Name: assembly and purification of prototype foamy virus intasomes
Uploaded: 2018-03-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes at JoVE.com

Detta arbete stöds av NIH AI099854 och AI126742 till nyckel.

1. glödgning av vDNA
<ol><li>Kombinera 1 X tio buffert (10 X tio lager: 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl, 10 mM EDTA), 10 µM Oligo 1 (5' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3', 100 µM lager) och 10 µM Oligo 2 (5' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3', 100 µM lager) i en slutlig volym av 1,5 mL . Alikvotens 25 µL till sextio 0,2 mL polymeras-kedjereaktion (PCR) rör. Obs: Beroende på applikation, oligomerer modifieras med fluorophores eller taggar i 5'-slutet av Oligo 2 eller som en inre amino-T bas ...

<ol>
	<li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Retroviruses. , (1997).</li><li>Valkov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+characterization+of+the+integrase+from+the+prototype+foamy+virus.">Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).</li><li>Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasome+assembly+and+inhibition+of+DNA+strand+transfer.">Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer.</a> Nature. 464 (7286), 232-236 (2010).</li><li>Li, M., Lin, S., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+domains+of+integrase+within+retroviral+intasomes+are+dispensible+for+catalysis+of+DNA+integration.">Outer domains of integrase within retroviral intasomes are dispensible for catalysis of DNA integration.</a> Protein Sci. 25 (2), 472-478 (2016).</li><li>Gupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+conformations+of+prototype+foamy+virus+integrase+and+its+stable+synaptic+complex+with+U5+viral+DNA.">Solution conformations of prototype foamy virus integrase and its stable synaptic complex with U5 viral DNA.</a> Structure. 20 (11), 1918-1928 (2012).</li><li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration.">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nat Commun. 7, 11409 (2016).</li><li>Lopez, M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase.">Detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase.">Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).</li><li>Poirier, M. G., Bussiek, M., Langowski, J., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+access+to+DNA+target+sites+in+folded+chromatin+fibers.">Spontaneous access to DNA target sites in folded chromatin fibers.</a> J Mol Biol. 379 (4), 772-786 (2008).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li><li>Ballandras-Colas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+reveals+a+novel+octameric+integrase+structure+for+betaretroviral+intasome+function.">Cryo-EM reveals a novel octameric integrase structure for betaretroviral intasome function.</a> Nature. 530 (7590), 358-361 (2016).</li><li>Ballandras-Colas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+supramolecular+assembly+mediates+lentiviral+DNA+integration.">A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration.</a> Science. 355 (6320), 93-95 (2017).</li><li>Passos, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structures+and+atomic+model+of+the+HIV-1+strand+transfer+complex+intasome.">Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome.</a> Science. 355 (6320), 89-92 (2017).</li><li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+Rous+sarcoma+virus+intasome.">Crystal structure of the Rous sarcoma virus intasome.</a> Nature. 530 (7590), 362-366 (2016).</li><li>Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+retroviral+integration+from+X-ray+structures+of+its+key+intermediates.">The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates.</a> Nature. 468 (7321), 326-329 (2010).</li><li>Maskell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+retroviral+integration+into+nucleosomes.">Structural basis for retroviral integration into nucleosomes.</a> Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).</li></ol>

Retrovirala INs bildar ett multimeric komplex med viral genomiskt DNA att utföra integrering och fortsätta viral livscykel. Antalet i monomerer per intasome kan vara tetramers, octamers eller eventuellt högre ordning multimers11,12,13,14. PFV intasomes är en tetramer av rekombinant in med dubbelsträngat DNA oligomerer som efterliknar viral genomiskt DNA slutar3....

Integrering av det virala genomet i värd genomet är ett obligatoriskt steg i livscykeln för alla retrovirus1. Den virala enzymet integras (IN) katalyserar den kovalenta sammanfogningen av varje ände av det virala DNA-genomet till värd DNA. Under en cellulär infektion, är en del av ett före integration-komplex som medierar integration. Rekombinant i komplex med dubbel stranded DNA oligomerer härma de virala DNA-ändarna kan också utföra integrering i en target DNA in vitro-2. En gemensam integration test in vitro- använder en supercoiled plasmid som mål DNA. Integrering av både viral DNA oligomerer (vDNA) till plasmiden resulterar i en linjär produkt och kallas samordnade integration (figur 2A). Den integration test in vitro- kan också ge produkter med endast en vDNA kovalent ansluten till målet plasmiden vilket resulterar i en avslappnad cirkel. Denna halv-site integrering produkt verkar vara en artefakt av test in vitro.
Rekombinant IN och vDNA kan utföra integration i vitro, men de är inte perfekta reagenser för studiet av dynamiken eller struktur av integration komplex när monomer IN skulle skymma relevanta visualisering. Renat integration komplex, eller ”intasomes”, krävs för dynamiska enda molekyl analys eller strukturella studier. PFV IN och vDNAs kan monteras genom dialys från en relativt hög saltkoncentration buffert till en lägre saltkoncentration3,4. Under dialys, en fällning former. Denna utfällning tas bort från dialys och Saltkoncentrationen ökar. Högre Saltkoncentrationen solubilizes den fällning som innehåller PFV intasomes. Intasomes sedan renas genom storlek utslagning kromatografi (SEC). Rekombinant prototyp skummande virus (PFV) IN har visat att existera som en monomer i lösningen vid koncentrationer upp till 225 µM5. SEC fraktionering separerar effektivt det PFV intasomes (225.5 kDa), som omfattar en tetramer PFV i och två vDNAs, från monomer PFV i (44,4 kDa) och gratis vDNA (24,0 kDa). Den PFV intasomes kan frysas och bevara integration aktivitet för minst sex månaders lagring vid-80 ˚C.
Rekombinant PFV intasomes kan också ändras för att inkludera i aminosyran substitutioner eller trunkering mutationer eller vDNAs märkt med fluorophores eller biotin4,6. De renade PFV intasomes utför lätt integreras måltavla supercoiled plasmid DNA i vitro. Bulk biokemiska integration analyser med intasomes kan testa effekterna av mutationer, i-hämmare eller andra kemiska tillsatser. Biotinylerade intasomes kan användas till probe samhörighet med nukleinsyror eller proteiner. PFV intasomes är funktionella vid omgivande temperatur möjliggör enda molekyl mikroskopi analys av magnetisk pincett att mäta tiden mellan sammanfogningen av de två vDNA ändar eller totalreflexion fluorescens att visualisera intasome Sök på målet DNA6. PFV intasomes var dessutom först med att vara strukturellt kännetecknas avsevärt påverkar området för retrovirala integration3.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DNA Oligomers</td>
			<td>IDT</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom DNA Oligos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Ultra Pure</td>
			<td>Gojira Fine Chemicals</td>
			<td>UTS1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>P212121</td>
			<td>RP-S23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA</td>
			<td>Invitrogen/Gibco</td>
			<td>15575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z677094-24EA</td>
			<td>3 kDa MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT&#160;</td>
			<td>P212121</td>
			<td>SV-DTT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIS-TRIS propane,&#62;=99.0% (titration)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6755-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>G37-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel-loading tips, 1 - 200 &#956;L</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4853-400EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane &#62; 250mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>568-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing clips</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>132734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing</td>
			<td>Spectrum Medical</td>
			<td>132645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17517201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Res Standard Agarose</td>
			<td>AGTC Bioproducts</td>
			<td>AG500D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0-267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyladder 10kb, 500 lanes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>CB4225-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly and purification of prototype foamy virus intasomes

A definiera funktionen och nödvändigt steg av retrovirus livscykel är integrationen av det virala genomet i värd genomet. Alla retrovirus koda en integrashämmare (IN) enzym som katalyserar den kovalenta sammanfogningen av viral till värd DNA, som kallas strand överföring. Integration kan vara modellerade i vitro med rekombinant retrovirala IN och DNA oligomerer härma ändarna av det virala genomet. För att sammanfatta närmare integration reaktionen som uppstår i vivo, integration är komplex monteras från rekombinant IN och syntetiska oligomerer av dialys i en minskad salthalt buffert. Att integrera komplexa, kallas en intasome, kan renas genom storlek utslagning kromatografi. När det gäller prototyp skummande virus (PFV), intasome är en tetramer av i och två DNA oligomerer och separeras lätt från monomer IN och gratis oligomer DNA. PFV intasomes integration effektivitet kan analyseras under en mängd experimentella förhållanden att bättre förstå dynamiken och mekanik av retrovirala integration.

PFV intasomes monteras från rekombinant IN och vDNA. Efter monteringen renas intasomes av SEC (figur 1). Integration aktiviteten av respektive fraktion har analyserats med en supercoiled DNA mål och agaros gel-elektrofores (figur 2). Denna gel är avbildade med fluorescerande skanner anger att upptäcka EtBr (och fluorophore, om fluorophore-märkt vDNA används). Med bild analys programvara, kan bandet pixel volymer användas a...

Watch this Scientific Journal Video about Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes at JoVE.com

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

Rekombinant retrovirala integras och DNA oligomerer härma virala DNA-ändarna kan bilda ett enzymatiskt aktivt komplex som kallas en intasome. Intasomes kan användas för biokemiska, strukturella och kinetiska studier. Detta protokoll Detaljer hur man monterar och rena prototyp skummande virus intasomes.

Montering och rening av prototyp skummande Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

Enkel och robust In vivo Och In vitro Tillvägagångssätt för att studera Virus Assembly

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Affinitetsrening av ribonukleoprotein influensavirus komplex från kromatinet hos infekterade celler

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Rening av patogener vakuoler från<em&gt; Legionella</em&gt;-Infekterade Fagocyter

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Räddning av rekombinant Newcastlevirus från cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Utvärdering av effekt och toxicitet av RNA Targeting HIV-1-produktion för användning i Gene eller Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Räddning och karaktärisering av rekombinant virus från en ny världsinfektiös klon från Zika Virus

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generation av Escape varianter av neutraliserande influensa Virus monoklonala antikroppar

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Upptäckt och borttagning Nuclease kontamination vid rening av rekombinant prototyp skummande Virus integras

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Snabb, säker och enkel manuell sängkanten nukleinsyra extraktion för påvisande av Virus i helblod

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...