Diese Methode könnte uns helfen, schlüsselrelevante Fragen im Zusammenhang mit der Genexpression zu beantworten, die uns genau zeigen, wie sich die Chromatinstruktur auf die Genexpression auswirkt und wie die Chromatinorganisation die Transkriptionsdynamik reguliert. Wir haben diese Technologie entwickelt, weil wir in der Lage sein wollten, die chromosomale Architektur steuern zu können, um die Erstellung von Langstrecken-Chromatin-Looping zu ermöglichen. Während zur gleichen Zeit haben die Fähigkeit, den Chromatin-Kontext umzukehren, um die endogene chromosomale Struktur wiederherzustellen.
Diese Methode wurde für benutzerfreundlichkeit und breite Anwendbarkeit entwickelt. Wir nutzten einen ungiftigen Dimerizer sowie orthogonale Arten von dcas9, um eine breitere Nutzung des Systems zu ermöglichen. Wir haben diese Methode entwickelt, weil wir in der Lage sein wollten, die langjährige Hähnchen-und-die-Ei-Frage zu beantworten, ob Genexpression Chromosomenarchitektur bewirkt oder ob Chromosomenstruktur zu Veränderungen in der Genexpression führt.
Die Gestaltung der CRISPR-Guide-RNA-Sequenzen und die Aufrechterhaltung der Zellkulturen sind im Textprotokoll beschrieben. Plasmidkarten und die verwendeten Primer sind dort aufgeführt. Beginnen Sie die Plasmidpräparation, indem Sie fünf Mikrogramm des lentiviralen CRISPR-Plasmids mit drei Mikrolitern BsmB1 drei Mikroliter alkalischer Phosphatase sechs Mikroliter 10-fachen Verdauungspuffer und 0,6 Mikroliter frisch zubereiteter 100 Millimolar DTT-Plasmation mischen.
Bringen Sie das Gesamtvolumen auf 60 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser und brüten Sie das Gemisch 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um das Plasmid zu verdauen und zu dephosphorylieren. Dann reinigt Gel das verdaute Plasmid im Schleifenplasmid und doppelt destilliertem Wasser. Als nächstes bereiten Sie Glühreaktionen für die Guide-RNA-Paare vor.
Kombinieren Sie einen Mikroliter jeder Führungs-RNA bei 100 Mikromolaren mit einem Mikroliter 10x T4 Ligationspuffer 6,5 Mikroliter doppeldestilliertes Wasser und 0,5 Mikroliter T4 PNK für ein Gesamtreaktionsvolumen von 10 Mikrolitern. Um die Guide-RNA-Paare zu ihren Zielsequenzen zu begleiten, inkubieren die Mischungen bei 37 Grad Celsius bei 30 Minuten, gefolgt von einer Inkubation bei 95 Grad Celsius für 5 Minuten, dann die Temperatur schrittweise auf 25 Grad Celsius, indem sie sie um fünf Grad Celsius pro Minute verringert. Als nächstes verdünnen Sie die geglühten Führungs-RNAs bei ein bis zweihundert in doppelt destilliertem Wasser.
Bereiten Sie nun die beiden Ligationsreaktionen vor. Mischen Sie einen Mikroliter des verdauten Plasmids mit 0,5 Mikrolitern eines verdünnten Perivaneal-Guides RNAse 2,5 Mikroliter 2x Ligationspuffer einen Mikroliter doppelt destilliertes Wasser und 0,5 Mikroliter Ligase. Inkubieren Sie die Reaktionen bei Raumtemperatur für 10 Minuten, um die Führungen BsmB1 verdauten Plasmid zu ligte.
Verwandeln Sie dann das neu ligierte Plasmid in stabile drei Bakterien und verstärken Sie die Bakterien mit jeder Plasmid-Vorbereitungsmethode. Auf einer Sechs-Brunnen-Platte, pro Brunnen, Samen 750, 000 2n3 Tcells in DMEM mit 10%FBS und 1%pen Strep. Verwenden Sie einen Brunnen für jedes Konstrukt und inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden.
Am nächsten Tag das Medium auf frisches Antibiotika-Freies-DMEM mit 10%FBS umstellen. Gleich nach dem Wechsel des Mediums für jeden Brunnen der plattierten Zellen bereiten eine Röhre der Lentivirus-Produktionsmischung. Pro Reaktion 11 Mikroliter Lipid-Basis-Transfektionsreagenz mit 150 Mikrolitern des Opti-MEM-Mediums für jede Reaktion verdünnen.
Dann in separaten Röhren bereiten sie die DNA vor. Kombinieren Sie zwei Mikrogramm des LENTiviralen Vektorplasmids CLOud9 mit zwei Mikrogramm der anderen lentiviralen Verpackungskomponenten. Verdünnen Sie diese Mischung in 150 Mikroliter des Opti-MEM Mediums.
Dann die gleichen Volumina des verdünnten lentiviralen Plasmidgemisches im verdünnten lipidbasierten Transfektionsreagenz kombinieren und die Mischungen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Dann zu jedem Brunnen der Zellen fügen Sie eine Röhre der vorbereiteten Mischungen und setzen Sie die Inkubation. 48 Stunden später die viralen Produktionsmedien aus den Plattenbrunnen in Konische übertragen und fünf Minuten lang bei 300 g nach unten drehen.
Dann den Überstand auf frische Schläuche übertragen, um die pelletierten Trümmer zu entsorgen. Verwenden Sie nun sofort die viralen Produktionsmedien, um die Zielzellen zu transduzieren oder sie bei 80 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung einzufrieren. Beginnen Sie mit der Zugabe von 250 Mikrolitern jedes viralen Konstrukts von Interesse, das in diesem Fall aus komplementären CLOud9-Plasmiden zu einem 50 Milliliter konischen Rohr mit 80.000 Zellen besteht.
Fügen Sie dann genügend Polybren hinzu, so dass es zwischen einem und acht Mikrogramm pro Milliliter in Lösung liegt. Dann stellen Sie das Gesamtvolumen in jeder Röhre auf einen Milliliter mit antibiotikafreien Medien ein. Um nun den Kontakt zwischen den Viruspartikeln und den Zellen zu erhöhen, drehen die Zellen bei Raumtemperatur 30 Minuten lang bei 800 g.
Dann setzen Sie die Zellen am Überstand durch Pipettieren wieder auf. Als nächstes laden Sie die Zellsuspension auf Kulturplatten und inkubieren sie für 24 Stunden. Sammeln Sie am nächsten Tag die Zellen.
Zentrifugieren Sie sie bei 300 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur und hängen Sie sie im normalen Medium wieder auf. Am nächsten Tag, fügen Sie Puromycin und Hygromycin auf das Medium, um für doppelt transduced Zellen zu wählen. Die entsprechende Konzentration von Antibiotika sollte im Voraus für jeden Zelltyp bestimmt werden.
Inkubieren Sie dann die Zellen im Auswahlmedium mindestens drei Tage lang, bevor Sie mit nachgelagerten Anwendungen fortfahren, und halten Sie die Zellen und Auswahlmedien aufrecht. Um die ausgewählten und transduzierten CLOud9-Zellen zu verdqueren, fügen Sie dem Kulturgericht eine Millimolar-ABA hinzu. Fügen Sie für Steuerelemente DMSO hinzu, und verwalten Sie dann die Zellen mit ABA oder DMSO für die Dauer des Experiments.
Um die Dimerisierung umzukehren, waschen Sie die Zellen mit genügend PBS, um die Oberfläche der Platte zweimal zu bedecken. Danach, Kulturzellen in ABA-freien Medien, um sie in einem undimerisierten Zustand zu halten. Die angemessene Verwendung des CLOud9-Systems induziert einen reversiblen Kontakt der komplementären CSA- und CSP CLOud9-Konstrukte durch das Hinzufügen oder Entfernen von ABA zu Zellkulturmedien.
Die CSA- und CSP-Konstrukte werden mithilfe von STANDARD-CRISPR-Führungs-RNAse in geeignete genomische Regionen lokalisiert. Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von quantitativer PCR wurde verwendet, um die genaue Lokalisierung bei der Ausrichtung jeder CLOud9-Komponente zu gewährleisten. Zusätzlich Koimmunpräzipation mit und ohne ABA verifiziertE CSA- und CSP-Dimerisierung in Gegenwart des Liganden sowie die Reversibilität in Abwesenheit des Ligands.
Nach der ABA-Dimerisierung wurde ein größerer Kontakt zwischen Beta-Globin und dem LCR durch Chromosomenbestätigungsaufnahme gemessen. Dies wurde jedoch in den Steuerelementen, die nur die CSA oder nur das CSP-Konstrukt enthalten, nicht beachtet. Durch die Erstellung der LCR-Beta-Globin-Wechselwirkung wurde der endogene LCR-Globinkontakt nicht vollständig eliminiert.
Es wurde nur dem ursprünglichen Kontakt hinzugefügt. Der Anstieg der Beta-Globin-LCR-Kontakte wurde durch 72 Stunden Dimerisierung beobachtet, unabhängig von der genauen Region innerhalb der zielgerichteten LCR oder der Beta-Globin-Promotorregion. Schließlich wurde die Reversibilität des Systems mit Chromosomenbestätigungsaufnahme nach Entfernung von ABA bestätigt.
Dies führte zur vollständigen Erneuerung der endogenen Bestätigung. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, medienzuwechseln und täglich frische, gedämpfte CLOud9-Transduced-Zellen hinzuzufügen. Vergessen Sie nicht, die Arbeit mit Lentivirus kann extrem gefährlich sein und alle Vorsichtsmaßnahmen bei BSL 2 verwendet werden, sollte immer bei der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.
