Name: gene-targeted random mutagenesis to select heterochromatin-destabilizing proteasome mutants in fission yeast
Uploaded: 2018-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast at JoVE.com

이 프로젝트에 대 한 지원 자금 기본 과학 연구 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF) 과학과 ICT (2016R1A2B2006354)에 의해 자금에 의해 제공 되었다.

1입니다. 미디어 준비
<ol><li>준비 효 모 추출 보충 교재 (예), 네 아데닌 (예 로우 에이드), Pombe 조미료 매체 (PMG12), 그리고 PMG 없이 아데닌 (PMG-Ade) 없이 표 1에 설명 된 대로 구성 요소를 혼합 하 여. 예-에이드 (Ade 낮은)와 PMG-에이드 접시 같은 구성 요소를 모두 하지만 아데닌 후자에서 생략 됩니다.<ol>
<li>다음 소금 (50 x) 주식을 사용: 52.5 g/L MgCl2·6H2O, 2...

<ol>
	<li>Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+model+of+error-prone+PCR.">A general model of error-prone PCR.</a> J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).</li><li>Pfeifer, G. P., You, Y. 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오류가 PCR 통해 임의의 mutagenesis 주어진된 지역에서 돌연변이의 다양 한 풀을 생성 하기 위한 강력한 도구입니다. 이 기술은 특정 상황에서 단백질의 기능을 평가 하는 연구에 대 한 특히 유용 합니다. 예, 우리는 여기는 19S 프로테아좀 소 단위, Rpt4, 섬으로 유지 보수에서의 기능을 평가 하기 위해 오류가 PCR을 사용. 변화 하 여 지역 오류가 PCR에 의해 표적으로 하 고 심사 조건 조정, 우리 관심 및 ?...

앞으로 유전학 연구원 추구 특정 표현 형을 표시 하는 자연적 사건 돌연변이 및 유전 분석을 수행 고전적인 방법입니다. 반전 유전학에서 관심사의 유전자에 돌연변이 소개 하 고 표현 형 검사. 후자의 경우 대상 유전자의 무작위 mutagenesis 이후에 온도 감도 등 원하는 고기에 대 한 선택 또는 효소 활동을 변경 하는 돌연변이의 풀을 생성 하 자주 사용 됩니다. 다양 한 방법은 오류가 PCR1;를 포함 하 여 임의의 mutagenesis 달성 하는 데 사용할 수 있습니다. UV 방사선 조사2. 화학 mutagens, 에틸 methanesulfonate (EMS) 등 질소 산3; - mutD5 4; 표현 등 임시 mutator 긴장의 사용 그리고 DNA5를 걸어 갔다입니다.
여기, 우리는 우리 분열 효 모에 대상 유전자 돌연변이 풀을 생성 하는 오류가 PCR을 이용 하는 반전 유전학 전략을 설명 합니다. 로 한의 이름에서이 메서드는 PCR 동안 일부러 오류를 도입 하 여 돌연변이 생성 합니다. 다른 mutagenesis 방법과 달리 오류가 PCR mutagenized 될 영역을 정의 하는 사용자 수 있습니다. 이것은 관심사의 단백질/도메인의 기능을 연구 하는 노력에 특히 유용 하다.
이 무작위 mutagenesis 절차를 보여, 우리 여기 사용 rpt4 +, 19S 프로테아좀 소 단위를 인코딩하는 예를 들어. Rpt4 분열 효 모6,7,,89, 다른 유기 체에 있는 베이스-독립적인 기능을가지고 표시 되었습니다 및 베이스 결함 단백질을 변경 하 여 간접 효과 일으킬 수 있습니다. 수준입니다. 우리는, 그러므로, 섬으로에 프로테아좀의 기능을 조사 하는 목적으로 베이스-독립적인 변화를 유발 하는 돌연변이 대 한 검사.
오류가 PCR 뇌관을 바인딩할 위치를 조정 하 여 어떤 유전자 영역에 적용할 수 있습니다. 적절 한 기자와 원하는 phenotypic 변화 하는 돌연변이 확인할 수 있습니다. 여기, 우리는 ade6 + 기자 삽입 활용는 centromere 1 외부 반복 (otr) 지역10. Ade6 + 기자 야생-타입 상태;에서 침묵은 그래서 제정 섬으로이 지역11에 형성 된다 이 빨간 식민지10으로 표시 됩니다. Centromere는에 제정 섬으로 destabilizes 하는 돌연변이 ade6 + 기자, 백색 식민지로 시각 이다는 식으로 이어질 것입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="825">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">1. Media</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Glucose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270-10KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:155px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">212720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:155px;">JUNSEI</td>
			<td style="width:119px;">87070-0310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Adenine sulfate</td>
			<td style="width:155px;">ACR</td>
			<td style="width:119px;">16363-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Uracil&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">L-Histidine</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">1.05108.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">NaCl</td>
			<td style="width:155px;">JUNSEI</td>
			<td style="width:119px;">19015-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">MgSO4&#8226;7H2O</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">63140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">CaCl2</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">12095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Potassium phthalate</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6758-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Inositol</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I7508-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Biotin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B4501-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Boric Acid</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B6768-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">MnSO4</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M7634-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">ZnSO4&#8226;7H2O&#160;</td>
			<td style="width:155px;">JUNSEI</td>
			<td style="width:119px;">83060-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">FeCl2&#8226;4H2O</td>
			<td style="width:155px;">KANTO</td>
			<td style="width:119px;">CB8943686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Sodium molybdate dihydrate</td>
			<td style="width:155px;">YAKURI</td>
			<td style="width:119px;">31621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">KI</td>
			<td style="width:155px;">JUNSEI</td>
			<td style="width:119px;">80090-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">CuSO4&#8226;5H2O</td>
			<td style="width:155px;">YAKURI</td>
			<td style="width:119px;">09605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">D-myo-inositol</td>
			<td style="width:155px;">MP biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">102052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Pantothenate</td>
			<td style="width:155px;">YAKURI</td>
			<td style="width:119px;">26003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Nicotinic Acid</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N4126-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">(NH4)2SO4&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4418-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Agarose</td>
			<td style="width:155px;">Biobasic</td>
			<td>D0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">G418, geneticin</td>
			<td style="width:155px;">LPS</td>
			<td style="width:119px;">G41805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">2. Enzyme reactions</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">Aglient</td>
			<td style="width:119px;">600380</td>
			<td>For site-directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">GeneMorphII Random mutagenesis Kit</td>
			<td style="width:155px;">Aglient</td>
			<td style="width:119px;">200500</td>
			<td>For error-prone PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher</td>
			<td>F-530L</td>
			<td>For fusion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Ex Taq&#160;DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">Takara</td>
			<td style="width:119px;">RR001b</td>
			<td>For general PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">BamH1</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Xho1</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Dpn1</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">3. Equipment</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Velveteen square, black</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89033-116</td>
			<td>For replica</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Replica-plating tool</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25395-380</td>
			<td>For replica</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:155px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1652100&#160;</td>
			<td>For fission yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap</td>
			<td style="width:155px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1652086&#160;</td>
			<td>For fission yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Thermal Cycler</td>
			<td style="width:155px;">Bioer</td>
			<td style="width:119px;">BYQ6078</td>
			<td>For fusion PCR ramp reaction&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene-targeted random mutagenesis to select heterochromatin-destabilizing proteasome mutants in fission yeast

대상 유전자의 무작위 mutagenesis 원하는 표현 형을 생성 하는 돌연변이 식별 하기 위해 일반적으로 사용 됩니다. 무작위 mutagenesis 달성 하는 데 사용할 수 있습니다 방법의 오류가 PCR는 돌연변이의 다양 한 풀을 생성 하기 위한 편리 하 고 효율적인 전략 이다 (즉., 돌연변이 도서관). 연구원은 다른 게놈 영역을 영향을 받지 떠나는 동안 유전자의 코딩 지구 같은 미리 정의 된 영역을 변형 하고자 하는 경우 오류가 PCR 방법의 선택입니다. 돌연변이 라이브러리 오류가 PCR에 의해 증폭 되어, 후 적당 한 플라스 미드로 복제 해야 합니다. 오류가 PCR에 의해 생성 된 라이브러리의 크기는 복제 단계의 효율에 의해 제한 됩니다. 그러나, 분열 효 모, Schizosaccharomyces pombe, 복제 단계는 매우 효율적인 원스텝 퓨전 변환에 대 한 구문을 생성 하는 PCR의 사용으로 대체할 수 있습니다. 원하는 고기의 돌연변이 다음 적절 한 기자를 사용 하 여 선택할 수 있습니다. 여기,이 전략 자세하게, 예를 들어, centromeric 섬으로에 삽입 기자 복용 설명 합니다.

그림 1 에 설명 된 절차에 따라 인수 Rpt4 돌연변이 식민지의 색상을 평가 하 여 분석할 수 있습니다. 식민지의 색상은 그림 2에 셀 수 감소에 관련 된 접시에 발견 했다. 섬으로 지역에 삽입 기자 ade6 + 야생-타입에 침묵 하 고 예 에이드 접시에 빨간 식민지를 보여줍니다. 일단는 섬으로 불안정 하 고 ade6 + 기자 표현, ...

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Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

분열 효 모 섬으로 불안정 프로테아좀 돌연변이 선택할 임의의 Mutagenesis 유전자 타겟팅

이 문서에는 분열 효 모에 대상 유전자의 무작위 mutagenesis에 대 한 자세한 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리가 대상 rpt4 +, 19S 프로테아좀 섬으로 불안정 돌연변이 대 한 스크린의 소 단위를 인코딩하는.

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

히스톤 - miniSOG에서 사용 Optogenetic 무작위 돌연변이 유발<em&gt; C. 엘레</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

연구

유전학

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

온도에 민감한 치명적인 돌연변이의 높은 처리량 로봇 보조 절연에<em&gt; 클라 미도 모나스의 reinhardtii에서</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

대상<em&gt; 현장에서</em신진 효모에서&gt; 돌연변이 유발 히스톤의 유전자

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 유전자 인간 말라리아 기생충의 조건부 돌연변이 게 P. falciparum 에 편집

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

효 모에 짝짓기 기반 Overexpression 라이브러리 심사

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

효 모 신경 Proteinopathy 모델에서 특성화 히스톤 포스트 번역 상 수정 변경

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

분열 효 모 Schizosaccharomyces pombe 에 깊은 시퀀싱 지원, 자발적인 억압 화면

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

인간의 DNA 시퀀스에 바인딩 전사 요소를 식별 하기 위해 향상 된 효 모 한 하이브리드 화면

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...