Name: assembly and purification of prototype foamy virus intasomes
Uploaded: 2018-03-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes at JoVE.com

أيد هذا العمل AI099854 المعاهد الوطنية للصحة، و AI126742 إلى المفتاح.

1-الصلب من فدنا
<ol><li>الجمع بين 1 X عشرة المخزن المؤقت (الأسهم عشرة X 10: 100 مم تريس-HCl، pH 8.0، 1 م كلوريد الصوديوم، يدتا 10 ملم)، 10 ميكرومتر اليغو 1 (أتتجتكاتجاتتتجتاتاتجاجتجكجكككجاكاج 3 '5'، 100 ميكرومتر الأسهم)، و 10 ميكرون 2 اليغو (كتجتكججكجككاكتكاتاتاكاااتككاتجاكا 3 '5'، 100 ميكرومتر الأسهم) في وحدة تخز...

<ol>
	<li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Retroviruses. , (1997).</li><li>Valkov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+characterization+of+the+integrase+from+the+prototype+foamy+virus.">Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).</li><li>Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasome+assembly+and+inhibition+of+DNA+strand+transfer.">Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer.</a> Nature. 464 (7286), 232-236 (2010).</li><li>Li, M., Lin, S., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+domains+of+integrase+within+retroviral+intasomes+are+dispensible+for+catalysis+of+DNA+integration.">Outer domains of integrase within retroviral intasomes are dispensible for catalysis of DNA integration.</a> Protein Sci. 25 (2), 472-478 (2016).</li><li>Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+conformations+of+prototype+foamy+virus+integrase+and+its+stable+synaptic+complex+with+U5+viral+DNA.">Solution conformations of prototype foamy virus integrase and its stable synaptic complex with U5 viral DNA.</a> Structure. 20 (11), 1918-1928 (2012).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nat Commun. 7, 11409 (2016).</li><li>Lopez, M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase.">Detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase.">Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).</li><li>Poirier, M. G., Bussiek, M., Langowski, J., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+access+to+DNA+target+sites+in+folded+chromatin+fibers.">Spontaneous access to DNA target sites in folded chromatin fibers.</a> J Mol Biol. 379 (4), 772-786 (2008).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li><li>Ballandras-Colas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+reveals+a+novel+octameric+integrase+structure+for+betaretroviral+intasome+function.">Cryo-EM reveals a novel octameric integrase structure for betaretroviral intasome function.</a> Nature. 530 (7590), 358-361 (2016).</li><li>Ballandras-Colas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+supramolecular+assembly+mediates+lentiviral+DNA+integration.">A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration.</a> Science. 355 (6320), 93-95 (2017).</li><li>Passos, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structures+and+atomic+model+of+the+HIV-1+strand+transfer+complex+intasome.">Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome.</a> Science. 355 (6320), 89-92 (2017).</li><li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+Rous+sarcoma+virus+intasome.">Crystal structure of the Rous sarcoma virus intasome.</a> Nature. 530 (7590), 362-366 (2016).</li><li>Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+retroviral+integration+from+X-ray+structures+of+its+key+intermediates.">The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates.</a> Nature. 468 (7321), 326-329 (2010).</li><li>Maskell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+retroviral+integration+into+nucleosomes.">Structural basis for retroviral integration into nucleosomes.</a> Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).</li></ol>

وظائف النسخ العكسي تشكل مولتيميريك معقدة مع الحمض النووي الفيروسي لتنفيذ التكامل ومواصلة دورة الحياة الفيروسية. قد يكون العدد في مونومرات كل إينتاسومي تيتراميرس أو أوكتاميرس، أو ربما أعلى ترتيب مولتيميرس11،12،،من1314. إ...

يتم دمج الجينوم الفيروسي في جينوم مضيف خطوة إلزامية في دورة الحياة لجميع الفيروسات القهقرية1. إينتيجراسي الإنزيم الفيروسي (في) يحفز التساهمية ضم كل نهاية لجينوم الحمض النووي الفيروسي إلى المضيف الحمض النووي. أثناء عدوى خلوية، في هو جزء من مجمع ما قبل الاندماج الذي يتوسط التكامل. في المؤتلف الرصاصية مع مزدوجة ليغومرات الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل محاكاة نهايات الحمض النووي الفيروسي يمكن أيضا تنفيذ الاندماج في الحمض النووي المستهدف في المختبر2. مشتركة تكامل فحص في المختبر يستخدم بلازميد سوبيركويليد كهدف الحمض النووي. التكامل بين كلا ليغومرات الحمض النووي الفيروسي (فدنا) بلازميد ينتج منتج خطي ويطلق على تكامل منسقة (الشكل 2A). إدماج التحليل في المختبر قد أيضا تعطي المنتجات مع واحد فقط فدنا تساهمي انضم إلى بلازميد المستهدفة الناتجة في دائرة استرخاء. يبدو أن هذا المنتج التكامل النصف-الموقع الحرفية للفحص في المختبر.
قد تؤدي في المؤتلف وفدنا التكامل في المختبر، لكنها ليست الكواشف مثالية لدراسة ديناميات أو هيكل المجمعات التكامل عند أحادي في أن يحجب المرئيات ذات الصلة. التكامل المنقي المجمعات، أو "إينتاسوميس"، مطلوبة من أجل دراسات تحليل أو هيكلية ديناميكية جزيء واحد. في فف وفدناس قد يتم تجميعها بالغسيل الكلوي من المخزن مؤقت تركيز ملح مرتفعة نسبيا إلى انخفاض تركيز ملح3،4. أثناء الغسيل الكلوي، متسرعا أشكال. تتم إزالة هذا متسرعا من الغسيل الكلوي وزيادة تركيز الملح. تركيز الملح العالي سولوبيليزيس إينتاسوميس فف تتضمن متعجل. ثم يتم تنقيته في إينتاسوميس بحجم الاستبعاد اللوني (ثانية). قد ثبت أولى المؤتلف فيروس مزبد (بفف) في الوجود مونومر في الحل بتركيزات تصل إلى 225 ميكرومتر5. تجزئة ثانية فعلياً يفصل بين إينتاسوميس فف (كاتشين 225.5)، الذي يتضمن تيترامير في فف وهما فدناس، فف أحادي في (44.4 كاتشين) والحر فدنا (24.0 كاتشين). إينتاسوميس بفف قد تكون مجمدة، والاحتفاظ بنشاط إدماج لمدة ستة أشهر على الأقل من التخزين في ˚C-80.
يمكن تعديل المؤتلف فف إينتاسوميس أيضا أن تدرج في استبدال الأحماض الأمينية أو الطفرات الاقتطاع أو فدناس المسمى مع4،فلوروفوريس أو البيوتين6. سهولة أداء إينتاسوميس فف المنقي إدماج هدفا سوبيركويليد بلازميد الحمض النووي في المختبر. معظم فحوصات البيوكيميائية التكامل مع إينتاسوميس قد اختبار الآثار في الطفرات في مثبطات أو المضافات الكيميائية الأخرى. يمكن استخدام إينتاسوميس بيوتينيلاتيد لتحقيق تقارب مع الأحماض النووية أو البروتينات. إينتاسوميس فف وظيفية في درجة حرارة الغرفة، مما يسمح للتحليل المجهري جزيء واحد بملاقط مغناطيسية لقياس الوقت بين الانضمام إلى طرفي فدنا أو الأسفار الانعكاس الداخلي الكلي لتصور البحث إينتاسومي على الهدف 6من الحمض النووي. وباﻹضافة إلى ذلك، كانت إينتاسوميس بفف تتميز أول هيكلياً تؤثر إلى حد كبير مجال التكامل النسخ العكسي3.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DNA Oligomers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom DNA Oligos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Ultra Pure</td>
			<td>Gojira Fine Chemicals</td>
			<td>UTS1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>P212121</td>
			<td>RP-S23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA</td>
			<td>Invitrogen/Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z677094-24EA</td>
			<td>3 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT&#160;</td>
			<td>P212121</td>
			<td>SV-DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIS-TRIS propane,&#62;=99.0% (titration)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6755-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>G37-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel-loading tips, 1 - 200 &#956;L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4853-400EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &#62; 250mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>568-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing clips</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>132734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing</td>
			<td>Spectrum Medical</td>
			<td>132645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17517201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Res Standard Agarose</td>
			<td>AGTC Bioproducts</td>
			<td>AG500D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0-267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyladder 10kb, 500 lanes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>CB4225-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly and purification of prototype foamy virus intasomes

أ تحديد الميزة وخطوة ضرورية لدورة حياة لفي هو دمج الجينوم الفيروسي في جينوم مضيف. ترميز كافة الفيروسات القهقرية إنزيم integrase (في) الذي يحفز التساهمية ضم الفيروسية للمضيف الحمض النووي، والذي يعرف باسم نقل حبلا. الاندماج قد يكون على غرار في المختبر مع المؤتلف في النسخ العكسي والحمض النووي ليغومرات محاكاة نهايات الجينوم الفيروسي. كي الخص رد فعل الاندماج التي تحدث في فيفو، تكامل أوثق مجمعات يتم تجميعها في المؤتلف وليغومرات الاصطناعية بالغسيل الكلوي في المخزن مؤقت انخفاض تركيز ملح. يمكن تنقية التكامل المعقدة، ودعا إينتاسومي، بحجم الاستبعاد اللوني. في حالة نموذج مزبد الفيروس (فف)، إينتاسومي تيترامير في وهما الحمض النووي ليغومرات وسهولة يفصل في موحودي والحرة أوليجومير الحمض النووي. قد جزيئي كفاءة التكامل إينتاسوميس فف تحت مجموعة متنوعة من الظروف التجريبية فهم أفضل لديناميات وآليات التكامل للفيروسات الرجعية.

إينتاسوميس فف يتم تجميعها في المؤتلف وفدنا. بعد التجميع، يتم تنقية إينتاسوميس قبل ثانية (الشكل 1). هو جزيئي نشاط الإدماج لكل جزء مع سوبيركويليد الحمض النووي الهدف و [اغروس] هلام التفريد (الشكل 2). هو تصوير هذا جل مع الماسح ضوئي فلورسنت للكشف ع...

Watch this Scientific Journal Video about Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes at JoVE.com

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

Integrase الفيروسات التراجعية المؤتلف والحمض النووي ليغومرات محاكاة نهايات الحمض النووي الفيروسي يمكن أن تشكل مجمع نشطة انزيماتيكالي المعروف باسم إينتاسومي. ويمكن استخدام إينتاسوميس للدراسات الكيميائية الحيوية والهيكلية، والحركية. هذا البروتوكول تفاصيل كيفية تجميع وتنقية إينتاسوميس فيروس مزبد النموذج.

الجمعية وتنقية من النموذج إينتاسوميس فيروس مزبد

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

بسيطة وقوية في الجسم الحي و في المختبر مدخل لدراسة الجمعية فيروس

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

تنقية تقارب من المجمعات الأنفلونزا فيروس بروتين نووي ريبوزي من لونين من الخلايا المصابة

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

تنقية من الفجوات المرضي من<em&gt; البكتيريا</em&gt; المصابة البالعات

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

الانقاذ من الفيروسات المؤتلف مرض نيوكاسل من [كدنا]

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

تقييم فعالية وسمية الرنا استهداف HIV-1 الإنتاج للاستخدام في الجينات أو العلاج بالعقاقير

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

إنقاذ وتوصيف الفيروسات المؤتلف من عالم جديد زيكا الفيروسات استنساخ العدوى

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

جيل متغيرات الهروب من تحييد الأجسام المضادة فيروس الإنفلونزا

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

كشف وإزالة التلوث Nuclease أثناء تنقية Integrase فيروس مزبد النموذج المؤتلف

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

استخراج سريعة وآمنة وبسيطة دليل السرير الحمض النووي للكشف عن الفيروس في عينات الدم كله

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...