Name: the lambda select cii mutation detection system
Uploaded: 2018-04-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Lambda Select cII Mutation Detection System at JoVE.com

نود أن نعترف بالمساهمات من جميع الزملاء والمتعاونين لدراساتنا الأصلي، أحيلت نتائجه في هذه المخطوطة (لأغراض توضيحية). دعم عمل المؤلفين من المنح المقدمة من المعهد الوطني لطب الأسنان والبحوث إحضارهما "المعاهد الوطنية للصحة" (1R01DE026043) على أساسها، ومن جامعة California Tobacco-Related برنامج بحوث الأمراض إلى AB ( TRDRP-26IR-0015) وشارع (تردرب-25IP-0001). وكان مقدمو الدراسة أي دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات وتحليل البيانات، وتفسير البيانات وكتابة التقرير، أو في قرار يقدم للنشر.

1-الحمض النووي في معزل عن الخلايا الليفية الجنينية الماوس
ملاحظة: الليفية الجنينية الماوس الأساسي يتم عزل من الأجنة المستمدة من الفئران المحورة وراثيا BB مع الخلفية الوراثية C57BL/6، وفقا للبروتوكول المنشورة53. انطلاق المواد لهذا البروتوكول يتكون من 1 × 106 و 1 × ...

يتم استخدام الفحص حدد الاتحاد λ للكشف عن الطفرات في التحوير الاتحاد ضبطت المجينية الحمض النووي للخلايا المشتقة من الأجهزة/أنسجة القوارض BB3. جينوم هذه الحيوانات المحورة وراثيا يحتوي على نسخ متعددة جنبا إلى جنب ناقل المكوك λLIZ تشروموسومالي المتكاملة، الذي يحمل الا?...

وضعت مجموعة واسعة من النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا ونظم الكشف عن الطفرات المحدثة للطفرات في اختبار للمواد المسببة للسرطان في خلايا الثدييات. من هذه الفئران "الأزرق الكبير" (المشار إليها أدناه ك BB) المعدلة وراثيا و λ حدد الاتحاد "نظام الكشف عن الطفرات" قد استخدمت للتجارب المحدثة للطفرات بهذه المجموعة والعديد من غيرها بحوث المجموعات في جميع أنحاء العالم1،2، 3،4،5،،من67،،من89. لل 16 عاماً الماضية حققت التأثيرات الطفور عوامل كيميائية و/أو جسدية مختلفة باستخدام هذه الحيوانات المحورة وراثيا أو ثقافاتها خلية جنينية تنتجها الخلايا الليفية المقابلة تعامل مع مجمع لاختبار، وتحليلها في وقت لاحق النمط الظاهري والنمط الوراثي للتحوير الاتحاد λ حدد الاتحاد المقايسة وتسلسل الحمض النووي، على التوالي10،،من1112،،من1314 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24-الجينوم من هذه الحيوانات المحورة وراثيا يحتوي على ناقل مكوك λ عاثية (λLIZ) المتكاملة على كروموسوم 4 نسخ متعددة الرأس إلى الذيل كونكاتيمير1،2،25. ناقل المكوك λLIZ يحمل اثنين من الجينات مراسل حيث، إلا وهي ﻻسي و الاتحاد المتسلسلات1،2،25،،من2627، ،من 2829،30،31،32،،من3334،35،36، 37،39،،من3840،42،41،43،،من4445 , 46 , 47-يستند التحليل حدد الاتحاد λ استرداد ناقلات المكوك λLIZ من الحمض النووي من الخلايا المشتقة من الأجهزة/الأنسجة من الحيوانات المحورة وراثيا1،2،25 . ثم يتم حزم ناقلات المكوك λLIZ المستردة في λ بالعاثية رؤساء قادرة على إصابة مضيف مؤشر الإشريكيّة القولونية. وفي وقت لاحق، تزرع البكتيريا المصابة تحت شروط انتقائية للسماح لتسجيل وتحليل الطفرات في الاتحاد التحوير1،3.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصل للمقايسة حدد الاتحاد λ، الذي يتألف من عزل الحمض النووي من الخلايا/أجهزة للحيوانات المحورة وراثيا التي تعامل في المختبر/في فيفو مع اختبار استرجاع مركبة، λLIZ مكوك ناقلات من الحمض النووي الجينوم، التعبئة وتغليف الناقلات إلى فاجيس λ المعدية، العدوى المضيفة كولاي مع bacteriophages، تحديد هوية الاتحاد-طفرات في ظروف الانتقائي لتحديد تواتر متحولة الاتحاد ، و تحليل تسلسل الحمض النووي إنشاء الاتحاد طفرة الطيف. يمكن تطبيق البروتوكول على الماوس/الفئران المعدلة وراثيا خلية الثقافات تعامل في المختبر مع عامل الكيماوية/الفيزيائية للفائدة، أو معاملة الأنسجة/أجهزة الحيوانات المقابلة في فيفو مع الاختبارات الكيميائية/عامل1، 2،4،،من4849،50،،من5152. عرض تخطيطي للمقايسة حدد الاتحاد λ يرد في الشكل 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>MO Bio Laboratories, Inc.</td>
			<td>12112-05</td>
			<td>Bacteriological grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4337455</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein Peptone</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>H26557</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatine</td>
			<td>J. T. Baker</td>
			<td>2124-01</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 229-1 / M-13750</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 9724-500</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>8104</td>
			<td>50 PCR purification reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate Trihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M-15756</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq5000 DNA Polymerase&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>201207</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine Hydrochloride</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>2722-57</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transpack Packaging Extract</td>
			<td>Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp.</td>
			<td>200223</td>
			<td>50 packaging reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 152-1 / EC 201-064-4</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>RC-110</td>
			<td>None</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the lambda select cii mutation detection system

قد وضعت عددا من النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا ونظم الكشف عن الطفرات المحدثة للطفرات في اختبار للمواد المسببة للسرطان في خلايا الثدييات. هذه، استخدمت الفئران المعدلة وراثيا و "لامدا" (λ) حدد الاتحاد "نظام الكشف عن الطفرات" للتجارب المحدثة للطفرات بالعديد من المجموعات البحثية في جميع أنحاء العالم. هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصل للمقايسة الطفرة الاتحاد "حدد أمداً"، التي يمكن تطبيقها على الخلايا المزروعة من الفئران المعدلة وراثيا/الفئران أو معاملة الحيوانات المقابلة مع وكيل الكيماوية/الفيزيائية للفائدة. البروتوكول يتكون من الخطوات التالية: (1) عزل الحمض النووي من الخلايا أو الأجهزة/الأنسجة من الحيوانات المحورة وراثيا تعامل في المختبر أو في الجسم الحي، على التوالي، مع مجمع اختبار؛ (2) استعادة ناقل المكوكية لامدا تحمل جين مراسل حيث (أي، التحوير الاتحاد ) من الحمض النووي الجينوم؛ (3) التعبئة والتغليف لناقلات المرض الذين تم إنقاذهم إلى bacteriophages المعدية؛ (4) إصابة بكتيريا المضيفة واستزراع تحت شروط انتقائية للسماح بنشر الطفرات المستحثة الاتحاد ؛ وسجل (5) الاتحاد-طفرات والحمض النووي تسلسل التحليل لتحديد تواتر متحولة الاتحاد والطيف الطفرة، على التوالي.

اعتماداً على توزيع البيانات، يتم استخدام اختبارات حدودي أو غير حدودي تحديد أهمية الاختلاف في التردد متحولة الاتحاد بين المجموعات المعالجة والمراقبة (أيفعل مقابل الترددات متحولة عفوية) . يتم إجراء مقارنة الترددات متحولة المستحث الاتحاد عبر مجموعات معاملة...

Watch this Scientific Journal Video about The Lambda Select cII Mutation Detection System at JoVE.com

The Lambda Select cII Mutation Detection System

"حدد أمداً" الاتحاد "نظام الكشف عن الطفرات"

يصف لنا بروتوكول مفصل للمقايسة الطفرة الاتحاد "حدد أمداً" في الخلايا المستزرعة من القوارض المعدلة وراثيا أو الحيوانات المقابلة تعامل مع عامل الكيماوية/الفيزيائية للفائدة. وقد استخدمت هذا النهج على نطاق واسع لاختبار المحدثة للطفرات من المواد المسببة للسرطان في خلايا الثدييات.

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of ...

The overall goal of this protocol is to visualize step-wise procedures involved in the Lambda Select cII mutation assay in cultured cells of transgenic rodents or the corresponding animals treated with chemical and physical agents of interest. This test method can help answer key questions in the field of mutation research such as, is a test compound mutagenic? And if so, how potent of a mutagen is it?Does it induce sequence-specific mutations? The main advantage of this technique is that it is a minimal to virtually any test compound. The method can be used for mutagenicity testing in mammalian cells using a chromosomally integrated reporter gene.To constitute a single packaging reaction, add five micrograms of genomic DNA in a micro-centrifuge tube containing the first reaction mix. Then incubate the tube at 30 degrees Celsius for 90 minutes. Post-incubation, add 12 micro-liters of the second reaction mix to the tube and leave for another 90 minutes at 30 degrees Celsius.After 90 minutes, add 1.1 milliliters of SM buffer to the tube. Then vigorously vortex the tube with the packaged DNA at room temperature for about 10 seconds. Quickly give a pulse spin in the micro-centrifuge.Then leave the tube on ice until use. Next, add 50 microliters of chloroform for each milliliter of packaged DNA. If the sample will not be processed the same day, then vortex the sample gently and store at four degrees Celsius up to two weeks.Prepare 16 sterile round bottom tubes and 16 TB1 agar plates for a single packaged DNA sample. Use ten tubes for screening and six for titering. Then aliquot 300 microliters of G1250 plating culture in each round bottom tube.Next, to titer, add 10 microliters of packaged DNA to 990 microliters of SM buffer and 1:100 dilution. Then vortex the sample. Add 20 or 100 microliters of the 1:100 DNA solution to each of the three titer 20 or titer 100 tubes respectively.For screening purpose, add 100 microliters of the undiluted packaged DNA sample to each of the 10 screening tubes. Process all of the 16 titering and screening tubes. Vortex the tubes for 10 seconds to mix the components.Then incubate the tubes at room temperature for 30 minutes for the host E.coli to absorb the phages. Next, add 2.5 milliliters of molten TB1 top agar. Maintain that 55 degree Celsius to the appropriate titering and screening tubes.After adding, immediately vortex the tubes gently. Now, pour the TB1 agar to the appropriate titer or screening TB1 agar plate. Allow the plates to stand for 15 to 30 minutes at room temperature.Once the agar has solidified, invert and leave all the 10 screening plates in the stationary incubator at 24 degrees Celsius for 46 to 48 hours. Leave the remaining six titer plates in a stationary incubator at 37 degrees Celsius for overnight or a day. Following the incubation at 37 degrees Celsius, count the number of plaques formed in all the 3 titer 20 and titer 100 plates.Following the incubation at 24 degrees Celsius, count the number of plaques formed in the 10 screening plates. To verify the putitive mutant plaques, core the plaque with a sterile wide bore pipette tip. Then transfer the plaque to sterile micro-centrifuge tube filled with 500 microliters of sterile SM buffer.Then incubate the micro-centrifuge tube at room temperature for at least two hours at room temperature. Next, mix one microliter of the cored phage solution with 200 microliters of the G1250 plating culture in a sterile round bottom tube. Then incubate the mixture at room temperature for 30 minutes.After 30 minutes, plate the cored phage solution in 2.5 milliliters of molten TB1 top agar and incubate at 24 degrees Celsius for 46 to 48 hours. Once the secondary plaques are visible, use a pipette tip to pick a single well-isolated Lambda cII mutant plaque. Transfer the plaque to a micro-centrifuge tube filled with 25 microliters of double distilled water in pipette several times.Leave the tube on boiling water for five minutes. Then centrifuge the tube at 18, 000 times G for three minutes at room temperature. Immediately after centrifugation, transfer 10 microliters of the supernatant to a new micro-centrifuge tube containing 40 microliters of the PCR master mix.After PCR amplification, purify the 432 base para-amplified product with the cII gene and its flanking regions incorporated using the PCR purification kit. Then sequence the cII transgene using a DNA analyzer to detect the mutations. The plaques obtained in both the titer 20 and the titer 100 plates are clearly visible by holding them next to a white light box and against a dark background.Here, the bar plot depicts the mutagenic potency of various chemicals in the physical compounds tested. This is done by analyzing the extent of increase in the relative cII mutant frequency isolated from the mouse embryonic fiber blasts. The bar plot depicts all these test reagents showing statistically significant fold increase in the cII mutant frequency.Next, the mutation spectra of the cII transgene in the mouse embryonic fiber blasts irradiated with UVB is demonstrated. The pie chart shows a significant increase in the relative frequency of single or tandem cytidine to thymidine transition at pyrimidine dinucleotides when compared to the control. Once mastered, this technique can be done in eight to ten hours if it is performed properly, excluding preparation times for bacterial streak plate in culturing.In DNA sequencing, subsequent to scoring the cII mutants. After watching this video, you should have a good understanding of how to perform mutation analysis of a test compound in an in vitro model system.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Lambda Select cII Mutation Detection System

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

مزيج من الشريط اللاصق على أساس أخذ العينات والإسفار في الموقع تهجين للكشف السريع عن السالمونيلا على المنتجات الطازجة

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

الكشف عن الفيروسات المعدية التي جمعت من الحقل عن طريق البعوض فيرو خلية الفحص الثقافة

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

بمعزل عن المتغيرات الاخلاص للفيروسات الحمض النووي الريبي وتوصيف التردد يتحور الفيروس

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

التعبئة والتغليف بفيروس نقص المناعة البشرية أو FIV المستندة إلى محددات التعبير Lentivector وتنبيغ من الجزيئات VSV-G الفيروسية Pseudotyped

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

بعد الخلوي في مصير<em&gt; E. القولونية</em&gt; بعد الإصابة التي كتبها لامدا بالعاثية

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

الأنف المسحات لمكافحة الأنفلونزا A الكشف عن الفيروسات وعزل من الخنازير

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

فحوصات النوعية والكمية للكشف وتوصيف مضادات الميكروبات البروتين

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

الكشف عن استعمار الإشريكيّة القولونية Enterohemorrhagic موريني واستضافة بنظام الإضاءة الحيوية غير الغازية في فيفو

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

كشف وإزالة التلوث Nuclease أثناء تنقية Integrase فيروس مزبد النموذج المؤتلف

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

منصة الفائق لفحص السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...