Denne metode kan hjælpe os med at besvare centrale spørgsmål relateret til genekspression, der viser os præcis, hvordan kromatinstruktur påvirker genekspression, og hvordan kromatinorganisation regulerer transskriptionel dynamik. Vi udviklede denne teknologi, fordi vi ønskede at være i stand til at styreligt ændre kromosomisk arkitektur for at muliggøre oprettelsen af langtrækkende kromatin looping. Mens på samme tid har evnen til at vende kromatin sammenhæng for at genoprette den endogene kromosomale struktur.
Denne metode er designet til brugervenlighed og bred anvendelighed. Vi benyttede os af en ikke-giftig dimerizer samt ortogonale arter af dcas9 for at gøre det muligt at bruge systemet mere bredt. Vi udviklede denne metode, fordi vi ønskede at kunne besvare det mangeårige kyllinge-og-æg-spørgsmål om, hvorvidt genekspression avler kromosomisk arkitektur, eller om kromosomstruktur fører til ændringer i genekspression.
Design af CRISPR-guide RNA-sekvenser og vedligeholdelse af cellekulturerne er beskrevet i tekstprotokollen. Plasmid kort og primere udnyttet er opført der i. Begynd plasmidpræparatet ved at blande fem mikrogram af den lentivirale CRISPR plasmid med tre mikroliter BsmB1 tre mikroliter alkalisk fosfatase seks mikroliter 10x fordøjelsesbuffer og 0,6 mikroliter frisklavet 100 millimolar DTT.
Bring det samlede volumen til 60 mikroliter af dobbelt destilleret vand og inkubere blandingen ved 37 grader celsius i 30 minutter for at fordøje og de-fosforlate plasmid. Derefter gel rense fordøje fordøjet plasmid i løkken plasmid og dobbelt destilleret vand. Derefter forberedes glødende reaktioner til guide RNA par.
Kombiner en mikroliter af hver guide RNA ved 100 mikromolar med en mikroliter på 10x T4 ligation buffer 6,5 mikroliter af dobbelt destilleret vand og 0,5 mikroliter af T4 PNK for et samlet reaktionsvolumen på 10 mikroliter. At gløde guide RNA parrer til deres målsekvenser inkubere blandingerne ved 37 grader celsius ved 30 minutter efterfulgt af en inkubation ved 95 grader celsius i 5 minutter og derefter gradvist reducere temperaturen til 25 grader celsius ved at reducere det med fem grader celsius i minuttet. Dernæst fortyndes den udglødede guide RNAs på et til to hundrede i dobbelt destilleret vand.
Nu forberede de to ligation reaktioner. Bland en mikroliter af den fordøjede plasmid med 0,5 mikroliter af en fortyndet perivaneal guide RNAse 2,5 mikroliter af 2x ligation buffer en mikroliter af dobbelt destilleret vand og 0,5 mikroliter af ligase. Inkuber reaktionerne ved stuetemperatur i 10 minutter for at lasere guiderne BsmB1 fordøjet plasmid.
Derefter omdanne den nyligt ligated plasmid i stabile tre bakterier og forstærke bakterierne ved hjælp af enhver plasmid forberedelsesmetode. På en seks-brønd plade, per godt, frø 750, 000 2n3 Tcells i DMEM med 10% FBS og 1% pen STREP. Brug en brønd til hver konstruktion og inkuber cellerne i 24 timer.
Den næste dag, ændre medium til frisk antibiotika gratis DMEM med 10% FBS. Lige efter at ændre mediet for hver brønd af belagte celler forberede et rør af Lentivirus produktion blanding. Efter hver reaktion fortyndes 11 mikroliter lipid-base transinfektion reagens med 150 mikroliter af Opti-MEM-mediet for hver reaktion.
Så i separate rør forberede DNA. Kombiner to mikrogram af CLOud9 lentiviral vektor plasmid med to mikrogram af de andre lentiviral emballage komponenter. Blandingen fortyndes i 150 mikroliter af Opti-MEM-mediet.
Derefter kombineres lige store mængder af den fortyndede lentiviral plasmid-blanding i det fortyndede lipidbaserede transinfektionsreage og inkubere blandingerne i fem minutter ved stuetemperatur. Derefter til hver brønd af celler tilføje et rør af de forberedte blandinger og fortsætte inkubationen. 48 timer senere, overføre viral produktion medier fra pladen brønde i koniske og dreje dem ned på 300 g i fem minutter.
Overfør derefter supernatanten til friske rør for at kassere det pelleterede snavs. Nu skal du straks bruge de virale produktionsmedier til at transduce målcellerne eller fryse det ved 80 grader celsius til fremtidig brug. Begynd med at tilføje 250 mikroliter af hver viral konstruktion af interesse, som i dette tilfælde består af supplerende CLOud9 plasmider til en 50 milliliter konisk rør, der indeholder 80,000 celler.
Derefter tilsættes nok polybren, så det er mellem et og otte mikrogram pr. milliliter i opløsning. Juster derefter det samlede volumen i hvert rør til en milliliter ved hjælp af antibiotikafrie medier. Nu for at øge kontakten mellem viruspartikler og cellerne spin cellerne på 800 g i 30 minutter ved stuetemperatur.
Derefter re-suspendere cellerne på supernatant ved pipettering. Dernæst skal du veje cellernes affjedring på kulturplader og inkubere dem i 24 timer. Den følgende dag, indsamle cellerne.
Centrifuge dem ved 300 g i fem minutter ved stuetemperatur og re-suspendere dem i normalt medium. Den næste dag, tilføje puromycin og hygromycin til mediet for at vælge for dobbelt transduced celler. Den passende koncentration af antibiotika bør bestemmes på forhånd for hver celletype.
Inkuber derefter cellerne i markeringsmediet i mindst tre dage, før du fortsætter med downstream-programmer, og fortsæt med at vedligeholde cellerne og markeringsmediet. For at dæmpe CLOud9 udvalgte og transduced celler tilføje en millimolar ABA til kultur parabol. For kontrolelementer skal du tilføje DMSO og derefter vedligeholde cellerne med ABA eller DMSO i hele forsøgets varighed.
For at vende dimerization, vaske cellerne med nok PBS til at dække overfladen af pladen to gange. Derefter kulturceller i ABA-frie medier for at opretholde dem i en udæmpet tilstand. Korrekt anvendelse af CLOud9-systemet inducerer reversibel kontakt mellem de komplementære CSA- og CSP CLOud9-konstruktioner ved at tilsætning eller fjernelse af ABA til cellekulturmedier.
CSA- og CSP-konstruktionerne er lokaliseret til passende genomiske områder ved hjælp af standard CRISPR guide RNAse. Chromatin immunoprecipation efterfulgt af kvantitativ PCR blev udnyttet til at sikre den nøjagtige lokalisering i målretning af hver CLOud9 komponent. Derudover coimmunoprecipation med og uden ABA verificeret CSA og CSP dimerization i overværelse af ligand samt reversibilitet i mangel af ligand.
Efter ABA-dimerisering blev større kontakt mellem beta-globin og LCR målt ved kromosombekræftelse. Dette blev imidlertid ikke observeret i kontrollerne, der hverken kun indeholdt CSA eller kun CSP-konstruktionen. Oprettelse af LCR beta-globin interaktion ikke helt fjerne den endogene LCR globin kontakt.
Den blev kun føjet til den oprindelige kontakt. Den øgede i beta-globin LCR kontakter blev observeret gennem 72 timers dimerization uanset den nøjagtige region inden for den målrettede LCR eller beta-globin promotor region. Endelig blev systemets reversibilitet bekræftet med kromosombekræftelse efter fjernelse af ABA.
Dette resulterede i en fuldstændig fornyelse af den endogene bekræftelse. Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at ændre medier og tilføje frisk dimerized CLOud9 transduced celler hver dag. Glem ikke at arbejde med lentivirus kan være yderst farligt, og alle forholdsregler, der anvendes på BSL 2 bør altid tages, når du udfører denne procedure.