Name: quantification of intracellular growth inside macrophages is a fast and reliable method for assessing the virulence of leishmania parasites
Uploaded: 2018-03-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites at JoVE.com

وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة منحة RO1 AI067979 نوا. يك هو المتلقي للزمالات الجامعية من هوارد هيوز الطبي معهد/جامعة "ماريلاند كوليدج بارك".

أقرت إياكوك من جامعة ميريلاند في جميع الإجراءات التجريبية وأجريت وفقا للتوصيات الواردة في الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية "المعاهد الوطنية للصحة". كافة الخطوات الموضحة في الأقسام من 1 إلى 4 وينبغي أسيبتيكالي داخل خزانات الاندفاق الصفحي البيولوجية. ينبغي أن تستخدم الحماية الشخ...

البيانات الكمية المنتجة بفحص الإصابة بم الموصوفة أعلاه، يسمح للمحققين الحصول على معدلات الإصابة وتحديد التغيرات في خصائص الفوعة موثوق بها في فترة زمنية قصيرة نسبيا (الحد الأقصى 2 أسابيع، مقارنة إلى 2 أشهر المطلوبة لإجراء تجارب عليها في فيفو ). ويعتمد هذا الأسلوب على صبغ الحمض النووي م...

داء الليشمانيات يشير إلى طائفة واسعة من الأمراض البشرية التي تسببها الأنواع الطفيليات الأوالي من جنس الليشمانيا. ما يقرب من 12 مليون شخص مصابون حاليا الليشمانيا في جميع أنحاء العالم، وأكثر من 350 مليون معرضة للخطر. باثولوجيا المرض يعتمد على الأنواع الليشمانيا وعوامل المضيف، وأعراض تختلف من آفات الجلد الشفاء الذاتي حميدة إلى أشكال فيسسيراليزينج الفتاكة. إذا كان داء الليشمانيات الحشوي غير المعالجة، وفادح، الترتيب إلا بعد الملاريا كأشد الأمراض فتكاً البشرية الناجمة عن العدوى مع بروتوزوا1. وعلى الرغم من الاختلافات الواسعة النطاق في علم الأمراض الأمراض والأعراض، يكون جميع الأنواع الليشمانيا دورة حياة ديجينيك بالتناوب بين مراحل بروماستيجوتي وأماستيجوتي داخل الحشرات والفقاريات المضيفين، على التوالي. داخل الفقاريات، ليشمانيا استهداف الضامة المضيف للغزو والحث على تشكيل باراسيتوفوروس فاكوليس (PVs)، المقصورات الحمضية مع خصائص فاجوليسوسوميس فيها تكرار النماذج أماستيجوتي ضراوة شديدة. Amastigotes تستمر في أنسجة المضيف أثناء الالتهابات المزمنة ويمكن تمرير ويلكم إلى الأمام لمصابه، استكمال دورة انتقال. ولذلك، في سياق التنمية البشرية من المرض، amastigotes هي دورة حياة الليشمانيا أهم نموذج2. التحقيق في كيفية تكرار amastigotes داخل بلعم PVs أمر بالغ الأهمية لفهم ليشمانيا الفوعة3،،من45،،من67 تطوير العلاجات الناجعة الرواية.
يصف لنا هنا أسلوب يستخدم بانتظام لدينا مختبر لدراسة ليشمانيا العدوى وتكرارها في المشتقة من نخاع العظم الضامة (بنغلادش)، الذي ينطوي على تقييم كمي لعدد داخل الخلايا ليشمانيا على مر الزمن. وتنطوي العملية على حصاد وحيدات من نخاع العظام الماوس والتمايز الضامة في الثقافة، والعدوى في المختبر مع أشكال المعدية (بروماستيجوتيس ميتاسيكليك أو amastigotes) الليشمانيا والتحديد الكمي عدد الطفيليات داخل الخلايا في كل فاصل زمني 24 ساعة لمدة 72-96 ساعة بعد الإصابة. وقد استخدمت هذا التحليل في المختبر لتحديد تأثير عدد من العوامل البيئية والجينات الطفيلي، بما في ذلك تحديد الدور الحاسم للحديد في النهوض بضراوة أمازونينسيس L. كذلك التحقق من صحتها قبل قاطع الدراسات الإنمائية الآفة في الفئران6،،من89،10،11،،من1213،14،15 . منذ إنشاء جميع أنواع الليشمانيا المسببة للأمراض مكانها replicative داخل الضامة المضيف، يمكن استخدام هذا التحليل عالمياً لقرارات الفوعة في جميع الأنواع الليشمانيا .
أداء التهابات بم يسمح تحليل تفاعلات الطفيلي المضيف على مستوى الخلية الواحدة، وبالتالي فهم أكثر شمولاً لكيفية تفاعل طفيليات الليشمانيا مع بهم المكروية المضيف المفضل، PVs الضامة. استخدمت بلعم فحوصات الإصابة بنجاح قبل عدة مجموعات16،17،18،19،20،،من2122 لاستكشاف وظائف بلعم المضيف و ليشمانيا جينات محددة، ومشاركتها المحتملة في التفاعل المعقد الذي يميز العدوى داخل الخلايا. التهابات بم تسمح للتقدير الكمي لنمو الطفيلي كقراءة تأثير العوامل المضيفة التي تؤثر على البقاء داخل الخلايا، مثل إنتاج أكسيد النيتريك المبيدة وتوليد الأنواع الأكسجين التفاعلية وغيرها من الظروف المعاكسة واجه داخل PVs يحلول تشبه23. كما استخدمت بلعم فحوصات الإصابة لتحديد إمكانية اللايشماني مكافحة المخدرات يؤدي للتنمية العلاجية13،24.
طبيعة الإصابات بم في المختبر يوفر العديد من المزايا عبر طرق أخرى لتقييم ليشمانيا ضراوة. ومع ذلك، العديد من الدراسات السابقة دراسة آليات لبقاء الطفيليات داخل الخلايا مع مرور الوقت لا كمياً الإصابة بمعدل20،،من2124. وعلاوة على ذلك، العديد من الدراسات التي تركز على أثر الإصابات في فيفو على مر الزمن فعلت ذلك بقياس حجم الآفة الجلدية والأعراض الفسيولوجية الأخرى التي تتصل بشكل غير مباشر فقط الطفيلي النسخ المتماثل25،26 , 27-العدوى في فيفو نهجاً صارمة لتقييم الفوعة الطفيلي، ولكن قياسات حجم الآفة استناداً إلى قاطع تورم وحدها غالباً ما تكون غير كافية، كما أنها تعكس استجابة التهاب في الأنسجة المصابة ولا العدد المطلق للطفيليات. ولهذا السبب، قاطع الآفة التنمية فحوصات يجب أن يكون متبوعاً التحديد الكمي للتحميل الطفيلي في الأنسجة المصابة، وهو إجراء يتطلب إضعاف الحد مطولة فحوصات28. بالإضافة إلى ذلك، دراسات في فيفو غالباً ما تنطوي على التضحية بالحيوانات متعددة في نقاط مختلفة في الوقت المناسب لانتزاع الأنسجة لفائدة6،،من89،10، 11 , 13-على النقيض من ذلك، يمكن الحصول على إعداد كبيرة من بنغلادش من الحيوان واحدة فقط، ويمكن أن يكون مطلي بهذه الخلايا في ظل الظروف التي تسمح بتقييم الإصابة في نقاط مختلفة في الوقت المناسب. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع دراسات في فيفو ، أداء في المختبر العدوى بم يسمح سيطرة أكبر على الظروف التجريبية. التحديد الكمي الضامة تصاب جنبا إلى جنب مع الطفيليات نفسها يتيح مراقبة دقيقة لتعدد العدوى (وزارة الداخلية) وشروط الثقافة. يمكن التحكم الجيد في هذه العوامل الرئيسية في تحديد الخصائص للمسارات الخلوية المنفصلة وفهم تأثيرها على مسار العدوى.
ونظرا لهذه المزايا، فمن الدهشة أن مجموعات قليلة جداً دراسة الفوعة ليشمانيا اتخذت حتى الآن الاستفادة الكاملة من التقييم الكمي للنسخ المتماثل داخل الخلايا في الضامة. في هذه المقالة، نحن نناقش المزالق الشائعة التي قد تعوق استخدام أوسع نطاقا لهذا الفحص، ويوفر بروتوكول خطوة بخطوة لتسهيل التنفيذ السليم. النظر دقة وبراعة، المقايسة الإصابة بم يصف لنا هنا يمكن ليس فقط استخدامها لاستكشاف التفاعلات المضيف الممرض التأثير ليشمانيا الفوعة، ولكن أيضا لدراسة الكائنات المجهرية الأخرى التي النسخ المتماثل داخل الضامة29. الأهم من ذلك، يمكن أيضا تطوير هذا الفحص كأسلوب فحص السريري قبل سريعة واقتصادية للتنمية اللايشماني مكافحة المخدرات.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC147440250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 &#956;L)</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-707-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10</td>
			<td>Aspen Surgical</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precisionglide Needle, 25G&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>627 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Flask</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses: 12 mm circles</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Biotin</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>C272-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol 200 proof</td>
			<td>Pharmco-AAPER</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>1500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll400</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Texas red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry Co. LTD</td>
			<td>H0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoton II Diluent</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>43368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (-/-)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14200166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Lamp-1 antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert Bright-Line&#160; Hemocytometer&#160;</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 Surfactant</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TX1568-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Scissors, 4 1/2&#34;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps, Fine Tip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605699</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of intracellular growth inside macrophages is a fast and reliable method for assessing the virulence of leishmania parasites

دورة حياة الليشمانيا، المسبّب لداء الليشمانيات، التبديل بين المراحل بروماستيجوتي وأماستيجوتي داخل الحشرة والمضيفين الفقارية، على التوالي. بينما يمكن أن تختلف الأعراض المسببة لداء الليشمانيات على نطاق واسع، من آفات جلدية حميدة لأشكال المرض الحشوي فادح جداً تبعاً للأنواع المعدية، جميع أنواع الليشمانيا يقيمون داخل الضامة المضيف أثناء مرحلة الفقاريات حياتها. ليشمانيا العدوى ولذلك ارتباطاً مباشرا بقدرته على غزو، والبقاء على قيد الحياة وتكرارها داخل فاكوليس باراسيتوفوروس (PVs) داخل الضامة. وهكذا، تقييم قدرة الطفيليات تكرار إينتراسيلولارلي يخدم كوسيلة يمكن الاعتماد عليها لتحديد ضراوة. دراسة تطوير داء الليشمانيات باستخدام نماذج حيوانية مضيعة للوقت وشاقة وغالباً ما تكون صعبة، لا سيما مع أشكال الحشوي باثوجينيكالي الهامة. يصف لنا هنا منهجية لمتابعة تطور ليشمانيا داخل الخلايا في نخاع العظام المستمدة الضامة (بنغلادش). أرقام الطفيليات داخل الخلايا مصممون على فترات ح 24 عن ح 72-96 بعد الإصابة. يسمح هذا الأسلوب لتحديد آثار مختلف العوامل الوراثية في الفوعة ليشمانيا موثوق بها. على سبيل مثال، نعرض كيفية حذف اليل واحد من الجينات ليشمانيا Mitochondrial الحديد الناقل (LMIT1) يضعف قدرة سلالة متحولة ليشمانيا أمازونينسيس LMIT1/ΔLmit1 تنمو داخل بنغلادش، مما يعكس انخفاض حاد في الفوعة بالمقارنة إلى البرية من نوع. كما يسمح هذا الفحص مراقبة دقيقة للظروف التجريبية، التي يمكن التلاعب بها على حدة لتحليل تأثير العوامل المختلفة (المواد الغذائية، والأنواع الأكسجين التفاعلية، إلخ.) على التفاعل الممرض المضيف. ولذلك، التنفيذ المناسب والتحديد الكمي للدراسات الإصابة بم توفير بديل غير الغازية، والسريع، واقتصادا، ومأمونة وموثوقة للدراسات النموذجية الحيوانية التقليدية.

ليشمانيا بشكلين المعدية-بروماستيجوتيس ميتاسيكليك التي تميز من بروماستيجوتيس بروسيكليك في المرحلة ثابتة للثقافة، و amastigotes، وهي مراحل داخل الخلايا (الشكل 1). في بعض الأنواع الليشمانيا مثل ل. أمازونينسيس، amastigotes يمكن أيضا أن تكون متباينة في ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites at JoVE.com

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

يقيم جميع الأنواع الليشمانيا المسببة للأمراض وتكرارها داخل الضامة مضيفيهم الفقاريات. نقدم هنا، بروتوكولا لتصيب موريني الضامة المشتقة من نخاع العظام في الثقافة مع ليشمانيا، متبوعاً بالقياس الكمي الدقيق لحركية النمو داخل الخلايا. يعد هذا الأسلوب مفيداً لدراسة العوامل الفردية التأثير على التفاعل المضيف الممرض وضراوة الليشمانيا .

التحديد الكمي "النمو داخل الخلايا داخل الضامة" هو سريع وطريقة يمكن الاعتماد عليها لتقييم الفوعة طفيليات الليشمانيا

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

The overall goal of this experiment is to assess the virulence of various Leishmania strains through the infection of murine bone marrow-derived macrophages in vitro, and the subsequent quantification of parasite intracellular growth kinetics. This method can help us answer key questions about the factors from both the host's macrophage and the pathogen that determine the virulence of the infective Leishmania parasites. The main advantage of this technique is that it is a fast, economic, and reliable method that require significantly fewer animals, compared to in vivo studies.The implications of this technique extend toward the therapy of Leishmaniasis, as it can be used to assess the infectivity of mutated Leishmania strains, or the efficacy of therapeutic compounds. Visual demonstration of this method is critical, as the bone marrow-derived macrophage isolation and intracellular parasite quantification steps are difficult to learn from written protocols alone. Begin by securing a four to six week old female mouse to a dissection board, and disinfecting the animal with 70%ethanol.Use scissors to make a one centimeter incision near one hip joint and cut the skin all the way around the joint. Pull the skin from the leg toward the ankle to carefully deglove the limb, and cut off the foot at or below the ankle joint to leave the tibia in tact. To locate the hip joint, manipulate the femur to identify the point of rotation, and use the scissors to sever the leg above the hip joint, leaving the proximal head of the femur in tact.Remove as much muscle and connective tissue from the leg as possible, and place the cleaned bones in Petri dish containing sterile RPMI supplemented with antibiotics on ice. After harvesting the second set of leg bones, use sterilized forceps and a number ten blade to remove any remaining muscle and connective tissue. Transfer the cleaned bones to an empty Petri dish lid, and use the scalpel to remove both ends of each tibia to access the marrow.Using forceps, place one tibia over the mouth of a 50 milliliter conical tube on ice, and insert the tip of a 25 gauge needle attached to a 10 milliliter syringe filled with mediums supplemented with antibiotics into one end of the tibia. Flush approximately five to 10 milliliters of medium through the bone into the conical tube until all of the red bone marrow tissue has been harvested and the bone appears white. When all of the marrow has been collected, centrifuge the pooled bone marrow, and re-suspend the bone marrow cell palette in five milliliters of bone marrow-derived macrophage medium.Transfer the bone marrow cell suspension into a 175 square centimeter cell culture flask containing 60 milliliters of sterile bone marrow-derived macrophage medium, and rinse the tube two times with medium from the culture flask to ensure maximal cell recovery. After the second wash, transfer a 30 milliliter aliquot of cells into a second 175 square centimeter cell culture flask, and close each flask with a filter cap. Then, incubate both cultures overnight at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide to allow separate of the resident macrophages from any contaminating fibroblasts or other adherent cells.The next morning, transfer 10 milliliters of undifferentiated bone marrow cell-containing supernatant from each flask into individual 100 by 15 millimeter non-tissue culture treated polystyrene Petri dishes, and return the cells to the cell culture incubator for two to three more days. Then, feed the cultures with five milliliters of fresh 37 degree Celsius bone marrow-derived macrophage medium per dish, and return the plates to the incubator. On day seven or eight after culture, use an aspirating tip fitted to a vacuum line to transfer four autoclave sterilized 12 millimeter glass cover slips to the bottom of each well of a six well culture plate without overlapping.Prepare identical plates for each time points of the experiment. Next, wash the bone marrow-derived macrophage cultures two times with fresh 37 degree Celsius PBS and five milliliters of PBS without calcium and magnesium supplemented with one millimolar EDTA to each plate. After five minutes at 37 degrees Celsius, pool the detached cells in a 50 milliliter conical tube, rinsing each plate two times with an additional five milliliters of PBS without calcium and magnesium.After centrifugation, re-suspend the macrophages in five to 10 milliliters of fresh bone marrow-derived macrophage medium on ice. After counting, dilute the cells to five time 10 to the fifth per milliliter concentration in fresh bone marrow-derived macrophage medium, and add two milliliters of cells per well to the six well plate. Then, incubate the cells overnight in the cell culture incubator.To infect the cells with L.amazonesis, dilute the parasite suspension to the appropriate experimental multiplicity of infection, and add 50 to 100 microliters of parasites to each well of all six well plates, including all time points of the experiment. Incubate the bone marrow-derived macrophages for the appropriate infection period and temperature. Then, wash the wells three times with two milliliters of fresh 37 degree Celsius PBS without calcium or magnesium per well, and fix the initial time point samples with 1.5 to 2 milliliters of 2%paraformaldehyde for 10 minutes.For the plates corresponding to the later time points, add two milliliters of fresh bone marrow-derived macrophage medium to each well, and return the plates to the appropriate incubator. Then, fix and wash the cells for each of the remaining time point, as just demonstrated, and store the samples at four degrees Celsius in fresh PBS. To stain the cells with DAPI, replace the supernatant with 1.5 milliliters of fresh PBS without calcium and magnesium, supplemented with 0.1%non-ionic detergent for 10 minutes at room temperature, followed by three two milliliter washes with PBS without calcium or magnesium.Next, stain the cells with two micrograms per milliliter of DAPI in one milliliter of PBS for one hour at room temperature. After three washes, place the cover slips cell side down onto individual glass microscope slide mounted with a commercially anti-fade mounting reagent. Then, to quantify the number of infected cells, use the 100x emersion oil objective of a fluorescence microscope and a manual counter to identify the number of smaller amastigote nuclei clustered around each large DAPI stained nucleus.Leishmania has two infective forms, metacyclic promastigotes, which differentiate from procyclic promastigotes at the stationary phase of culture, and amastigote, the intracellular infective form found within the vertebrate host. Here, axenically differentiated amastigotes can be visualized within a bone marrow-derived macrophage one hour after the initial infection and before the formation of parasitophorous vacuoles via phagolysosomal fusion. At 48 hours, distinct large parasitophorous vacuoles harboring multiple parasites can be observed, characteristic of a virulent Leishmania infection.Non-virulent log phase promastigotes, in contrast, are unable to initiate parasitophorous vacuole development, fail to replicate, and are eventually killed within host macrophages. In this experiment, a steady increase in the number of intracellular wild type metacyclic Leishmania parasites was observed up to 72 hours after infection, while little to no intracellular growth for mutant parasites with a impaired mitochondrial iron import was measured, suggesting that mitochondrial activity is required for parasite growth within macrophages. Macrophage infections carried out with wild type and mutant axenic amastigotes showed an intracellular growth pattern similar to that observed with metacyclic promastigotes, but with an even higher wild type parasite infectivity than seen from metacyclic promastigotes.It is important to note that there is an initial 24 hour delay for metacyclic promastigote infections, representing the time required for internalized metacyclic promastigotes to first differentiate into amastigotes before beginning to replicate. Once mastered, this technique can be completed in 15 days if it is performed properly. While attempting this procedure, it's important to use the appropriate mouse strains and to perform careful quantification of both the macrophage and parasite cells to ensure consistent MOIs across all experiments.After watching this video, you should have a good understanding of how to culture bone marrow-derived macrophages and to infect them with Leishmania for quantification of their intracellular parasite growth, following nuclear staining with DAPI. Don't forget that working with Leismania can be extremely hazardous, and that precautions, such as using a biological safety cabinet, and personal protective equipment, and avoiding sharp instruments should always be taken while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

في الجسم الحي التصوير الطفيليات الليشمانية المعدلة وراثيا في مضيف لايف

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

بروتوكول للانتاج من الصليب الوراثية للطفيليات الملاريا القوارض

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A الفحص الإنقاذ والتحول لفحص مضاد الليشمانيات الطفيلي داخل الخلايا ضد<em&gt; الليشمانيا الدونوفانية</em&gt; Amastigotes في THP1 الحادة اللوكيميا الإنسان الوحيدات الخط الخليوي

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

فحص فينوطيبيك مجهري للقياس الكمي للبكتيريا الفطرية داخل الخلايا المكيفة للفحص عالي الإنتاجية/عالي المحتوى

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

رصد الجمعية ليفرز البكتيرية الفوعة عن طريق عامل يشابك بمواقع محددة

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag: عالية الإنتاجية الكمي لمستعمرة النمو والفارق الزمني

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

تطبيق نظام التعبير محرض لدراسة التدخل من العوامل البكتيرية الفوعة مع اشارة بين الخلايا

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

تحديد "علامات الفوعة" بكتريا أبسسيسوس "النسخ المتماثل داخل الخلايا" في البالعات

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

في Vivo العدوى مع الأمازون الليشمانيا لتقييم الفش الطفيلي في الفئران

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...