Name: identification of dopamine d1-alpha receptor within rodent nucleus accumbens by an innovative rna in situ detection technology
Uploaded: 2018-03-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology at JoVE.com

De huidige werken werden ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies, HD043680, MH106392, DA013137 en NS100624. Gedeeltelijke Fonds werd verstrekt door een subsidie van de opleiding NIH T32 in biomedische-Behavioral science.

Het experimentele protocol goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comité (IACUC) aan de Universiteit van South Carolina (federale assurance nummer: A3049-01).
1. bereiding van verse, bevroren hersenen secties
<ol><li>Gebruik de F344/N rat stam: drie ratten van elk geslacht, 13 maanden van leeftijd, lichaamsgewicht ongeveer 320 g.</li>
	<li>Pas de Sevofluraan tot 5% (overdosis Sevofluraan). Sevofluraan blootstelling na ademhaling stopt voor een extra minuten voortgezet.</li>
	<li>Decapit...

<ol>
	<li>Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+dopamine+D1+receptor+in+schizophrenia:+insights+for+cognitive+dysfunction.">Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction.</a> Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).</li><li>Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology,+signaling,+and+pharmacology+of+dopamine+receptors.">The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors.</a> Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).</li><li>Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supranormal+stimulation+of+D1+dopamine+receptors+in+the+rodent+prefrontal+cortex+impairs+spatial+working+memory+performance.">Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance.</a> J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).</li><li>Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+dopamine+receptor+subtypes+in+the+medial+prefrontal+cortex+of+the+rat+regulate+set-shifting.">Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting.</a> Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).</li><li>Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+dopamine+therapeutics+for+cognitive+deficits+in+schizophrenia.">Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia.</a> Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).</li><li>Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prepulse+inhibition+and+latent+inhibition:+the+role+of+dopamine+in+the+medial+prefrontal+cortex.">Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex.</a> Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).</li><li>Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+D1+dopamine+signaling+is+necessary+for+temporal+expectation+during+reaction+time+performance.">Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance.</a> Neuroscience. 255, 246-254 (2013).</li><li>Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+Neurotransmission+in+the+Nucleus+Accumbens+Modulates+Social+Play+Behavior+in+Rats.">Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).</li><li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET.">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).</li><li>Abi-Dargham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+dopamine+D1+receptors+and+working+memory+in+schizophrenia.">Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia.</a> J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).</li><li>Shinohara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D1+receptor+subtype+mediates+acute+stress-induced+dendritic+growth+in+excitatory+neurons+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+contributes+to+suppression+of+stress+susceptibility+in+mice.">Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice.</a> Mol Psychiatry. 19, (2017).</li><li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET.">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385, 634-636 (1997).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The rat brain in stereotaxic coordinates. , (2014).</li></ol>

In dit protocol beschrijven we een nieuwe techniek van in situ hybridisatie voor hersenen vers bevroren plakjes Drd1α receptor expressie in de nucleus accumbens (NAc) en tyrosine hydroxylase (TH) expressie in de substantia nigra (SNR)-regio te evalueren. We bieden ook methoden van data-analyse voor kleuring kruisbare: "discrete stip" of "clusters".
De kritische stappen voor een succesvolle multiplex fluorescentie RNA in situ hybridisatie assay zijn opgenomen. Zodra het ontho...

Dysfunctie van het systeem van striatale dopamine is betrokken bij de progressie van klinische symptomen waargenomen in meerdere Neurocognitieve ziekten. Dopamine D1 receptoren zijn aanwezig in de prefrontale cortex (PFC) en striatale gebieden van de hersenen en sterk beïnvloeden van cognitieve processen1, waaronder het werken geheugen, temporal processing en locomotief gedrag2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. vorige studies toegelicht dat wijzigingen van dopamine D1 receptoren geassocieerd met de progressie van aandacht tekort-hyperactivity disorder (ADHD)8, de neurocognitieve symptomen bij schizofrenie9, werden 10 en stress gevoeligheid11. In het bijzonder bij schizofrenie, positron emissie tomografie (PET) onderzoeken aangegeven dat het bindend vermogen van dopamine D1 receptoren in de prefrontale cortices was sterk gerelateerd aan cognitieve tekorten en de aanwezigheid van negatieve symptomen11. De dendritische groei van de excitatory neuronen in de prefrontale cortex, gereguleerd door de dopamine D1-receptor vermindert stress gevoeligheid. Bovendien zou het knockdown van D1 receptor in mediale prefrontale corticale (mPFC) neuronen vergroten de sociale nederlaag sociale vermijden stress-geïnduceerde12.
Hier introduceren wij een nieuwe techniek voor RNA in situ hybridisatie te visualiseren van afzonderlijke RNA-moleculen in een cel met vers bevroren weefselmonsters. De huidige techniek heeft meerdere voordelen ten opzichte van de methoden die bestaan binnen de huidige literatuur. Ten eerste, de huidige procedure behoudt de ruimtelijke en morfologische context van het weefsel en werd uitgevoerd op vers bevroren weefselsteekproeven zodat andere procedures vereisen verse, niet-embedded weefsels kunnen worden gecombineerd met de huidige methoden. Soortgelijke procedures in formaline-vaste en paraffine-ingebedde weefsels hebben geïllustreerd dat één transcriptie resolutie kan worden bereikt gebruikend een RNA in situ hybridisatie techniek13. Opsporing van RNA op het niveau van één transcriptie biedt superieure gevoeligheid voor laag kopie numerieke uitdrukking, evenals de mogelijkheid om te vergelijken van genexpressie op het niveau van afzonderlijke cellen die niet kan worden bereikt door andere methoden voor de detectie van nucleic zuur, zoals polymerase kettingreactie (PCR) technieken. Daarnaast onderhoudt de huidige methode beelden met een hoge signaal-/ ruisverhouding via zeer specifieke sondes van RNA die gekruist doel RNA uitgeschreven, en achter elkaar gebonden met een cascade van versterking signaalmoleculen in de opsporing systeem. Tot slot, de huidige technologie biedt de mogelijkheid te evalueren meerdere biologische systemen met haar doelgroepen gerichte merkgebonden sondes, in plaats van het beperken van ons onderzoek naar slechts één klasse van systeem-gerelateerde gegevensmarkeringen bijvoorbeeld eiwit detectie door Immunohistochemistry methoden.
In onze studie gebruikten we deze roman RNA in situ hybridisatie te evalueren van de Drd1α receptor expressie in de nucleus accumbens (NAc) en tyrosine hydroxylase (TH) expressie in de substantia nigra (SNR) voor zowel mannelijke als vrouwelijke F344/N rats. De innovatieve RNA in situ hybridisatie konden we mechanismen beïnvloeden zowel opname van de DA en DA release gelijktijdig, verbetering van ons inzicht in de complexiteit van het systeem van striatale DA onderzoeken. Hier beschrijven we de procedure voor hersenen vers bevroren plakjes en voorzien in methoden van data-analyse voor kleuring kruisbare: "discrete stip" of "clusters".

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">HybEZ Oven system</td>
			<td style="width:205px;">Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td style="width:135px;">310010</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">RNAscope Probe - Rn-Drd1a</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>317031</td>
			<td>Color channel 1, Green</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">RNAscope Probe - Rn-Th-C2</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>314651-C2</td>
			<td>Color channel 2, Orange</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>320850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Vector Laboratory</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-154%&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">4% paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Sevoflurane</td>
			<td>Merritt Veterinary Supply</td>
			<td>347075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Tissue-Tek vertical 24 slide rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9837976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Tissue-Tek staining dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0731403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Precision General Purpose Baths</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TSGP28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">Pretreatment 4</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>320850</td>
			<td>parts of kits</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">ProLong Gold anti-fade reagent</td>
			<td style="width:205px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">P36930</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">Amp 1-FL</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>320850</td>
			<td>parts of kits</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">Amp 2-FL</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>320850</td>
			<td>parts of kits</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">Amp 3-FL</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>320850</td>
			<td>parts of kits</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">Amp 4-FL-Alt A</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>320850</td>
			<td>parts of kits</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">EZ-C1 software package</td>
			<td style="width:205px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>version 3.81b</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">SAS/STAT Software</td>
			<td style="width:205px;">SAS Institute, Inc.,</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>version 9.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of dopamine d1-alpha receptor within rodent nucleus accumbens by an innovative rna in situ detection technology

In het centrale zenuwstelsel is de receptor subtype D1-alpha (Drd1α) de meest voorkomende dopamine (DA) receptor, die een essentiële rol speelt bij het reguleren van de neuronale groei en ontwikkeling. De mechanismen die ten grondslag liggen aan de Drd1α receptor afwijkingen bemiddelen gedrags reacties en modulerende werking geheugenfunctie zijn echter nog onduidelijk. Met behulp van een roman RNA in situ hybridisatie assay, de huidige studie is gebleken dat dopamine Drd1α receptor en tyrosine hydroxylase (TH) RNA-expressie aan vanaf DA-gerelateerde circuits in de nucleus accumbens (NAc) gebied en de substantia nigra regio (SNR), respectievelijk. Drd1α expressie in de nar toont een "discrete stip" kleuring patroon. Duidelijk seks verschillen in Drd1α expressie werden waargenomen. In tegenstelling, bevat TH een "geclusterde" kleuring patroon. Met betrekking tot TH expressie, maar dan weergegeven vrouwelijke ratten een hogere signaal-expressie per cel ten opzichte van mannelijke dieren. De hier gepresenteerde methoden bieden een roman in situ hybridisatie techniek voor het onderzoeken van veranderingen in dopamine systeem dysfunctie tijdens de progressie van ziekten van het centrale zenuwstelsel.

De huidige studie waargenomen een 'discrete dots' kleuring patroon voor RNA expressie in de dopamine D1-alpha receptoren (Drd1α) van de nar in F344/N ratten (figuur 1A). Individuele fluorescentie signalen werden gemakkelijk geïdentificeerd en kunnen worden gezien als één 'dots', die elk vertegenwoordigt een enkele RNA transcriptie binnen de cel. Voor afbeeldingen van de nar die de 'discrete dots weergeven' kleuring van de patroon, beoordeeld wij het dynam...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology at JoVE.com

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identificatie van Dopamine D1-Alpha Receptor binnen knaagdier Nucleus Accumbens door een innovatieve RNA In Situ de technologie van de opsporing

Identificatie van dopamine D1-alpha receptor in de nucleus accumbens is van cruciaal belang voor de verduidelijking van de D1-receptor dysfunctie tijdens een ziekte van het centrale zenuwstelsel. Wij uitgevoerd een roman RNA in situ hybridisatie assay om te visualiseren single molecules van RNA in een specifieke hersenen gebied.

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

Gelijktijdig fMRI en elektrofysiologie bij knaagdieren Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

VisioTracker, een innovatieve geautomatiseerde benadering van oculomotorische Analyse

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Directe Intraventriculaire levering van drugs aan het knaagdier centrale zenuwstelsel

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Detectie van het genoom en de transcripties van een persistente DNA Virus in neuronale weefsels door Fluorescent In situ Hybridisatie Gecombineerd met Immunokleuring

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenetische Stimulatie van de knaagdieren centrale zenuwstelsel

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Detectie van Axonally Gelokaliseerde mRNA in Brain secties met behulp van High-Resolution<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Interfacing 3D Engineered neuronale culturen op micro-elektrode arrays: een innovatieve<em&gt; In Vitro</em&gt; Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

Betrouwbare identificatie van de levens- dopaminerge neuronen in de middenhersenen Cultures Met behulp van RNA Sequencing en TH-promotor-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Lokalisatie van Receptorgenen van Reukstof in Locustantenne door RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

Beoordeling van Dopaminerge homeostase in muizen door gebruik van High-performance Liquid Chromatography analyse en Synaptosomal Dopamine opname

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) ...