Denna metod kan hjälpa oss att svara på viktiga frågor relaterade till genuttryck som visar oss exakt hur kromatinstruktur påverkar genuttryck och hur kromatinorganisation reglerar transkriptionsdynamik. Vi utvecklade denna teknik eftersom vi ville kunna controllably ändra kromosomal arkitektur för att möjliggöra skapandet av långväga kromatin looping. Medan samtidigt har förmågan att vända kromatin sammanhang för att återställa den endogena kromosomala strukturen.
Denna metod var utformad för enkel användning och bred tillämplighet. Vi drog fördel av en giftfri dimerizer samt ortogonala arter av dcas9 för att tillåta att systemet kan användas i vidare bemärkelse. Vi utvecklade denna metod eftersom vi ville kunna svara på den långvariga kyckling-och-ägget frågan om genuttryck föder kromosomal arkitektur eller om kromosom struktur leder till förändringar i genuttryck.
Utformning av CRISPR-guide RNA-sekvenserna och underhållet av cellkulturerna beskrivs i textprotokollet. Plasmid kartor och primers utnyttjas är listade där i. Påbörja beredningen av plasmid genom att blanda fem mikrogram av lentiviral CRISPR plasmid med tre mikroliter av BsmB1 tre mikroliter av alkaliska fosfatas sex mikroliter av 10x matsmältningsbuffert och 0,6 mikroliter av nyberedda 100 milliar DTT.
Ta den totala volymen till 60 mikroliter av dubbelt destillerat vatten och inkubera blandningen vid 37 grader celsius i 30 minuter för att smälta och de-fosforylera plasmiden. Sedan, gel rena smält plasmid i slingan plasmid och dubbel destillerat vatten. Därefter förbereda glödgning reaktioner för guide RNA-par.
Kombinera en mikroliter av varje guide-RNA vid 100 mikromolar med en mikroliter av 10x T4-ligationsbuffert 6,5 mikroliter av dubbelt destillerat vatten och 0,5 mikroliter T4 PNK för en total reaktionsvolym på 10 mikroliter. För att glödga RNA-paret till deras målsekvenser inkuberar blandningarna vid 37 grader celsius vid 30 minuter följt av en inkubation vid 95 grader celsius i 5 minuter och sedan gradvis minska temperaturen till 25 grader celsius genom att minska den med fem grader celsius per minut. Därefter späd den glödgade guiden RNAs på ett till två hundra i dubbelt destillerat vatten.
Förbered nu de två ligeringsreaktionerna. Blanda en mikroliter av den smälta plasmiden med 0.5 microliters av en utspädd perivanealen vägleder RNAse 2.5 microliters av 2x ligationbuffert en microliter av dubbel destillerat bevattnar och 0.5 microliters av ligase. Inkubera reaktionerna i rumstemperatur i 10 minuter för att ligate guiderna BsmB1 smält plasmid.
Omvandla sedan den nyligen ligerade plasmiden till stabila tre bakterier och förstärka bakterierna med någon plasmidberedningsmetod. På en sex-brunns platta, per brunn, frö 750, 000 2n3 Tcells i DMEM med 10%FBS och 1%pen strep. Använd en brunn för varje konstruktion och inkubera cellerna i 24 timmar.
Nästa dag, ändra medium till färsk antibiotika fri-DMEM med 10%FBS. Direkt efter byte av medium för varje brunn av pläterade celler förbereda ett rör av Lentivirus produktionsblandning. Per varje reaktion, späd 11 mikroliter av lipid-bastransfektionsreagens med 150 mikroliter av Opti-MEM-mediet för varje reaktion.
Sedan i separata rör förbereda DNA. Kombinera två mikrogram av CLOud9 lentiviral vektorplasmid med två mikrogram av de andra lentivirala förpackningskomponenterna. Späd denna blandning i 150 mikroliter av Opti-MEM-mediet.
Kombinera sedan lika stora volymer av den utspädda lentivirala plasmidblandningen i det utspädda lipidbaserade transfektionsreagensen och inkubera blandningarna i fem minuter i rumstemperatur. Sedan till varje brunn av celler lägga ett rör av de beredda blandningarna och fortsätta inkubationen. 48 timmar senare, överföra viral produktion media från plattan brunnar i koniska och snurra ner dem på 300 g i fem minuter.
Överför sedan supernatanten till färska rör för att kasta det pelleterade skräpet. Nu, omedelbart använda viral produktion media för att transduce målcellerna eller frysa den på 80 grader celsius för framtida bruk. Börja med att lägga till 250 mikroliter av varje viral konstruktion av intresse, som i detta fall består av kompletterande CLOud9 plasmider till en 50 milliliter koniska rör som innehåller 80, 000 celler.
Tillsätt sedan tillräckligt med Polybrene så att det är mellan ett och åtta mikrogram per milliliter i lösning. Justera sedan den totala volymen i varje rör till en milliliter med hjälp av antibiotikafria medier. Nu för att öka kontakten mellan viruspartiklarna och cellerna snurra cellerna på 800 g i 30 minuter vid rumstemperatur.
Sedan åter upphäva cellerna vid supernatanten genom pipettering. Därefter laddar cellernas suspension på odlingsplattor och inkubera dem i 24 timmar. Följande dag, samla in cellerna.
Centrifugera dem på 300 g i fem minuter vid rumstemperatur och åter upphäva dem i normal medium. Nästa dag, tillsätt puromycin och hygromycin till mediet för att välja för dubbelt transduced celler. Lämplig koncentration av antibiotikum bör bestämmas i förväg för varje celltyp.
Sedan, inkubera cellerna i urvalsmediet i minst tre dagar innan du fortsätter med nedströms applikationer och fortsätta att behålla cellerna och urvalsmedia. För att dimerize den CLOud9 valda och transduced celler lägga till en millimolar ABA till odlingsrätten. För kontroller, lägg till DMSO, sedan behålla cellerna med ABA eller DMSO under den tid som experimentet.
För att vända dimerisering, tvätta cellerna med tillräckligt PBS för att täcka ytan av plattan två gånger. Därefter, kultur celler i ABA-fria medier för att upprätthålla dem i en ofördunkad tillstånd. Lämplig användning av CLOud9-systemet inducerar reversibel kontakt av de kompletterande CSA och CSP CLOud9 konstruktioner genom tillägg eller avlägsnande av ABA till cellkultur media.
CSA- och CSP-konstruktionerna är lokaliserade till lämpliga genomiska regioner med hjälp av standard-CRISPR-guide RNAse. Kromatin immunprecipitation följt av kvantitativa PCR utnyttjades för att säkerställa den exakta lokalisering i inriktning av varje CLOud9 komponent. Dessutom coimmunoprecipation med och utan ABA verifierade CSA och CSP dimerization i närvaro av liganden samt reversibiliteten i avsaknad av liganden.
Efter ABA dimerization, större kontakt mellan beta-globin och LCR mättes av kromosom bekräftelse fånga. Detta observerades dock inte i kontrollerna som innehåller antingen endast CSA eller endast CSP-konstruktionen. Skapa LCR beta-globin interaktion inte helt eliminera endogena LCR globin kontakt.
Det bara läggas till den ursprungliga kontakten. Den ökade i beta-globin LCR kontakter observerades genom 72 timmar dimerization oavsett den exakta regionen inom den riktade LCR eller beta-globin promotorn regionen. Slutligen, reversibiliteten av systemet bekräftades med kromosom bekräftelse fånga efter att ha tagit bort ABA.
Detta resulterade i en fullständig förnyelse av den endogena bekräftelsen. Samtidigt försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att byta media och lägga till färska dimerized CLOud9 transduced celler vardagen. Glöm inte att arbeta med lentivirus kan vara extremt farligt och alla försiktighetsåtgärder som används vid BSL 2 bör alltid vidtas när du utför denna procedur.