Deze methode kan ons helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot genexpressie die ons precies laten zien hoe chromatinestructuur de genexpressie beïnvloedt en hoe chromatineorganisatie de transcriptiedynamiek reguleert. We ontwikkelden deze technologie omdat we de chromosomale architectuur konden kunnen beheersen om het creëren van chromatineloop over lange afstand mogelijk te maken. Terwijl op hetzelfde moment hebben de mogelijkheid om de chromatine context om te keren om de endogene chromosomale structuur te herstellen.
Deze methode is ontworpen voor gebruiksgemak en brede toepasbaarheid. We maakten gebruik van een niet-toxische dimerizer en orthogonale soorten dcas9 om het systeem breder te kunnen gebruiken. We ontwikkelden deze methode omdat we de al lang bestaande kip-en-het-ei-vraag wilden kunnen beantwoorden of genexpressie chromosomale architectuur krijgt of dat chromosoomstructuur leidt tot veranderingen in genexpressie.
Het ontwerp van de CRISPR-gids RNA sequenties en het onderhoud van de celculturen worden beschreven in het tekstprotocol. Plasmid kaarten en de primers gebruikt zijn er vermeld in. Begin met het plasmidepreparaat door vijf microgram van het lentivirale CRISPR-plaskaan te mengen met drie microliter van BsmB1 drie microliters alkalisch fosfor zes microliter van 10x spijsverteringsbuffer en 0,6 microliter vers bereide 100 millimolar DTT.
Breng het totale volume op 60 microliter dubbel gedestilleerd water en broed het mengsel gedurende 30 minuten op 37 graden Celsius om het plasmid te verteren en te de-fosforyleren. Vervolgens, gel zuiveren de verteerd plasmid in de lus plasmid en dubbel gedestilleerd water. Bereid vervolgens annealing reacties voor de gids RNA paren.
Combineer een microliter van elke gids RNA op 100 micromolar met een microliter van 10x T4 ligatie buffer 6,5 microliter van dubbel gedestilleerd water en 0,5 microliter T4 PNK voor een totaal reactievolume van 10 microliters. Om de geleide RNA-paren aan hun doelsequenties te laten uitbroeden de mengsels bij 37 graden Celsius op 30 minuten, gevolgd door een incubatie bij 95 graden Celsius gedurende 5 minuten en vervolgens geleidelijk de temperatuur verlagen tot 25 graden celsius door het met vijf graden celsius per minuut te verlagen. Verdun vervolgens de geannealed gids RNAs op een tot tweehonderd in dubbel gedestilleerd water.
Nu, bereid de twee ligatie reacties voor. Meng een microliter van de verteerde plasmid met 0,5 microliter van een verdunde perivaneale geleider RNAse 2,5 microliter 2,5 microliter 2x ligatiebuffer een microliter dubbel gedestilleerd water en 0,5 microliter ligase. Incubeer de reacties bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten om de geleiders BsmB1 verteerd plasmid te binden.
Zet vervolgens de nieuw ligated plasmide om in stabiele drie bacteriën en versterk de bacteriën met behulp van een plasmide bereidingsmethode. Op een zes-put plaat, per goed, zaad 750, 000 2n3 Tcells in DMEM met 10%FBS en 1%pen strep. Gebruik een put voor elke constructie en incubeer de cellen voor 24 uur.
De volgende dag, verander het medium naar verse antibioticum free-DMEM met 10%FBS. Direct na het veranderen van het medium voor elke put van vergulde cellen bereiden een buis van Lentivirus productie mengsel. Verdun per reactie 11 microliter lipidentransfectiereage met 150 microliter van het Opti-MEM-medium voor elke reactie.
Dan in aparte buizen bereiden het DNA. Combineer twee microgrammen van de CLOud9 lentivirale vector plasmid met twee microgrammen van de andere lentivirale verpakkingscomponenten. Verdun dit mengsel in 150 microliter van het Opti-MEM medium.
Combineer vervolgens gelijke volumes van het verdunde linzenplasmidmengsel in het verdunde transfectionreagemiddel op basis van lipide en broed de mengsels gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur uit. Voeg vervolgens aan elke put van cellen een buis van de bereide mengsels toe en zet de incubatie voort. 48 uur later, breng de virale productiemedia van de plaat putten in kegels en draai ze naar beneden op 300 g gedurende vijf minuten.
Breng vervolgens de supernatant over op verse buizen om het gepelde puin weg te gooien. Gebruik nu onmiddellijk de virale productiemedia om de doelcellen te transduceren of te bevriezen bij 80 graden Celsius voor toekomstig gebruik. Begin met het toevoegen van 250 microliter van elke virale constructie van belang, die in dit geval bestaat uit complementaire CLOud9 plasmiden aan een 50 milliliter conische buis met 80.000 cellen.
Voeg vervolgens genoeg Polybrene toe, zodat het tussen de één en acht microgram per milliliter in oplossing is. Pas vervolgens het totale volume in elke buis aan op één milliliter met behulp van antibioticavrije media. Nu om het contact tussen de virusdeeltjes en de cellen te verhogen, draaien de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op 800 g.
Dan opnieuw op te schorten de cellen op de supernatant door pipetten. Laad vervolgens de suspensie van de cellen op kweekplaten en kweek ze gedurende 24 uur. De volgende dag, het verzamelen van de cellen.
Centrifugeren ze op 300 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en opnieuw op te schorten in normaal medium. De volgende dag, voeg puromycine en hygromycine aan het medium om te selecteren voor dubbel getransduceerde cellen. De juiste concentratie antibioticum moet vooraf voor elk celtype worden bepaald.
Vervolgens ontcunken de cellen in de selectiemedia gedurende ten minste drie dagen voordat u verdergaat met downstreamtoepassingen en de cellen en selectiemedia blijft onderhouden. Om de cloud9 geselecteerde en getransduceerde cellen te verdrijzen voeg een millimolar ABA aan de cultuur schotel. Voeg voor besturingselementen DMSO toe en onderhoud de cellen met ABA of DMSO voor de duur van het experiment.
Om de dimerisatie te keren, was de cellen met voldoende PBS om het oppervlak van de plaat twee keer te bedekken. Daarna, cultuurcellen in ABA-vrije media om ze te onderhouden in een ongedimeriseerde staat. Een adequaat gebruik van het CLOud9-systeem veroorzaakt omkeerbaar contact van de complementaire CSA- en CSP CLOud9-constructies door de toevoeging of verwijdering van ABA naar celkweekmedia.
De CSA- en CSP-constructies zijn gelokaliseerd op geschikte genomische regio's met behulp van standaard CRISPR-gids RNAse. Chromatine immunoprecipitatie gevolgd door kwantitatieve PCR werd gebruikt om de nauwkeurige lokalisatie in targeting van elke CLOud9 component te waarborgen. Bovendien co-immuuneropreceptatie met en zonder ABA geverifieerde CSA en CSP dimerization in aanwezigheid van de ligand evenals de omkeerbaarheid in de afwezigheid van de ligand.
Na ABA dimerization werd meer contact tussen bèta-globine en de LCR gemeten door chromosoombevestiging. Dit werd echter niet waargenomen in de controles die alleen de CSA of alleen de CSP-constructie bevatten. Het maken van de LCR beta-globine interactie niet volledig elimineren van de endogene LCR globin contact.
Het alleen toegevoegd aan de oorspronkelijke contactpersoon. De toename van bèta-globine LCR contacten werden waargenomen door middel van 72 uur van dimerization, ongeacht de exacte regio binnen de beoogde LCR of de beta-globin promotor regio. Ten slotte werd de omkeerbaarheid van het systeem bevestigd met chromosoombevestiging na het verwijderen van ABA.
Dit resulteerde in de volledige vernieuwing van de endogene bevestiging. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om media te veranderen en voeg verse dimerized CLOud9 getransduceerde cellen elke dag. Vergeet niet dat het werken met lentivirus zeer gevaarlijk kan zijn en alle voorzorgsmaatregelen die worden gebruikt bij BSL 2 moeten altijd worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.