Name: ex utero electroporation and organotypic slice cultures of embryonic mouse brains for live-imaging of migrating gabaergic interneurons
Uploaded: 2018-04-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dalla Fondazione Savoy e Fondazione Epilessia cura di funzionamento e di attrezzature concede dalla Fondazione canadese per l'innovazione al pronto soccorso (microscopio confocale) e Gallo (microscopio confocale del disco di filatura). Pronto soccorso riceve un premio alla carriera dalla Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S; Clinician-Scientist Award) così come dalla canadese Institutes for Health Research (CIHR; Premio giovane ricercatore). G.H. è un anziano studioso di FRQ-S. L. e è il destinatario del premio di formazione post-dottorato Steriade-Savoia dal Savoy Foundation, il premio di formazione post-dottorato CHU Sainte-Justine Foundation e il premio di formazione post-dottorato FRQ-S, in collaborazione con la Fondazione delle stelle. Questo progetto è stato reso possibile dal cervello Canada attraverso il fondo di ricerca del cervello Canada, con il sostegno finanziario di Health Canada, assegnato a L.E.

Tutti gli esperimenti che coinvolgono gli animali sono stati approvati dal Comité Institutionnel des Bonnes Pratiques avec les Animaux de Recherche (CIBPAR) presso il centro di ricerca di CHU Sainte-Justine e sono stati condotti in conformità con il Consiglio canadese su Guida di cura degli animali per la cura e l'uso di animali da esperimento (ed. 2).
Il protocollo descritto qui è stato ottimizzato per elettroporazione di embrioni al giorno embrionale (e) 13.5, in un momento quando INs MGE...

In questo articolo, forniamo un metodo affidabile per l'esecuzione ex utero elettroporazione del mouse MGE presso e13.5 e per la generazione di colture organotipiche di fette del cervello embrionale. Sebbene metodi in vitro , quali l'analisi della camera di Boyden, sono relativamente facili da eseguire e possono essere utilizzati per valutare i ruoli specifici di diversi geni e proteine senza l'interferenza di altri fattori, precludono l'indagine IN dinamiche di migrazione per quanto riguarda la direzio...

Interneuroni GABAergici corticale (INs) sono diverse per quanto riguarda la loro proprietà biochimiche, connettività e proprietà fisiologiche e mediano funzioni diverse in reti maturo1,2,3 ,4,5. La specifica dei diversi sottotipi di INs corticale è strettamente regolata attraverso cascate genetiche che sono stati estesamente studiati1,2. La maggior parte (70%) di corticali GABAergici INs provengono da progenitori nell'eminenza gangliare mediale (MGE), una struttura embrionale situata ventralmente e necessario migrare attraverso le distanze relativamente lunghe per raggiungere la placca corticale1, 2 , 6. mentre le cellule piramidali corticali migrano radialmente dalla zona ventricolare (VZ) alla piastra corticale lungo il patibolo glia radiale, la migrazione tangenziale di INs, che non sono collegati a tali un'impalcatura, richiede una varietà di intrinseca e estrinseche spunti per attirare la migrazione dei neuroni verso la piastra corticale, mentre guidarli lontano da strutture non-corticali2,7,8. Dopo l'uscita del ciclo cellulare, INs sono respinti da MGE da chemio-ripugnante segnali espressi all'interno il VZ di MGE, che innesca la migrazione tangenziale verso il piatto corticale9,10. Migrazione in evitare lo striato con l'ausilio di diversi spunti ripugnante11 e, dopo aver raggiunto la placca corticale, passare da una tangenziale a una modalità di migrazione radiale e raggiungere la loro posizione finale laminare, parzialmente in risposta a stimoli da piramidale le cellule12 e altre popolazioni cellulari13. La migrazione di INs, come per altre popolazioni neuronali, comporta vari cambiamenti morfologici dinamici per consentire l'effettivo movimento del neurone. Questa cosiddetta locomozione neuronale è caratterizzata da cicli ripetitivi di tre fasi successive: l'allungamento di un processo di leader, un movimento attivo anterograda del nucleo (nucleokinesis) e la retrazione del processo finale14. IN migrazione è regolata da numerosi segnali intrinseci ed estrinseci che guidano la ramificazione e rimodellamento attivo del processo di leader per guidare INs nella direzione corretta, determinare l'orientamento e la velocità di migrazione14,15 ,16.
I fattori determinanti che regolano corticale IN migrazione sono stati ampiamente studiati negli ultimi anni1,2,7,17,18,19,20, e la rottura in alcuni di questi attori molecolari è stata postulata per condurre ai disordini dello sviluppo neurologico, quali pediatrici refrattari epilessia o autismo spettro disturbi1,2,21, 22 , 23 , 24. Pertanto, lo sviluppo di diversi approcci in vitro e in vivo è stato perseguito per avanzare in modo significativo la nostra capacità di studiare questo processo dinamico, come precedentemente esaminati25. In vitro i metodi, tra cui l'analisi della camera di Boyden e analisi della scelta di striscia, forniscono il mezzo più veloce e più riproducibile per valutare il requisito e la cella-autonomo impatto di specifici geni o proteine durante la migrazione neuronale, senza l'influenza di altri fattori25. Questi test sono particolarmente utili quando combinato con formazione immagine live8,26,27. Con queste tecniche, INs sono facilmente Estratto da e13.5 MGE e isolato da dissociazione enzimatica e meccanica, dopo di che possono essere studiate diverse vie di segnalazione e spunti di orientamento, come illustrato in precedenza8,28 . Tuttavia, queste analisi si svolgono in una tabella extracellulare artificiale in assenza di architettura tridimensionale del tessuto, che può alterare un neurone proprietà di comportamento e delle cellule, che interessano potenzialmente cella migrazione e/o sopravvivenza25. Per ovviare a queste limitazioni, ex vivo MGE espianti sono stati sviluppati come uno strumento alternativo per quantificare i dinamici cambiamenti morfologici che si verificano durante la migrazione insieme a parametri quali la velocità e l'orientamento14, 29. Generazione di espianti MGE è relativamente semplice ed è stato ampiamente descritto altrove30. Essa comporta la placcatura di un piccolo estratto di MGE su un monostrato di cellule corticali miste o in una miscela di matrigel e collagene in presenza di segnali di attrazione o repulsione25, anche se questi ultimi sono opzionali31. MGE espianti consentono per l'alta risoluzione di imaging delle cellule scarsamente etichettate, semplificando lo studio di processi intracellulari, come rimodellamento del citoscheletro durante processo leader di ramificazione, come illustrato in precedenza32,33 ,34 e nello studio presente. MGE espianti sono stati utilizzati con successo per valutare dinamici cambiamenti citoscheletrici durante la migrazione in un ambiente 2D, ad esempio dopo specifiche manipolazioni farmacologiche o chemiotattiche (Vedi, ad esempio, Tielens et al 201633) . Tuttavia, con questo approccio, INs la migrazione all'interno di una matrice artificiale, e questo potrebbe alterare nel comportamento e la riproducibilità e la significatività dei risultati sperimentali.
Al contrario, nell'utero elettroporazione consente la manipolazione genetica di INs nel loro ambiente nativo ed è un metodo ampiamente usato a rapidamente ed efficientemente valutare l'impatto di guadagno e la perdita di funzione del gene mentre eludere le limitazioni di lunghe e costose knockout e knock-in strategie25,35. Elettroporazione in utero può essere sbilanciata verso nei progenitori utilizzando promotori specifici di tipo cellulare e posizionando gli elettrodi verso le strutture ventromedial, tra cui il MGE36. Inoltre, nell'utero elettroporazione consente l'espressione tempestiva dei costrutti sperimentale entro 1-2 giorni, rispetto al 7-10 giorni necessari per costrutto espressione utilizzando virali vettori25. Tuttavia, nell'utero elettroporazione nei progenitori tende ad essere basso rendimento. Infatti, anche se dei progenitori delle cellule piramidali che si trova nella zona ventricolare dorsale possono essere efficientemente transfected utilizzando nell'utero elettroporazione, targeting più ventralmente trova strutture, come il MGE, è tecnicamente più impegnativo, soprattutto in e13.5 piccoli embrioni e l'alto tasso di letalità embrionale ulteriormente riduce la resa sperimentale25.
Per aggirare alcune delle limitazioni tecniche associate in vitro MGE explant esperimenti e in vivo nell'utero elettroporazione, ex vivo su colture organotipiche fetta sono stati sviluppati8,37, 38,39. Cervello organotipiche fetta culture offerta il vantaggio di che imita in vivo le condizioni, pur essendo meno costoso e che richiede tempo di generazione animale i modelli25. Infatti, queste preparazioni consentono un facile accesso a MGE, insieme con la visualizzazione specifica dell'INs e possono essere combinate con focale elettroporazione per indagare i meccanismi molecolari specifici nella INs la migrazione in un ambiente più fisiologico8 , 39 , 40 , 41. Pertanto abbiamo ottimizzato un approccio per organotipiche culture38, che abbiamo combinato con elettroporazione ex utero e time-lapse imaging confocale, per valutare appieno il processo morfologico e dinamico che si verificano durante la migrazione tangenziale di MGE-INs. Il presente protocollo è stato adattato e ottimizzato da altri che hanno usato le culture di fetta elettroporazione e organotipiche a cervello ex utero o nell'utero per studiare la migrazione delle cellule piramidali42,43 e corticale INs36,39,44. In particolare, gli embrioni del mouse vengono decapitati e MGE è individulamente ex vivo dopo l'iniezione intraventricolare dei plasmidi sperimentali, che permette più efficiente e preciso targeting dei progenitori MGE rispetto a ciò che può essere raggiunto con nell'utero elettroporazione. I cervelli sono quindi estratte e sezionato a fette coronali intero cervello che possono essere coltivate per pochi giorni, consentendo in tal modo continuo monitoraggio e imaging di INs trasfettate. Questo approccio etichette in genere 5-20 INs tangenzialmente la migrazione per fetta di cervello, riducendo al minimo il numero di iterazioni sperimentali necessari per raggiungere la significatività statistica, mentre etichettatura una sufficientemente scarsa densità di popolazione neuronale per garantire facile separazione delle singoli neuroni per la ricostruzione e la valutazione morfologica bene. Inoltre, rispetto al MGE espianti, colture organotipiche garantiscono che la migrazione aggiuntivi sono esposti a un ambiente più naturale, tra cui ingressi da afferenze thalamic e chemochine secrete localmente. Questo approccio è così adatto per quantificare la direzionalità e migratorio percorso adottato da trasfettate INs, offrendo dettagli anatomici sufficienti per consentire la caratterizzazione dei processi dinamici più fini come leader processo ramificazione, nucleokinesis e retrazione del processo finale.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 serum-free supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50X Serum-free neuron specific supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td>Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor&#39;s website&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum, heat inactivated</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>H1138-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurocell supplement N-2 100X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>305-016</td>
			<td>Botteinstein&#39;s N-2 Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Square PETG Media Bottles 125 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89132-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Type A Biosafety Cabinet</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SUC700.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D+ glucose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G7528-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SPM400.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>BiosShop</td>
			<td>MAG522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>AGA002.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-97 Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube</td>
			<td>Drummond scientific</td>
			<td>1-000-800/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Co</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil (heavy)</td>
			<td>Rougier Pharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WPI Swiss Tweezers #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504511</td>
			<td>11 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WPI Swiss Tweezers #7</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504504</td>
			<td>11.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTC Tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504617</td>
			<td>11 cm, Straight, flat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501225</td>
			<td>16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501217</td>
			<td>12.5 cm, straight, serrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504478</td>
			<td>10.2 cm, full curve, serrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeBakey Tissue Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501996</td>
			<td>15 cm, 45&#176; angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbran Microspatula with rounded ends</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>21-401-5</td>
			<td>You will need 2 of these.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond scientific</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 60, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td>60-mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1800</td>
			<td>35-mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Wax</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>S17432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes&#160;</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>170-CTB700-212</td>
			<td>3 mL, small bulb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td>In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro Square Porator</td>
			<td>BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>ECM 830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm</td>
			<td>BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 1 1/2</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Co</td>
			<td>305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1000S Vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEM, Single edge razor blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71952-10</td>
			<td>Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td>Pack of 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell cell culture insert</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td>30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 &#181;m pore, pack of 50.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi6000 microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk confocal head Ultraview Vox</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.0 acquisition software</td>
			<td>Improvision/Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiveCell Stage top incubation system</td>
			<td>Pathology devices</td>
			<td>LC30030</td>
			<td>Provides Temperature, CO2 and humidity control.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-Lifeact-7</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>54491</td>
			<td>Gift from Michael Davidson</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>25G bottle, certified by the Biological Stain Commission</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and organotypic slice cultures of embryonic mouse brains for live-imaging of migrating gabaergic interneurons

Interneuroni GABAergici (INs) sono componenti fondamentali delle reti neuronali che guidano la cognizione e comportamento. INs destinato per popolare la corteccia tangenzialmente migrano dal loro luogo di origine nel telencefalo ventrale (compresi da eminenze gangliare mediale e caudale (MGE, CGE)) alla piastra corticale dorsale in risposta ad una varietà di intrinseche ed estrinseche Stecche pool. Diversi metodi sono stati sviluppati nel corso degli anni per geneticamente manipolare percorsi specifici e indagare come regolano le modifiche dinamiche del citoscheletro necessari per una corretta migrazione. Nell'utero elettroporazione è stato ampiamente utilizzato per studiare l'effetto di repressione genica o sovraespressione in specifici IN sottotipi durante la valutazione dell'impatto sulla morfologia e posizione finale. Tuttavia, mentre questo approccio viene prontamente utilizzato per modificare radialmente migrazione delle cellule piramidali, più tecnicamente è difficile quando ins nell'utero elettroporazione di targeting genera un rendimento basso dato i tassi di sopravvivenza in diminuzione di cuccioli quando l'elettroporazione è condotta prima e 14.5, come di consueto quando si studia INs MGE-derivato. In un approccio alternativo, MGE espianti consentono un facile accesso a MGE e facilitano l'imaging del INs geneticamente modificati. Tuttavia, in questi espianti, INs migrare in una matrice artificiale, priva di spunti di orientamento endogeno e thalamic ingressi. Questo li ha spinti per ottimizzare un metodo dove INs possono migrare in un ambiente più naturalistico, mentre eludere le sfide tecniche di approcci nell'utero . In questo articolo, descriviamo la combinazione dell'elettroporazione ex utero dei cervelli embrionali del mouse seguita da fetta su colture organotipiche prontamente traccia, immagine e ricostruire geneticamente INs la migrazione lungo i loro percorsi naturali in risposta a Stecche pool endogeno. Questo approccio consente sia la quantificazione degli aspetti dinamici della migrazione con Time-lapse imaging confocale, così come l'analisi dettagliata dei vari parametri morfologici utilizzando un neurone ricostruzioni sul tessuto fisso immunolabeled.

In questa sezione forniamo risultati rappresentativi ottenuti seguendo l'elettroporazione ex utero di un plasmide di controllo, o di un plasmide sperimentale un gene di interesse, in MGE degli embrioni del mouse e13.5 seguita da colture organotipiche fetta di targeting incubati a 37 ° C per 48 h (per l'imaging di time-lapse) o 72 h (per la fissazione e l'etichettatura immunohistochemical) (cfr. Figura 1B per protocollo schematico). Esempi rappresent...

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Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex Utero Elettroporazione e colture Organotypic fetta di cervelli embrionali del Mouse per vivere-Imaging di migrazione interneuroni GABAergici

Qui, forniamo un metodo affidabile e a basso costo per generare colture individulamente cervello organotipiche fetta da embrioni del mouse adatti per la microscopia confocale e tecniche di imaging live.

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