Name: a rapid and facile pipeline for generating genomic point mutants in c. elegans using crispr/cas9 ribonucleoproteins
Uploaded: 2018-04-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins at JoVE.com

ישנם שאין ניגודי אינטרסים הקשורים בדו ח זה.

כל טיפול בבעלי חיים והתהליכים ניסיוני בעקבות המנחה של מכוני הבריאות הלאומיים ואת טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה (IACUC) ב אוניברסיטת מישיגן. להשתמש בפתרונות נטולת RNase, פיפטה טיפים לאורך כל הפרוטוקול. לנקות את אזור העבודה פיפטות, צינורות, צנטריפוגה עם פתרון טיהור RNase לבצע את ההנחיות יצרן...

<ol>
	<li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering.">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202, 885-901 (2016).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096 (2014).</li><li>Ma, D., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+and+Its+Applications+in+Model+Organisms.">Genome Editing and Its Applications in Model Organisms.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).</li><li>Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-Guided+Genome+Engineering+in+C.+elegans.">CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans.</a> Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).</li><li>Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+technologies+for+genome+editing.">Delivery technologies for genome editing.</a> Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).</li><li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR.">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biol. 17, 148 (2016).</li><li>Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+genome+editing+using+CRISPR-Cas9+and+linear+repair+templates+in+C.+elegans.">Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans.</a> Methods. , (2017).</li><li>Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient,+Rapid+and+Co-CRISPR-Independent+Genome+Editing+in+Caenorhabditis+elegans.">Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans.</a> G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+PCR:+The+Polymerase+Chain+Reaction.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Restriction+Enzyme+Digests."> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests.</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+DNA+Gel+Electrophoresis+.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis .</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Gel+Purification.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification.</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>Estrada-Rivadeneyra, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sanger+sequencing.">Sanger sequencing.</a> FEBS J. , (2017).</li><li>Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis.">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).</li><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li><li>Boyd, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Balanced+Look+at+the+Implications+of+Genomic+(and+Other+&amp;#34;Omics&amp;#34;)+Testing+for+Disease+Diagnosis+and+Clinical+Care.">A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other &amp;#34;Omics&amp;#34;) Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care.</a> Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).</li><li>Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+SOD1+loss+of+function+involved+in+amyotrophic+lateral+sclerosis?.">Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis?.</a> Brain. 136, 2342-2358 (2013).</li><li>Acevedo-Arozena, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+assessment+of+the+SOD1G93A+low-copy+transgenic+mouse,+which+models+human+amyotrophic+lateral+sclerosis.">A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis.</a> Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).</li><li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu,Zn+superoxide+dismutase+mutation.">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li></ol>

מערכת CRISPR-Cas9 הוא כלי חזק ואפקטיבי בדיוק שינוי הגנום של מודל אורגניזמים. . הנה, נדגים שאת chimeric sgRNAs20 יחד עם ssODN HDR תבניות לזמינה הדור יעילה במיוחד של גנומית מוטציות נקודה C. elegans. חשוב לציין, נדגים כי משלוח RNP מייצרת יעילות העריכה גבוהה כאשר קרינה פלואורסצנטית משמש כסמן בחירה מש...

ההתקדמות הטכנולוגית האחרונות טרנספורמציה באופן קיצוני, האיצו את היכולת בדיוק מהנדס הגנום. בפרט, המערכת CRISPR-Cas9, אשר מסתמך על endonuclease מונחה RNA Cas9 לזירוז הפסקה גדיל כפול (DSB) ליד הרצף היעד עניין, בהרחבה שימש לתכנן במדויק את הגנום של רוב האורגניזמים מודל בשימוש מחקר ביו1,2,3,4. באופן משמעותי, השימוש CRISPR-Cas9 נעול הגנום עריכה אפילו במינים קשה כמו C. elegans5. בין המינים, יצירת מוטציות נקודה עם הגנום CRISPR-Cas9 המבוסס על מערכת עריכה מתבסס על שלושה רכיבים מרכזיים: 1) Cas9 endonuclease, 2) RNA מדריך יחיד (sgRNA) שמנתב את Cas9 endonuclease רצף המטרה ולאחר 3) משתמש מעוצב תבנית תיקון מכוון הומולוגיה (HDR) המכילה את edit(s) הרצוי של הריבית2.
ישנן מספר שיטות שבהן ניתן להשתמש כדי להציג את sgRNA ואת Cas9 מיקוד נוקלאז לתוך תאים כולל פלסמיד, RNA נגיפי המבוסס על משלוח שיטות6. לאחרונה, מסירה ישירה של טרום-ומורכבת sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) התפתחה ככלי רב עוצמה ויעיל הגנום CRISPR-Cas9 מבוססי עריכה7. מסירה ישירה של טרום-ומורכבת RNPs CRISPR-Cas9 יש מספר יתרונות ברורים, כלומר: 1) RNPs לעקוף את הצורך הסלולר תמלול, תרגום, 2) RNPs נמחקים במהירות, אשר עשוי להגדיל ירידה לפרטים על-ידי הפחתת הזמן הפנוי את המטרה המחשוף ו- 3) RNPs מכילים גורמים זרים אין DNA/RNA אשר עוקף המבוא של רצפים שאינם ילידי לתוך הגנום מארח באמצעות שילוב אקראי. יחד, סביר תכונות אלה מספקות פרץ קצר של--יעד CRISPR עריכה תוך מזעור תופעות את המטרה.
אנו מתארים פרוטוקול פשוט ויעיל עבור שינויים בייעודי לאתר גנומית C. elegans. פרוטוקול זה כולל מיקוד sgRNA oligonucleotide תקועים יחיד (ssODN) HDR תבנית, sgRNA-Cas9 RNP complexing ו משלוח, ועיצוב אסטרטגיה genotyping לצורך זיהוי חד משמעי של חיות ערוכה כראוי. באמצעות אסטרטגיה זו, לא רק השינויים הרצויים בייעודי לאתר ניתן לשחזר, אבל גם עשוי להיות התאושש מוטציות ויאסין שאינם ספציפיים אחרים. לפיכך, האסטרטגיה שלנו מאפשרת את הדור של סדרות allelic באמצעות אסטרטגיה אחת, שם הן מונו-allelic, דו-allelic, ויאסין מוטציות יכול להיווצר דור1 F.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1144">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">CRISPRevolution sgRNA&#160; EZ Kit</td>
			<td style="width:216px;">Synthego Inc.</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:227px;">chimeric sgRNA</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nuclease-free TE</td>
			<td>Synthego Inc.</td>
			<td>provided with the sgRNA kit EZ kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nuclease-free water</td>
			<td>Synthego Inc.</td>
			<td>provided with the sgRNA kit EZ kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">4 nmole Ultramer DNA Oligo</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>ssODN HDR template</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1078728</td>
			<td>Cas9 protein</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">pCFJ90&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>19327</td>
			<td>Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Zymoclean Gel DNA Recovery Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0494L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass Borosilicate Glass Micropipettes</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF100-78-10</td>
			<td>OD: 1.0mm. ID: 0.78mm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma Hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NP-40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNaseZap Decontamination Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid and facile pipeline for generating genomic point mutants in c. elegans using crispr/cas9 ribonucleoproteins

חוזר palindromic באופן קבוע interspersed (CRISPR) - CRISPR - באשכולות קשורה חלבון 9 (Cas9) מערכת הגנה החיסון מסתגלת prokaryotic יש כבר גייס בתור כלי רב עוצמה עבור הנדסה מדויקת הגנום האיקריוטים. כאן, אנו מציגים שיטה מהירה ופשוטה באמצעות מדריך בודד chimeric RNAs (sgRNA) ו- CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) עבור הדור יעיל ומדויק של גנומית מוטציות נקודה C. elegans. אנו מתארים צינור בחירת היעד sgRNA, עיצוב התבנית תיקון מכוון הומולוגיה (HDR), CRISPR-Cas9-RNP complexing ו משלוח של אסטרטגיה genotyping המאפשרת זיהוי מהיר ועמיד חיות הערוך בצורה נכונה. הגישה שלנו מאפשרת הדור נתיישב וזיהוי של הנקודה הרצויה גנומית חיות אלא גם מקלה על האיתור של אללים אחרים מורכבים ויאסין כ 4-5 ימים עם יעילות גבוהה, עומס עבודה מופחתת ההקרנה.

מוטציות בגן האנושי סופראוקסיד דיסמוטאז 1 (SOD1) בחשבון של משפחתית נוירודגנרטיביות, מחלה ניווניות הרסנית שמוביל תמיד לשיתוק ומוות17~ 10-20%. סופראוקסיד דיסמוטאז אנושי-1 הוא חלבון שנשמרת אבולוציונית שיתוף דמיון זהות ו- 70%-55% עם החלבון השתילות-1 C. elegans (<strong class...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins at JoVE.com

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

כאן, אנו מציגים שיטה להנדס את הגנום של C. elegans שימוש CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ותבניות תיקון התלויים הומולוגיה.

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

The overall goal of this procedure is to generate genomic point mutations in C.Elegans using single stranded oligonucleotide homology directed repair templates and CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins. This method can help answer key questions in the neuroscience field such as determining the pathological consequences of genetic variance associated with neurodegenerative disease. The main advantage of this technique is that genomic point mutations can be generated rapidly allowing for the functional study of genetic variance within the context of endoginous regulatory control while avoiding the caveats of protein overexpression.To carry out sgRNA target selection, open up the webpage shown here. Input approximately 60 base pairs of sequence flanking the desired edit of interest. After selecting the C.Elegans genome and the protospacer adjacent motif according to the text protocol, click submit.On the results page, choose the top ranked target sequence closest to the edit of interest. Upon receipt, centrifuge the lyophilized sgRNA containing tube at room temperature and at least 12, 000 g for one minute. Add 60 microliters of nuclease free TE to the tube and use a p200 pipette to gently resuspend by pipetting up and down 15 to 20 times.The final concentration is 50 micromolar. Design an ssODN HDR template containing the mutation of interest, a unique in frame restriction endonuclease site, a silent mutation of one or both of the Gs within the NGG PAM sequence and 50 base pair five prime and three prime homology arms flanking the first and last mutation. Upon receipt, centrifuge the lyophilized ssODN containing tube as just demonstrated then use nuclease free DD H20 to gently resuspend ssODN to a final concentration of 100 micromolar.To prepare an injection mix, centrifuge the reagents shown here at maximum speed and four degrees celsius for two minutes. In the order listed, add the reagents to a nuclease free PCR tube. Then use a p20 pipette to gently and thoroughly mix the contents.Incubate the tube at room temperature for ten minutes. After injecting P0 animals according to the text protocol, allow them to recover at room temperature for one to two hours on an OP50 seeded 35 millimeter NGM plate. Subsequently using a platinum wire worm pick transfer single injected P0 animals to individual OP50 seeded 35 millimeter NGM plates.Two days post injection use a fluorescent microscope to identify P0 plates containing F1 progeny, expressing mCherry in the pharynx. Choose three P0 plates that contain the most mCherry positive F1 animals. From each of the three selected P0 plates use a worm pick to single eight to 12 mCherry positive F1 animals for a total of 24 to 36 mCherry positive F1s.Allow individual F1s to self fertilize and lay eggs at room temperature for one to two days. After one to two days of egg laying, use a worm pick to transfer the F1s into individual PCR strip tube caps containing seven microliters of worm lysis buffer. Centrifuge the PCR tubes at maximum speed and room temperature for one minute to bring the animals to the bottom of the tube.Then freeze the tubes at negative 80 degrees celsius for one hour. Next lyse frozen worms in a thermocycler using the following program. Then set up a PCR master mix as shown in this table.Add 21 microliters of PCR master mix into clean PCR tubes then add four microliters of the worm lysis tube and mix well by pipetting. Then run the PCR program following the manufacturer's guidelines. Purify the PCR reactions using a DNA clean and concentrate kit following the manufacturer's instructions.Then dilute the DNA by adding 10 microliters of water to the spin column. After setting up the restriction enzyme master mix add 10 microliters to each cleaned PCR reaction and incubate the tubes at 37 degrees celsius for one to two hours. Then separate the digested PCR products on a 1.5%agarose gel using 1x TAE buffer at 120 volts.Examine enzyme digested samples for the presence of bands that indicate potential edited animals. After identifying potential edited animals use the remaining three microliters of worm lysis and repeat the PCR. Then immediately load the completed reactions on a 1%agarose gel before separating and extracting the band using a gel extraction kit.Using the F1 primer carry out Sanger sequencing to identify correctly edited animals. Finally to obtain homozygous animals from verified heterozygous edited animals, single eight to 12 F2 animals and carry out genotyping and sequence verification according to the text protocol. To demonstrate the simplicity, feasibility, and efficiency of the CRISPR/Cas9 RNP based approach, the C.Elegans sod-1 gene was targeted to introduce the disease associated human G93a variant in the worm genome.This gel image shows the genotyping results for 24 mCherry positive F1 animals. 10 contained monoallylic or biallylic modification, 10 were wild type, three were potential indels, and one was a PCR failure. To demonstrate that the fluorescent mCherry marker enriches for genome modification, eight mCherry negative animals from each of the three P0 plates were picked.Only one animal was correctly modified whereas 23 were wild type. This figure shows the chromatogram from the full length gel extracted PCR product demonstrating that the precise nucleotide changes designed in the ssODN HDR template were faithfully incorporated into the genome of this homozygous F1 animal. Once mastered, this technique can be utilized to generate and identify genomic point mutations in C.Elegans in four to five days if it is performed properly.While attempting this procedure it's important to remember to use nucleus free reagents and techniques including RNase free water, filter pipette tips, and gloves. Following this procedure, cellular, molecular, and behavioral assays can be performed in order to investigate phenotypes that may associate with the mutation of interest. After watching this video you should have a good understanding of how to precisely generate genomic point mutations in C.Elegans using chimeric single guide RNase and CRISPR/Cas9 ribonuclearproteins.

Research

JoVE Journal

Genetics

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

באמצעות טכניקה ג&#39;ל אלקטרופורזה פלורסנט PCR-נימי הגנוטיפ קריספר / Cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

הבחירה תלויה עצמאית הדור של CRISPR / Cas9 בתיווך גין Knockouts בתאי יונקים

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

השתלת תא נבט הקדמוני עבור מבוססת על CRISPR/Cas9 וקפיצת המדרגה של צפרדע רפואית

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-מתווכת אינטגרציה יישוב In Vivo באמצעות אסטרטגיה מבוסס על הצטרפות סוף בתיווך הומולוגיה

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי להפוך מותנה מוטציות של בני אדם טפיל המלריה falciparum פ

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

חלבון אנדוגני תיוג-אנוש המושרה בתאי גזע Pluripotent באמצעות CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם Pluripotent

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...