यह विधि हमें जीन अभिव्यक्ति से संबंधित प्रमुख सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है जो हमें दिखाता है कि क्रोमेटिन संरचना जीन अभिव्यक्ति को कैसे प्रभावित करती है और क्रोमेटिन संगठन ट्रांसक्रिप्शनल गतिशीलता को कैसे नियंत्रित करता है। हमने इस तकनीक को विकसित किया क्योंकि हम लंबी दूरी के क्रोमेटिन लूपिंग के निर्माण को सक्षम करने के लिए क्रोमोसोमल वास्तुकला को नियंत्रित करने में सक्षम होना चाहते थे। जबकि एक ही समय में अंतर्जात गुणसूत्र संरचना को बहाल करने के लिए क्रोमेटिन संदर्भ को रिवर्स करने की क्षमता है।
इस विधि को उपयोग में आसानी और व्यापक प्रयोज्यता के लिए डिज़ाइन किया गया था। हमने सिस्टम को अधिक व्यापक रूप से उपयोग करने की अनुमति देने के लिए एक गैर-विषाक्त डाइमराइजर के साथ-साथ dcas9 की ऑर्थोगोनल प्रजातियों का लाभ उठाया। हमने इस विधि को विकसित किया क्योंकि हम लंबे समय से चले आ रहे चिकन और अंडे के सवाल का जवाब देने में सक्षम होना चाहते थे कि क्या जीन अभिव्यक्ति गुणसूत्र वास्तुकला को begets या क्या गुणसूत्र संरचना जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की ओर जाता है ।
CRISPR-गाइड आरएनए दृश्यों और सेल संस्कृतियों के रखरखाव के डिजाइन पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित हैं। प्लास्मिड नक्शे और उपयोग किए गए प्राइमर वहां सूचीबद्ध हैं। बीएसएमबी1 के तीन माइक्रोलीटर के साथ लेंटीवायरल क्रिस्पर प्लाज्मिड के पांच माइक्रोग्राम मिलाकर प्लाज्मिड तैयारी शुरू करें क्षारीय फॉस्फेट के तीन माइक्रोलीटर 10x पाचन बफर के छह माइक्रोलीटर और डीटीटी के ताजा तैयार 100 मिलीमोलर के 0.6 माइक्रोलीटर।
कुल मात्रा को डबल आसुत पानी के 60 माइक्रोलीटर तक लाएं और मिश्रण को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें ताकि प्लाज्मिड को डाइजेस्ट और डी-फॉस्फोरलेट किया जा सके। फिर, जेल लूप प्लाज्मिड और डबल आसुत पानी में पचा हुआ प्लाज्मिड को शुद्ध करें। इसके बाद, गाइड आरएनए जोड़े के लिए एनीलिंग प्रतिक्रियाएं तैयार करें।
प्रत्येक गाइड आरएनए के एक माइक्रोलीटर को 10x T4 लिगेशन बफर के एक माइक्रोलीटर के साथ 10x T4 ligation बफर 6.5 माइक्रोलीटर डबल आसुत पानी और टी 4 पीएनके के 0.5 माइक्रोलीटर के कुल रिएक्शन वॉल्यूम के लिए मिलाएं। गाइड आरएनए जोड़े को अपने लक्ष्य दृश्यों के लिए 30 मिनट पर 37 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण को इनक्यूबेट करने के लिए और 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेशन के बाद फिर धीरे-धीरे तापमान को पांच डिग्री सेल्सियस प्रति मिनट तक कम करके 25 डिग्री सेल्सियस तक कम कर देता है। इसके बाद, डबल आसुत पानी में एक से दो सौ पर एनील्ड गाइड आरएनए को पतला करें।
अब, दो लिगेशन प्रतिक्रियाओं को तैयार करें। पचा हुआ प्लाज्मिड का एक माइक्रोलीटर एक पतला पेरिवनल गाइड आरएनई 2.5 माइक्रोलीटर के 0.5 माइक्रोलीटर के साथ मिलाएं 2x लिगेशन बफर एक माइक्रोलीटर डबल आसुत पानी का एक माइक्रोलीटर और लिगाज़ के 0.5 माइक्रोलीटर। गाइड BsmB1 पचा प्लाज्मिड को लिगेट करने के लिए 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें।
फिर नए लिगाटेड प्लाज्मिड को स्थिर तीन बैक्टीरिया में बदल ें और किसी भी प्लाज्मिड तैयारी विधि का उपयोग करके बैक्टीरिया को बढ़ाएं। एक छह अच्छी तरह से थाली पर, अच्छी तरह से, बीज 750, 000 2n3 DMEM में Tcells 10% FBS और 1% कलम स्ट्रेप के साथ. प्रत्येक निर्माण के लिए एक अच्छी तरह से उपयोग करें और 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
अगले दिन, 10% एफबीएस के साथ नए एंटीबायोटिक मुक्त-डीएमईएम के लिए माध्यम बदलें। चढ़ाया कोशिकाओं के प्रत्येक कुएं के लिए माध्यम बदलने के बाद सही Lentivirus उत्पादन मिश्रण की एक ट्यूब तैयार करते हैं । प्रत्येक प्रतिक्रिया के अनुसार, प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए ऑप्टी-एमईएम माध्यम के 150 माइक्रोलीटर के साथ लिपिड-बेस ट्रांसफैक्शन रिएजेंट के 11 माइक्रोलीटर को पतला करें।
फिर अलग-अलग ट्यूब में डीएनए तैयार करें। सीएलओडी 9 लेंटीविरायल वेक्टर प्लाज्मिड के दो माइक्रोग्राम को अन्य लेंटीविरायल पैकेजिंग घटकों के दो माइक्रोग्राम के साथ मिलाएं। ऑप्टी-एमईएम माध्यम के 150 माइक्रोलीटर में इस मिश्रण को पतला करें।
फिर पतला लिपिड-आधारित ट्रांसफैक्शन रिएजेंट में पतला लेंटिवायरल प्लाज्मिड मिश्रण की बराबर मात्रा को मिलाएं और कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए मिश्रण को इनक्यूबेट करें। फिर कोशिकाओं के प्रत्येक कुएं में तैयार मिश्रण की एक ट्यूब जोड़ें और इनक्यूबेशन जारी रखें। 48 घंटे बाद, वायरल उत्पादन मीडिया को प्लेट कुओं से शंकु में स्थानांतरित करें और उन्हें पांच मिनट के लिए 300 ग्राम पर नीचे स्पिन करें।
फिर पैलेट मलबे को त्यागने के लिए ताजा ट्यूबों में सुपरनेट स्थानांतरित करें। अब, तुरंत वायरल उत्पादन मीडिया का उपयोग करने के लिए लक्ष्य कोशिकाओं को स्थानांतरित या भविष्य के उपयोग के लिए ८० डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज । ब्याज के प्रत्येक वायरल निर्माण के 250 माइक्रोलीटर जोड़ने के साथ शुरू करें, जो इस मामले में, पूरक CLOud9 प्लाज्मिड्स को 80, 000 कोशिकाओं वाले 50 मिलीलीटर शंकु नली में शामिल है।
फिर पर्याप्त पॉलीब्रेन जोड़ें ताकि यह समाधान में एक और आठ माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के बीच हो। फिर एंटीबायोटिक-मुक्त मीडिया का उपयोग करके प्रत्येक ट्यूब में कुल मात्रा को एक मिलीलीटर में समायोजित करें। अब वायरस कणों और कोशिकाओं के बीच संपर्क बढ़ाने के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ८०० ग्राम पर कोशिकाओं स्पिन ।
फिर पाइपिंग करके सुपरनैट में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। इसके बाद, कोशिकाओं के निलंबन को संस्कृति प्लेटों पर लोड करें और उन्हें 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। अगले दिन, कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
उन्हें कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए 300 ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें और उन्हें सामान्य माध्यम में फिर से निलंबित करें। अगले दिन, दोगुना ट्रांसड्यूड कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए माध्यम में प्यूरोमाइसिन और हाइग्रोमाइसिन जोड़ें। एंटीबायोटिक की उचित एकाग्रता प्रत्येक सेल प्रकार के लिए अग्रिम में निर्धारित किया जाना चाहिए।
फिर, डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के साथ आगे बढ़ने से पहले कम से कम तीन दिनों के लिए चयन मीडिया में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें और कोशिकाओं और चयन मीडिया को बनाए रखने के लिए जारी रखें। CLOud9 चयनित और ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं को मंद करने के लिए संस्कृति पकवान में एक मिलीमोलर एबीए जोड़ें। नियंत्रण के लिए, DMSO जोड़ें, तो प्रयोग की अवधि के लिए ABA या DMSO के साथ कोशिकाओं को बनाए रखने ।
डामर को रिवर्स करने के लिए, प्लेट की सतह को दो बार कवर करने के लिए कोशिकाओं को पर्याप्त पीबीएस से धोएं। इसके बाद, एबीए-मुक्त मीडिया में संस्कृति कोशिकाओं को एक अविभाजित राज्य में बनाए रखने के लिए । CLOud9 प्रणाली का उचित उपयोग पूरक सीएसए और सीएसपी CLOud9 के रिवर्सिबल संपर्क को प्रेरित करता है जो सेल कल्चर मीडिया को एबीए के अलावा या हटाने के माध्यम से होता है।
सीएसए और सीएसपी का निर्माण मानक CRISPR गाइड आरएनईई का उपयोग करके उपयुक्त जीनोमिक क्षेत्रों में स्थानीयकृत हैं। मात्रात्मक पीसीआर के बाद क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिटेशन का उपयोग प्रत्येक CLOud9 घटक को लक्षित करने में सटीक स्थानीयकरण सुनिश्चित करने के लिए किया गया था। इसके अतिरिक्त, लिगामेंट की उपस्थिति में सीएसए और सीएसपी डामरीकरण के साथ-साथ लिगांड की अनुपस्थिति में रिवर्सिबिलिटी के साथ-साथ एबीए के साथ और बिना सीओइम्यूनोप्रिपिशन।
एबीए डामरीकरण के बाद, बीटा-ग्लोबिन और एलसीआर के बीच अधिक संपर्क गुणसूत्र पुष्टि कैप्चर द्वारा मापा गया था। हालांकि, यह या तो केवल सीएसए या केवल सीएसपी निर्माण युक्त नियंत्रण में नहीं देखा गया था। एलसीआर बीटा ग्लोबिन इंटरैक्शन बनाने से अंतर्जात एलसीआर ग्लोबिन संपर्क पूरी तरह खत्म नहीं हुआ।
यह केवल मूल संपर्क में जोड़ा गया। बीटा-ग्लोबिन एलसीआर संपर्कों में वृद्धि लक्षित एलसीआर या बीटा-ग्लोबिन प्रमोटर क्षेत्र के भीतर सटीक क्षेत्र की परवाह किए बिना ७२ घंटे के डिमराइजेशन के माध्यम से देखी गई । अंत में, एबीए को हटाने के बाद गुणसूत्र पुष्टि कैप्चर के साथ सिस्टम की रिवर्सिबिलिटी की पुष्टि की गई।
इसके परिणामस्वरूप अंतर्जात पुष्टि का पूर्ण नवीकरण हुआ। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, मीडिया को बदलने और हर रोज ताजा डिमराइज्ड CLOud9 ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं को जोड़ना याद रखना महत्वपूर्ण है। लेंटीवायरस के साथ काम करना न भूलें बेहद खतरनाक हो सकते हैं और बीएसएल 2 में उपयोग की जाने वाली सभी सावधानियां हमेशा इस प्रक्रिया को निष्पादित करते समय बरती जानी चाहिए।