Name: identification of dopamine d1-alpha receptor within rodent nucleus accumbens by an innovative rna in situ detection technology
Uploaded: 2018-03-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology at JoVE.com

Les présents travaux appuyés par les instituts nationaux de santé (NIH) subventions HD043680, MH106392, DA013137 et NS100624. Financement partiel est fourni par une bourse de formation de NIH T32 en science biomédicale-comportementale.

Le protocole expérimental a été approuvé par l’utilisation Comité (IACUC) à la University of South Carolina et animalier (numéro d’assurance fédérale : A3049-01).
1. préparation des Sections de cerveau congelé frais
<ol><li>Utiliser la souche de rat F344/N : trois rats de chaque sexe, 13 mois, poids environ 320 g.</li>
	<li>Ajuster la concentration de sévoflurane à 5 % (surdose de sévoflurane). Continuer l’exposition sévoflurane après la respiration s’arrête pendan...

<ol>
	<li>Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+dopamine+D1+receptor+in+schizophrenia:+insights+for+cognitive+dysfunction.">Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction.</a> Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).</li><li>Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology,+signaling,+and+pharmacology+of+dopamine+receptors.">The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors.</a> Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).</li><li>Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supranormal+stimulation+of+D1+dopamine+receptors+in+the+rodent+prefrontal+cortex+impairs+spatial+working+memory+performance.">Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance.</a> J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).</li><li>Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+dopamine+receptor+subtypes+in+the+medial+prefrontal+cortex+of+the+rat+regulate+set-shifting.">Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting.</a> Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).</li><li>Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+dopamine+therapeutics+for+cognitive+deficits+in+schizophrenia.">Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia.</a> Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).</li><li>Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prepulse+inhibition+and+latent+inhibition:+the+role+of+dopamine+in+the+medial+prefrontal+cortex.">Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex.</a> Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).</li><li>Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+D1+dopamine+signaling+is+necessary+for+temporal+expectation+during+reaction+time+performance.">Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance.</a> Neuroscience. 255, 246-254 (2013).</li><li>Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+Neurotransmission+in+the+Nucleus+Accumbens+Modulates+Social+Play+Behavior+in+Rats.">Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).</li><li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET.">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).</li><li>Abi-Dargham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+dopamine+D1+receptors+and+working+memory+in+schizophrenia.">Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia.</a> J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).</li><li>Shinohara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D1+receptor+subtype+mediates+acute+stress-induced+dendritic+growth+in+excitatory+neurons+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+contributes+to+suppression+of+stress+susceptibility+in+mice.">Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice.</a> Mol Psychiatry. 19, (2017).</li><li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET.">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385, 634-636 (1997).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The rat brain in stereotaxic coordinates. , (2014).</li></ol>

Dans le présent protocole, les auteurs décrivent une nouvelle technique d’hybridation in situ pour des tranches de cerveau frais congelé afin d’évaluer l’expression des récepteurs Drd1α dans le noyau accumbens (NAc) et expression de tyrosine hydroxylase (TH) dans la région de la substantia nigra (SNR). Nous fournissons également des méthodes d’analyse de données pour différentes colorations : « point discret » ou « clusters ».
Les étapes essentielles pour ...

Dysfonctionnement du système de dopamine striatale est impliqué dans la progression des symptômes cliniques observés dans plusieurs maladies neurocognitives. Les récepteurs dopaminergiques D1 sont présents dans le cortex préfrontal (PFC) et les régions striatum du cerveau et influencent fortement les processus cognitifs1, y compris le travail de mémoire, traitement temporel et comportement locomotive2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. études antérieures élucidé que changements de récepteurs de la dopamine D1 étaient associés à la progression de l’attention-hyperactivité trouble de (l’attention THADA)8, les symptômes neurocognitifs dans la schizophrénie9, stress et 10 susceptibilité11. Plus précisément, dans la schizophrénie, par émission de positrons (TEP) études ont indiqué que la capacité de liaison des récepteurs de la dopamine D1 dans le cortex préfrontal était fortement liée à des déficits cognitifs et la présence de symptômes négatifs11. La croissance dendritique des neurones excitateurs dans le cortex préfrontal, réglementés par les récepteurs de la dopamine D1 atténue la sensibilité aux stress. En outre, la précipitation du récepteur D1 dans les neurones du cortex préfrontal médial (MFPC) pourrait améliorer la défaite sociale induite par le stress social évitement12.
Ici, nous présentons une nouvelle technique d’hybridation in situ RNA de visualiser des molécules d’ARN seul dans une cellule avec des échantillons de tissus frais congelés. La technique actuelle possède plusieurs avantages par rapport aux méthodes qui existent au sein de la littérature actuelle. Tout d’abord, la procédure actuelle conserve le contexte spatial et morphologique du tissu et a été réalisée sur des échantillons de tissus frais congelés afin que les autres procédures nécessitant fraîches, tissus non incorporé peuvent être combinés avec les méthodes actuelles. Des procédures similaires dans les tissus fixés au formol et inclus en paraffine ont illustré que résolution unique de transcription peut être réalisée en utilisant un RNA in situ hybridation technique13. Détection de l’ARN au niveau de la transcription unique offre une sensibilité supérieure à l’expression de numéro de faibles copies ainsi que la possibilité de comparer l’expression des gènes au niveau des cellules individuelles ne peuvent être réalisées par d’autres méthodes de détection des acides nucléiques, comme les techniques de polymérase de réaction en chaîne (PCR). En outre, la méthode actuelle tient à jour des images avec un rapport signal sur bruit élevé grâce à des sondes d’ARN très spécifiques qui sont hybridées aux transcriptions d’ARN cible unique et séquentiellement liés avec une cascade de molécules d’amplification de signal dans la détection système. Enfin, la technologie actuelle offre la possibilité d’évaluer les systèmes biologiques multiples avec ses sondes propriétaires spécifique à la cible, plutôt que de limiter notre enquête à la seule catégorie des marqueurs liés au système telles que la détection de la protéine par Méthodes d’immunohistochimie.
Dans notre étude, nous avons utilisé ce roman RNA in situ hybridation afin d’évaluer l’expression des récepteurs Drd1α dans le noyau accumbens (NAc) et l’expression de la tyrosine hydroxylase (TH) dans la substantia nigra (SNR) de rats F344/N mâles et femelles. L’innovants RNA in situ hybridation nous a permis d’étudier les mécanismes influencer l’absorption DA et DA communiqué simultanément, en améliorant notre compréhension des complexités du système striatal DA. Nous décrivons ici la procédure pour les tranches de cerveau frais-congelé et proposent des méthodes d’analyse de données pour différentes colorations : « point discret » ou « clusters ».

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">HybEZ Oven system</td>
			<td style="width:205px;">Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td style="width:135px;">310010</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">RNAscope Probe - Rn-Drd1a</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>317031</td>
			<td>Color channel 1, Green</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">RNAscope Probe - Rn-Th-C2</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>314651-C2</td>
			<td>Color channel 2, Orange</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>320850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Vector Laboratory</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-154%&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">4% paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Sevoflurane</td>
			<td>Merritt Veterinary Supply</td>
			<td>347075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Tissue-Tek vertical 24 slide rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9837976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Tissue-Tek staining dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0731403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Precision General Purpose Baths</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TSGP28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">Pretreatment 4</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>320850</td>
			<td>parts of kits</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">ProLong Gold anti-fade reagent</td>
			<td style="width:205px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">P36930</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">Amp 1-FL</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>320850</td>
			<td>parts of kits</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">Amp 2-FL</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>320850</td>
			<td>parts of kits</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">Amp 3-FL</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>320850</td>
			<td>parts of kits</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">Amp 4-FL-Alt A</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>320850</td>
			<td>parts of kits</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">EZ-C1 software package</td>
			<td style="width:205px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>version 3.81b</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">SAS/STAT Software</td>
			<td style="width:205px;">SAS Institute, Inc.,</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>version 9.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of dopamine d1-alpha receptor within rodent nucleus accumbens by an innovative rna in situ detection technology

Dans le système nerveux central, les récepteurs de sous-type D1-alpha (Drd1α) sont le plus abondant récepteur de dopamine (DA), qui joue un rôle essentiel dans la régulation du développement et croissance neuronale. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent les anomalies du récepteur Drd1α interceptent les réponses comportementales et moduler la fonction de mémoire de travail sont encore peu claires. Grâce à un roman RNA essai in situ hybridation avec, la présente étude a identifié dopamine Drd1α du récepteur et la tyrosine hydroxylase (TH) RNA expression de circuits axés sur la DA dans le noyau accumbens (NAc) et région de substantia nigra (SNR), respectivement. Drd1α expression dans le CNA présente « point discret » modèle de marquage. Différences de sexe clair dans l’expression de Drd1α ont été observés. En revanche, TH montre un patron de coloration « groupée ». Au sujet de l’ÉNIÈME expression, rates affichent une expression plus élevée de signal par cellule par rapport à des animaux mâles. Les méthodes présentées ici fournissent une technique d’hybridation roman sur place pour enquêter sur les changements dans le dysfonctionnement du système dopamine au cours de la progression de la maladie du système nerveux central.

La présente étude a observé une « points discrets » modèle pour l’expression de RNA dans les récepteurs de la dopamine D1-alpha (Drd1α) de marquage du CNA rats F344/N (Figure 1 a). Signaux de fluorescence individuels ont été facilement identifiés et peuvent être considérées comme simples « points », qui représentent chacune un seul transcrit dans la cellule. Pour les images du CNA qui affichent les « points discrets » modèle de mar...

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Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification de la Dopamine D1-Alpha du récepteur au sein de rongeurs noyau Accumbens par une ARN innovantes In Situ la technologie de détection

Identification du récepteur D1-alpha de dopamine dans le noyau accumbens est critique pour clarifier le dysfonctionnement du récepteur D1 au cours d’une maladie du système nerveux central. Nous avons effectué un roman RNA essai in situ hybridation avec pour visualiser des molécules d’ARN unique dans une zone spécifiques du cerveau.

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

Research

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Neuroscience

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

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