitatif onarım değerlendirmek için de kullanılabilir Kinetik herhangi bir DNA adduct o blok Taq polimeraz.

Hücresel DPC onarım değerlendirmek için SSPE-qPCR tahlil kullanmak için yeterli bir miktar (µg tutarlar) yüksek kaliteli DPC onarım substrat hazırlanmalıdır. Bu ürün elde etmek için bir 8-oxoguanine kalıntı içeren bir Oligonükleotid tavlanmış tamamlayıcı için tek iplikçikli DNA, genişletilmiş astar ve jel sadece kovalent kapalı dairesel ürün transfections (şekil için kullanıldı emin olmak için saf oldu 1a). bu rapor hangi borhidrür-bindirme kovalent crosslink rekombinant insan oxoguanine glycosylase ve bir riboz birimi arasında bir çift iplikçikli dairesel plazmid molekül üzerinde oluşturmak için kullanılan benzer, ancak yüzeyler üzerinde duruluyor yaklaşımlar kimyasal olarak farklı DPC yüzeyler elde etmek için kullanılabilir. Oxoguanine glycosylase/borhidrür bindirme strateji özellikle çekici çapraz reaksiyon son derece yüksek verimlilik verilir. Şekil 1Badımında gösterildiği gibi KCl/SDS yağış performansı ikiye sindirilmiş bir DPC substrat parçaları seçerek ve kantitatif neredeyse tükenmiş DPC barındıran DNA parçası. Bu sonuçlar plazmid yüzey molekülleri aslında % 100 bir protein crosslink içeren sonuç destekler.
Protokol bölümünde açıklanan SSPE-qPCR tahlil transfection memeli hücrelerinde aşağıdaki DPC onarım yüzdesini hesaplamak için qPCR tarafından oluşturulan CT değerlerini kullanır. Şekil 2 de gösterildiği gibi protein crosslink DPC içeren strand komplementer 'R' astar uzanan üzerinden Taq polimeraz engeller. Bu testin ikinci, kritik özelliği qPCR tahlil gerçekleştirmeden önce SSPE reaksiyonlar (R astar kullanarak) sekiz tur birleşme olduğunu. Hasarsız (ya da onarılan) DNA bu SSPE reaksiyonlar sırasında uzun olabilir iken, aşağı akım 'L' astar için bir bağlama site oluşturma Hasarlı DNA (ya da eksik olarak tamir DNA) uzatılacak değil. Sonuç olarak, SSPE her hasarsız (ya da onarılan) strand tarafından bolluk eight-fold artırır. Bu demektir ki SSPE adım qPCR önce gerçekleştirildikten örnekleri tamir üç birim içinde qPCR (Şekil 2) önce SSPE gerçekleştirilmedi özdeş bir örnek için elde daha düşük olan bir CT değer görüntüler. ΔCT adlandırılan iki tedaviler için gözlenen CT değerlerin üç birimli farklılığı gerçeği yansıtır bu 8 = 23. Bu delta CT değer hücresel DNA onarım etkinlik formülü kullanarak hesaplamak için kullanılabilir: yüzde DNA tamiri = (2ΔCT /23) x 100. Kontrol deneyleri bir delta yaklaşık 3 CT değeri sürekli olarak ne zaman hasarsız substrat plazmid SSPE-qPCR (veri gösterilmez) tabi tutuldu gözlendi doğruladı.
Tablo 1 tasvir edildi DPC içeren plazmid yüzeylerde oluşturulan örnek CT değerleri Çin hamster akciğer fibroblastlar 3 h ve 8 h sonrası transfection (tablo 1A), sıfır örnekleri, zaman yanı sıra yeniden elde etmek Yani, hazırlanan protokol bölümünde açıklandığı gibi ancak hücrelere (tablo1B) transfected değil örnekleri. Tablo Ayrıca ΔCT sağlar ve yüzde değerleri onarmak (formül kullanılarak hesaplanan 2ΔCT/23 x 100) bu örnekleri elde. Tablo 1A' gösterildiği gibi örnekleri hesaplanan yüzde onarım 3 h hasat ve 8 h sonrası transfection % 66 ve % 93, sırasıyla. Bu değerler daha sonra bu belirlemek için 0 h örnek analizinden elde edilen yüzde onarmak düşülen. Tablo 1B verimli crosslinking yapıldı veya transfection önce elde değil iki farklı 0 h örnek CT değerlerini gösteriyor. Verimli bir şekilde kötü çapraz örnek bir delta 2, 5 CT değer sonuçlandı, ancak çapraz örnek bir delta CT değeri 0,8 sonuçlandı. Bugüne kadar bu tam 0.8 arka plan sinyalinin kaynağını belirlemek mümkün olmamıştır verimli bir şekilde çapraz 0 h örnek. Bu arka plan ya da spontan DPC kaldırma düşük düzeyde yansıtır veya olduğunu nedeniyle düşük düzeyde Taq polimeraz 'bypass' sentez DPC lezyon üzerinden mümkün değildir: kapsamlı deneme gerçekleştirilen yüksek oranda saflaştırılmış tek iplikçikli M13 substrat sürekli bir delta CT değeri yaklaşık 0.8 vermiştir, Yani, bu temelde aynı 'arka plan' uzantısı DPC içeren yüzeylerde gördün. Sonuç olarak, büyük olasılıkla 'L' astar eklendiğinde sonradan güçlendirilmiş ürün az miktarda nesil sonuçlarında ve qPCR gerçekleştirilen SSPE sırasında 'R' astar mis astar küçük bir ölçüde olduğunu. Çabaları bu arka plan PCR koşulları manipüle ederek ortadan kaldırmak için var, bugüne kadar bu kusur düzeltmek için başarısız oldu. Ancak, yukarıda açıklanan çıkarma stratejisi doğru tahmin DPC onarım faaliyet izin verir. Değer protein plazmid üzerine verimsiz o polietilenin belirterek bir yükseltilmiş arka plan değeri neden olacaktır. Bu tablo 1B nerede yetersiz protein-DNA crosslinking zaman 0 için daha yüksek bir delta CT değer sonuçlandı sağlanan örnek veri olarak tasvir edilir. Bu nedenle, denetim deneyler kaçınılmaz transfections ve yüzeylerde eşik düzeyi atılan 0,8 üzerinde yükseltilmiş delta CT değerlerle başlatmadan önce gerçekleştirilir. QPCR protokolünde belirtildiği gibi her örnek 3 Kuyu pipetting tutarlılık sağlamak için ayrılmıştır. Bu çoğaltır sonra o örnek için CT değer elde etmek için ortalama. Sapma daha fazla ± 0,1 veri kümesinden ortadan kalkar çoğaltır. Tüm üç çoğaltır ± 0,1 birbirinden fazla saparsanız, tutarlı değerler elde edilir kadar SSPE-qPCR tahlil redone. Deneyimi en az 3 bağımsız transfections sonra çeşitli parametreler DPC onarım verimlilik üzerinde etkisi belirlemek için istatistiksel analize tabi güvenilir ortalama değerler elde etmek için gerçekleştirilmesi gereken gösterir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57413/57413fig1.jpg"> Şekil 1. DPC içeren plazmid nesil. (A) bir Oligonükleotid içeren bir 8-oxo-guanin kalıntı (kırmızı) tek iplikçikli DNA'yı (kalın siyah Daire) komplementer ve çift iplikçikli plazmid (Kesikli çizgiyle gösterilen astar uzantısı ürün) oluşturmak için genişletilmiş. Etidyum bromür, Elektroforez supercoiled DNA (kırmızı kutu) karşılık gelen grup düşük-melt özel jel eksize ve β-agarase ile sindirilir. Şerit: (1) molekül ağırlığı marker, (2) tek iplikçikli DNA'sı, (3) çift iplikçikli DNA, (4) astar genişletilmiş örnek. (B) Oxoguanine glycosylase (kısaltılmış hOGG1, turuncu bir daire tasvir) etmek için sodyum cyanoborohydride ile 8-oxo-guanin kalıntı olduğunu ve elde edilen DPC substrat sindirilmiş bir 2.800 baz çifti, ücretsiz DNA parçası ve bir 4400 oluşturmak için baz çifti parçası için protein bağlı. SDS biri KCl ile tedavi ve tortu DPC içeren DNA (bir portakal Pelet tasvir) için centrifuged iki bölüm sonra ayrılmıştır örnek eklenir. (Mavi sıvı santrifüj tüpü olarak tasvir) bu ikinci örnek ve örnek için KCl maruz bırakılmamalıdır süpernatant tabi Jel Elektroforez için. Şerit: (1) molekül ağırlığı marker, (2) -KCl, (3) + KCl. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57413/57413fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57413/57413fig2.jpg"> Şekil 2: SSPE-qPCR ile bozuk plazmid Quantification. Plazmid DNA denatüre ve hasarlı iplikçik (R) tamamlayıcı bir astar komplementer ve genişletilmiş. Bu işlem 8 döngüleri toplam için yinelenir. Zarar görmüş bir substrat (üst), ile birlikte Taq polimeraz DPC lezyon tarafından engellendi ve tam uzunlukta ürün iplikçikleri üretmek değildir. Buna ek olarak, onarılan substrat (alt) ile tam uzunlukta ürün iplikçikleri astar L. için bağlama site içeren Taq polimeraz üretecek 8 döngüleri sonra astar L eklenir ve qPCR kullanarak döngüsü eşik değerler belirlenir. Örnek amplifikasyon sonuçları hasarlı ve zarar görmemiş yüzeyler için sağ tarafta astar uzantısı qPCR ve qPCR önce genişletilmiş astar değildi DNA temsil eden mavi önce uygulandı DNA temsil eden kırmızı çizgi ile gösterilmiştir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57413/57413fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Tablo 1A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Zaman</td>
			<td rowspan="2">-Astar uzantısı</td>
			<td rowspan="2">+ Primer uzantısı</td>
			<td rowspan="2">Δ CT</td>
			<td>Yüzde onarım</td>
		</tr>
<tr>
<td>(2ΔCT/23x 100)</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 h</td>
			<td>23,5</td>
			<td>21,1</td>
			<td>2.4</td>
			<td>66</td>
		</tr>
<tr>
<td>8 h</td>
			<td>29,4</td>
			<td>26,5</td>
			<td>2,9</td>
			<td>93</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tablo 1B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Zaman</td>
			<td rowspan="2">-Astar uzantısı</td>
			<td rowspan="2">+ Primer uzantısı</td>
			<td rowspan="2">Δ CT</td>
			<td>Yüzde arka plan</td>
		</tr>
<tr>
<td>(2ΔCT/23x 100)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 h</td>
			<td>15,4 inç</td>
			<td>14,6</td>
			<td>0.8</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 h</td>
			<td>15,4 inç</td>
			<td>12,9</td>
			<td>2.5</td>
			<td>71</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: yüzde onarmak SSPE-qPCR oluşturulan CT değerleri kullanarak hesaplama. DPC içeren yüzey tamiri(a)transfected V79 Çince hamster akciğer fibroblastlar 3 h ve 8 h sonrası transfection. (B) SSPE-qPCR 0 h örnekleri hücrelere transfected değil. Glycosylase bir örnek DNA ve oxoguanine arasındaki çapraz reaksiyon verimliliğini oldu (Bu örnek vermiştir bir düşük delta CT değer) yüksek ise diğer örnek protein crosslinking verimliliği düşük (nispeten yüksek bir delta Bu örnek vermiştir CT değeri). Ayrıntılar için Temsilcisi sonuç metnine bakın.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells at JoVE.com

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

Ölçü birimi üzerinde plazmid DNA-protein Glossar tamiri için basit, hızlı ve nicel tahlil memeli hücre içine Transfected

Bu iletişim kuralı plazmid DNA üzerinde tanımlanmış DNA-protein Glossar tamiri ölçmek için hedeftir. Lesioned plazmid alıcı memeli hücre satırları ve düşük molekül ağırlığı birden çok kez puan sonrası transfection hasat içine transfected. DNA onarım Kinetik sayısal qPCR tarafından takip strand özgü astar uzantısı kullanma.

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

Araçlar Helix bozan, site-spesifik DNA içi çapraz bağlantılar işlenmesi Mimari Protein HMGB1 Rolü Eğitim için

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

Hibridizasyon uyarlaması yakalama kromatin ilişkili proteinlerin proteomik memeli hücreleri için

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

Düzenleyici elemanlarının ölçü Kromatin erişilebilirlik memeli hücrelerinde formaldehit destekli izolasyon

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Yineleme kümesi yöntemi: Bir yüksek-den geçerek yaklaşım kantitatif ölçü Caenorhabditis elegans ömrü

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetik Mühendisliği hücreleri Dictyostelium discoideum alan seçimi ve bakteri büyüme

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

Mammalin hücrelerinde Micrococcal Nüklenleri kullanarak kromatin Immünopmamitasyon tahlil

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Kütle spektrometresi tabanlı proteomik analizleri roman proteinler açıklayacak OpenProt veritabanı kullanarak kanonik olmayan açık okuma çerçevesi tercüme

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...