Name: gene-targeted random mutagenesis to select heterochromatin-destabilizing proteasome mutants in fission yeast
Uploaded: 2018-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast at JoVE.com

このプロジェクトの支援の資金調達は、基本的な科学研究開発プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 科学省と ICT (2016R1A2B2006354) によって資金を供給によって提供されました。

1. 媒体の作製
<ol><li>準備酵母エキス サプリメント (はい)、はいアデニン (はい低 Ade)、酵母のグルタミン酸媒体 (PMG12) および PMG なしアデニン (PMG Ade) なしの表 1に示すようにコンポーネントを混合することによって。はいエイド (低 Ade) と PMG Ade プレートがすべての同じコンポーネント、アデニンを後者から省略すると。<ol>
<li>次の塩 (50 x) ストックを使用: 52.5...

<ol>
	<li>Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+model+of+error-prone+PCR.">A general model of error-prone PCR.</a> J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).</li><li>Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+induced+by+ultraviolet+light.">Mutations induced by ultraviolet light.</a> Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).</li><li>Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+analysis+of+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods Enzymol. 194, 795-823 (1991).</li><li>Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+evolution+of+novel+traits+in+microorganisms.">Rapid evolution of novel traits in microorganisms.</a> Appl Environ Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).</li><li>Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+DNA+shuffling+works.">How DNA shuffling works.</a> Science. 293 (5528), 237 (2001).</li><li>Sahu, P. P., Sharma, N., Puranik, S., Chakraborty, S., Prasad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+26S+Proteasome+subunit+RPT4a+regulates+ToLCNDV+transcription+and+activates+hypersensitive+response+in+tomato.">Tomato 26S Proteasome subunit RPT4a regulates ToLCNDV transcription and activates hypersensitive response in tomato.</a> Sci Rep. 6, 27078 (2016).</li><li>Xu, Q., Singer, R. A., Johnston, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sug1+modulates+yeast+transcription+activation+by+Cdc68.">Sug1 modulates yeast transcription activation by Cdc68.</a> Mol Cell Biol. 15 (11), 6025-6035 (1995).</li><li>Bhat, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+19S+proteasome+ATPase+Sug1+plays+a+critical+role+in+regulating+MHC+class+II+transcription.">The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription.</a> Mol Immunol. 45 (8), 2214-2224 (2008).</li><li>Chang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Gal4+activation+domain+binds+Sug2+protein,+a+proteasome+component,+in+vivo+and+in+vitro.">The Gal4 activation domain binds Sug2 protein, a proteasome component, in vivo and in vitro.</a> J Biol Chem. 276 (33), 30956-30963 (2001).</li><li>Ekwall, K., Cranston, G., Allshire, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fission+yeast+mutants+that+alleviate+transcriptional+silencing+in+centromeric+flanking+repeats+and+disrupt+chromosome+segregation.">Fission yeast mutants that alleviate transcriptional silencing in centromeric flanking repeats and disrupt chromosome segregation.</a> Genetics. 153 (3), 1153-1169 (1999).</li><li>Grewal, S. I., Jia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+revisited.">Heterochromatin revisited.</a> Nat Rev Genet. 8 (1), 35-46 (2007).</li><li>Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Forsburg Lab Recipes: Fission Yeast Media. , (2011).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> QIAquick PCR Purification Kit. , (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> pBlueScript II Vector. , (2005).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> QIAquick Gel Extraction Kit. , (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> QuickGene SP Kit Plasmid Kit II (SP-PL2). , (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase. , (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Gibson Assembly Master Mix. , (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GeneMorph II Random Mutagenesis Kits. , (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plasmid Plus Midi Kit. , (1999).</li><li>Bahler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).</li><li>Szewczyk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+PCR+and+gene+targeting+in+Aspergillus+nidulans.">Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3111-3120 (2006).</li><li>Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fission Yeast Handbook. , (2000).</li><li>Seo, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+19S+proteasome+is+directly+involved+in+the+regulation+of+heterochromatin+spreading+in+fission+yeast.">The 19S proteasome is directly involved in the regulation of heterochromatin spreading in fission yeast.</a> J Biol Chem. , (2017).</li><li>Tang, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterisation+of+temperature+sensitive+mutants+of+genes+encoding+the+fission+yeast+spindle+pole+body.">Generation and characterisation of temperature sensitive mutants of genes encoding the fission yeast spindle pole body.</a> PeerJ Preprints. 5, e3377v3371 (2017).</li><li>Rasooly, A., Weisz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+antibacterial+activities+of+phloxine+B+and+other+halogenated+fluoresceins+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus.">In vitro antibacterial activities of phloxine B and other halogenated fluoresceins against methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (11), 3650-3653 (2002).</li><li>Wilson, D. S., Keefe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+mutagenesis+by+PCR.">Random mutagenesis by PCR.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2001).</li></ol>

エラーを起こしやすい PCR によってランダムな突然変異は、特定の地域の突然変異体の多様なプールを生成するための強力なツールです。この手法は、特定の状況下でのタンパク質の機能を査定しようとする研究の場合に特に便利です。たとえば、我々 はここヘテロクロマチン メンテナンスで、Rpt4、19 秒プロテアソーム サブユニットの機能を評価するためにエラーを起こしやすい PCR を使?...

順遺伝学は、研究者が特定の表現型を表示する自然発生する突然変異体を求めるし、遺伝学的解析を行う古典的な方法です。逆遺伝学の興味の遺伝子に突然変異を導入し、表現型を検討します。後者の場合、ターゲット遺伝子のランダムな変異は突然変異体感温性などの所望の表現型を選択、その後または酵素活性の変更のプールを生成するよく使用されます。エラーを起こしやすい PCR1を含むランダムな突然変異の誘発を達成するために様々 な方法を使用する場合があります。UV 照射2;亜硝酸3; メタンスルホン酸エチル (EMS) などの化学変異原物質mutD5 4の発現などの一時的なミューテーター系統の使用DNA シャフリング5。
ここでは、分裂酵母のターゲット遺伝子の突然変異体のプールを生成するエラーを起こしやすい PCR を利用逆遺伝学的方法をについて説明します。1 つは、その名前から推測かもしれない、この方法意図的に PCR の間にエラーが発生して突然変異を生成します。他の突然変異誘発の方法とは異なりエラーを起こしやすい PCR はある突然変異誘発する領域を定義するユーザーをことができます。これにより、目的のタンパク質/ドメインの機能を勉強する努力に特に役立ちます。
このランダム変異導入手順を示すためには、我々 ここrpt4 +を使用分 19 秒プロテアソームのサブユニットをエンコードし、例として。Rpt4 分裂酵母6,7,8,9, 以外の生物のタンパク質分解に依存しない機能を持っている示されている、タンパク質分解の欠陥の原因タンパク質を変えることによって間接効果レベル。我々 は、したがって、ヘテロクロマチンのプロテアソームの機能の調査の目標の分解に依存しない変更を引き起こした突然変異体のスクリーニングします。
エラーを起こしやすい PCR プライマーのバインド場所をチューニングすることによって遺伝子領域に適用できます。目的の表現型変更を示す変異体は、適切な記者と識別できます。ここでは、我々 は挿入、 ade6 +記者を利用、セントロメア 1 外側を繰り返す (otr) 地域10。11この地域では、構成のヘテロクロマチンを形成すると、野生型条件でade6 +記者を黙らせたのでこれは、赤色のコロニー10で示されます。動原体で構成のヘテロクロマチンを不安定化突然変異は、白人の植民地として可視化ade6 +記者、発現に します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="825">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">1. Media</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Glucose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270-10KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:155px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">212720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:155px;">JUNSEI</td>
			<td style="width:119px;">87070-0310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Adenine sulfate</td>
			<td style="width:155px;">ACR</td>
			<td style="width:119px;">16363-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Uracil&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">L-Histidine</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">1.05108.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">NaCl</td>
			<td style="width:155px;">JUNSEI</td>
			<td style="width:119px;">19015-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">MgSO4&#8226;7H2O</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">63140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">CaCl2</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">12095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Potassium phthalate</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6758-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Inositol</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I7508-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Biotin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B4501-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Boric Acid</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B6768-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">MnSO4</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M7634-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">ZnSO4&#8226;7H2O&#160;</td>
			<td style="width:155px;">JUNSEI</td>
			<td style="width:119px;">83060-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">FeCl2&#8226;4H2O</td>
			<td style="width:155px;">KANTO</td>
			<td style="width:119px;">CB8943686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Sodium molybdate dihydrate</td>
			<td style="width:155px;">YAKURI</td>
			<td style="width:119px;">31621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">KI</td>
			<td style="width:155px;">JUNSEI</td>
			<td style="width:119px;">80090-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">CuSO4&#8226;5H2O</td>
			<td style="width:155px;">YAKURI</td>
			<td style="width:119px;">09605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">D-myo-inositol</td>
			<td style="width:155px;">MP biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">102052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Pantothenate</td>
			<td style="width:155px;">YAKURI</td>
			<td style="width:119px;">26003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Nicotinic Acid</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N4126-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">(NH4)2SO4&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4418-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Agarose</td>
			<td style="width:155px;">Biobasic</td>
			<td>D0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">G418, geneticin</td>
			<td style="width:155px;">LPS</td>
			<td style="width:119px;">G41805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">2. Enzyme reactions</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">Aglient</td>
			<td style="width:119px;">600380</td>
			<td>For site-directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">GeneMorphII Random mutagenesis Kit</td>
			<td style="width:155px;">Aglient</td>
			<td style="width:119px;">200500</td>
			<td>For error-prone PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher</td>
			<td>F-530L</td>
			<td>For fusion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Ex Taq&#160;DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">Takara</td>
			<td style="width:119px;">RR001b</td>
			<td>For general PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">BamH1</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Xho1</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Dpn1</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">3. Equipment</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Velveteen square, black</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89033-116</td>
			<td>For replica</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Replica-plating tool</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25395-380</td>
			<td>For replica</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:155px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1652100&#160;</td>
			<td>For fission yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap</td>
			<td style="width:155px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1652086&#160;</td>
			<td>For fission yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Thermal Cycler</td>
			<td style="width:155px;">Bioer</td>
			<td style="width:119px;">BYQ6078</td>
			<td>For fusion PCR ramp reaction&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene-targeted random mutagenesis to select heterochromatin-destabilizing proteasome mutants in fission yeast

ターゲット遺伝子のランダムな変異は、所望の表現型をもたらす突然変異を識別するために使用されます。ランダム変異導入を達成するために使用できるメソッドのエラーを起こしやすい PCR は突然変異体の多様なプールを生成するための便利で効率的な戦略 (すなわち。、変異ライブラリー)。エラーを起こしやすい PCR は、影響を受けない他のゲノム領域を残しながら遺伝子のコーディングの地域などの定義済みの領域の変異するように努める研究者選択の方法です。変異ライブラリーは、エラーを起こしやすい PCR によって増幅は後、に適切なプラスミド複製する必要があります。エラーを起こしやすい PCR によって生成されたライブラリのサイズは、クローン作成のステップの効率によって制限されます。ただし、分裂酵母、分裂酵母、クローン作成のステップは非常に効率的なワンステップ融合変換の構成要素を生成する PCR を使用して置き換えることができます。所望の表現型の変異体は、適切な記者を使用して選択できます。ここでは、我々 例、動原体ヘテロクロマチンに挿入されるレポーターとしてこの戦略を詳細をについて説明します。

以下の図 1に示した手順で取得した Rpt4 変異体は、コロニーの色を評価することによって分析できます。コロニーの色が図 2の細胞数の減少に関連するプレートに斑点を付けます。異質染色質領域に挿入ade6 +記者は、野生型の沈黙し、はい Ade プレートで赤色のコロニーを示しています。Ade6 +記者の表現をヘテ?...

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Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

分裂酵母におけるプロテアソーム変異体のヘテロクロマチン不安定を選択するランダムな変異を遺伝子をターゲットとしました。

この資料では、分裂酵母のターゲット遺伝子のランダム突然変異誘発のための詳細な方法論について説明します。たとえば、ターゲットrpt4 +、19 s プロテアソームと不安定にする異質染色質の変異のためのスクリーンの亜単位を符号化します。

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

でヒストンminiSOGを使用した光遺伝学ランダム突然変異誘発<em&gt; C。エレガンス</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

ハイスループットは、ロボットに温度に敏感な致死変異体の単離を支援します<em&gt;クラミドモナス</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

ターゲットを絞りました<em&gt;その場で</em出芽酵母におけるヒストン遺伝子の&gt;突然変異誘発

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

ハイスループットフォーマットでの遺伝子型CRISPR / Cas9媒介ノックアウト変異体に蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を用いました

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

迅速かつ安易なパイプラインを生成する突然変異点ゲノムにc. の elegansを用いた CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

作る条件付き変異体の人間のマラリア原虫マラリアに CRISPR/Cas9 遺伝子の編集

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

酵母の過剰発現の交尾ベース ライブラリ スクリーニング

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

酵母神経変性認知症予備モデルにおけるヒストン翻訳後修飾変化の特性

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

分裂酵母分裂酵母のディープ シーケンス アシスト、自発的な抑制画面

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

人間の DNA 配列に結合する転写因子を識別するために強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーン

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...