Name: ex utero electroporation and organotypic slice cultures of embryonic mouse brains for live-imaging of migrating gabaergic interneurons
Uploaded: 2018-04-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por subvenções da Fundação Savoy e a Fundação de epilepsia de cura de funcionamento e pelo equipamento concede da Fundação Canadense para a inovação de urgência (microscópio confocal) e G.H (microscópio confocal de disco girando). PS. recebe um prémio de carreira do de Fonds recherche du Québec-Santé (FRQ-S; Clinician-Scientist Award), bem como dos institutos canadenses de pesquisa em saúde (CIHR; Prêmio jovem investigador). G.H. é uma professora sênior do FRQ-S. L.E é o destinatário do prêmio Steriade-Savoy formação pós-doutoral da Fundação Savoy, o prêmio de treinamento pós-doutorado de CHU Sainte-Justine Foundation e o prêmio de formação pós-doutoral FRQ-S, em parceria com a Fundação de estrelas. Este projeto foi tornado possível pelo cérebro Canadá através do fundo de investigação do cérebro de Canadá, com o apoio financeiro da saúde do Canadá, atribuído a L.E.

Todos os experimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institutionnel des Bonnes Pratiques avec les Animaux de Recherche (CIBPAR) no centro de pesquisa de Sainte-Justine CHU e foram conduzidos de acordo com o Conselho canadense no guia do cuidado do Animal para o cuidado e o uso de animais experimentais (Ed. 2).
O protocolo descrito aqui foi otimizado para eletroporação de embriões no dia embrionário (e) 13,5, em um momento quando MGE-derivado INs ativamente são gerados, an...

Neste artigo, nós fornecemos um método confiável para a realização de ex utero electroporation do mouse MGE no e13.5 e para a geração de organotypic culturas de fatias do cérebro embrionário. Embora em vitro métodos, tais como o ensaio de câmara de Boyden, são relativamente fáceis de executar e podem ser usados para avaliar as funções específicas de diferentes genes e proteínas, sem a interferência de outros fatores, eles impedem a investigação de IN dinâmica de migração em relaç...

Cortical gabaérgica interneurônios (INs) são diversos em relação a suas propriedades bioquímicas, propriedades fisiológicas e conectividade, e eles medeiam funções diferentes em redes maduro1,2,3 ,4,5. A especificação de diferentes subtipos de INs cortical é fortemente regulamentada através de cascatas genéticas que têm sido extensivamente estudados1,2. A maioria (70%) cortical gabaérgica INs originam progenitores em medial Eminência ganglionar (MGE), uma estrutura embrionária localizada ventralmente e deve migrar através de distâncias relativamente longas para alcançar a placa cortical1, 2 , 6. enquanto células piramidais corticais radialmente migram da zona ventricular (VZ) para a placa cortical ao longo do andaime glia radial, a migração tangencial do INs, que não estão conectados para tal um andaime, requer uma variedade de intrínsecos e extrínsecas pistas para atrair os neurônios migrando em direção a placa cortical, enquanto orientando-os longe de estruturas não-cortical2,7,8. Depois de sair do ciclo celular, INs são repelidos desde a MGE por quimioterapia-repulsivo pistas expressas dentro o VZ da MGE, que desencadeia a migração tangencial em direção a placa cortical9,10. Migrando INs evitar o striatum com o auxílio de diferentes pistas repulsivo11 e, depois de atingir a placa cortical, eles alternar de um tangencial para um modo de migração radial e atingir a posição final laminar, em parte em resposta às sugestões do piramidal células12 e outras populações celulares13. A migração do INs, quanto a outras populações neuronais, envolve várias mudanças morfológicas dinâmicas para permitir o movimento real do neurônio. Este so-called locomoção neuronal é caracterizada por ciclos repetitivos de três etapas sucessivas: o alongamento de um processo principal, um movimento ativo anterógrada do núcleo (nucleocinese) e a retração do processo à direita14. EM migração é regulada por numerosas pistas intrínsecas e extrínsecas que impulsionam a ramificação e remodelação ativo do processo principal para guiar o INs na direção correta, determinando tanto a orientação e a velocidade de migração14,15 ,16.
Os determinantes de regulação cortical em migração têm sido muito estudados nos últimos anos1,2,7,17,18,19,20, e perturbação em alguns desses atores molecular tem sido postulada para levar a distúrbios de desenvolvimento neurológico, como pediátrica refratário epilepsia ou autismo espectro transtornos1,2,21, 22 , 23 , 24. por conseguinte, o desenvolvimento de diversas abordagens in vitro e in vivo tem sido exercido para avançar significativamente a nossa capacidade de estudar este processo dinâmico, como anteriormente analisados25. Em vitro métodos, incluindo o ensaio de câmara Boyden e o ensaio de escolha de listra, fornecem os meios mais rápidos e mais reprodutíveis de avaliar a exigência e o impacto célula autónomos de genes específicos ou proteínas durante a migração neuronal, sem a influência de outros fatores,25. Estes ensaios são particularmente úteis quando combinados com imagens live8,26,27. Com estas técnicas, INs são facilmente obtido e13.5 MGE e isolado por dissociação enzimática e mecânica, após o qual podem ser investigados diferentes vias de sinalização e sinais de orientação, como ilustrado anteriormente8,28 . No entanto, estes ensaios ocorrem em uma matriz extracellular artificial na ausência de arquitetura de tecido tridimensional, que pode alterar as propriedades de comportamento e célula neuronais, potencialmente afetando25, de migração e/ou sobrevivência celular. Para contornar essas limitações, ex vivo MGE explantes foram desenvolvidos como uma ferramenta alternativa para quantificar as mudanças morfológicas dinâmicas que ocorrem durante a migração, juntamente com parâmetros como velocidade e orientação14, 29. Geração de explantes MGE é relativamente simples e tem sido extensivamente descrito em outro lugar30. Implica o chapeamento de um pequeno extracto da MGE em uma monocamada de células corticais mistas ou em uma mistura de matrigel e colágeno na presença de sinais atraente ou repulsivo25, embora este último é opcionais31. MGE explantes permitem alta resolução de imagem de células escassamente rotuladas, simplificando o estudo de processos intracelulares, tais como a remodelação do citoesqueleto durante processo líder de ramificação, conforme mostrado anteriormente,32,33 ,34 e no presente estudo. MGE explantes foram usados com sucesso para avaliar alterações do citoesqueleto dinâmicas durante na migração em um ambiente 2D, por exemplo após manipulações farmacológicas ou Quimiotáticos específicas (ver, por exemplo, Tielens et al . 201633) . No entanto, com esta abordagem, INs migrar dentro de uma matriz artificial, e isso pode alterar no comportamento e a reprodutibilidade e o significado dos resultados experimentais.
Por outro lado, no utero electroporation permite a manipulação genética de INs no seu ambiente nativo e é um método amplamente utilizado para rapidamente e eficientemente a avaliar o impacto do ganho e perda de função dos genes ao contornar as limitações de knockout dispendioso e demorado e bater-se em estratégias de25,35. Electroporation no utero pode ser inclinado para em progenitores utilizando factores específicos de tipo de célula e posicionamento dos eléctrodos para estruturas ventromedial, incluindo o MGE36. Além disso, no utero electroporation permite a expressão oportuna de construções experimentais dentro de 1-2 dias, em comparação com os 7-10 dias necessários para construir a expressão usando viral vectores25. No entanto, no utero eletroporação de em progenitores tende a ser baixo rendimento. Com efeito, apesar de progenitores de célula piramidal localizados na zona dorsal ventricular podem ser eficientemente transfectadas usando no utero electroporation, alvo localizadas ventralmente mais estruturas, tais como o MGE, é mais tecnicamente desafiador, especialmente em pequenas e13.5 embriões e a alta taxa de letalidade embrionária mais reduz o rendimento experimental25.
Para contornar algumas das limitações técnicas associadas com in vitro MGE explant experimentos e na vivo no útero electroporation, ex vivo organotypic fatia culturas foram desenvolvidos8,37,, 38,39. Cérebro organotypic fatia culturas oferta condições a vantagem de imitar em vivo , apesar de ser menos caro e demorado do que animal gerando modelos25. Com efeito, estas preparações permitem um fácil acesso para o MGE, juntamente com a visualização específica de INs e podem ser combinadas com eletroporação focal para investigar as vias moleculares específicas no INs migrando em um mais fisiológica de ambiente8 , 39 , 40 , 41. otimizamos, portanto, uma abordagem por organotypic culturas38, que nós combinamos com ex utero electroporation e imagem latente confocal lapso de tempo, ainda mais, avaliar o processo dinâmico e morfológico ocorrem durante a migração tangencial do MGE-INs. O presente protocolo foi adaptado e otimizado de outros que usaram para estudar a migração de células piramidais42,43 ex utero ou no utero cérebro electroporation e organotypic fatia culturas e cortical INs36,39,44. Especificamente, embriões do rato são decapitados e a MGE é electroporated ex vivo após a injeção intraventricular dos Plasmideos experimentais, permitindo mais eficientes e precisos segmentação dos progenitores MGE do que o que pode ser conseguido com electroporation no útero . O cérebro então é extraído e seccionados em fatias coronais do cérebro inteiro que podem ser cultivadas por alguns dias, permitindo assim contínuo monitoramento e imagem da INs transfectadas. Essa abordagem normalmente rotula INs tangencialmente migrando 5-20 por fatia do cérebro, minimizando o número de iterações experimentais necessária para alcançar significância estatística, enquanto rotular uma população neuronal suficientemente escassa para garantir a fácil separação de neurônios individuais para a reconstrução e a avaliação morfológica bem. Além disso, comparado a MGE explantes, culturas de organotypic garantir que migrando INs estão expostos a um ambiente mais natural, incluindo quimiocinas secretadas localmente e entradas de afferents talâmica. Esta abordagem é, portanto, adequada para quantificar a direcionalidade e migratório caminho adotado pelo INs transfectadas, oferecendo detalhes anatômicos suficientes para permitir a caracterização dos processos dinâmicos mais finas tais como principal processo de ramificação, nucleocinese e retração de processo à direita.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 serum-free supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50X Serum-free neuron specific supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td>Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor&#39;s website&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum, heat inactivated</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>H1138-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurocell supplement N-2 100X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>305-016</td>
			<td>Botteinstein&#39;s N-2 Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Square PETG Media Bottles 125 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89132-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Type A Biosafety Cabinet</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SUC700.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D+ glucose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G7528-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SPM400.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>BiosShop</td>
			<td>MAG522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>AGA002.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-97 Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube</td>
			<td>Drummond scientific</td>
			<td>1-000-800/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Co</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil (heavy)</td>
			<td>Rougier Pharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WPI Swiss Tweezers #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504511</td>
			<td>11 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WPI Swiss Tweezers #7</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504504</td>
			<td>11.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTC Tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504617</td>
			<td>11 cm, Straight, flat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501225</td>
			<td>16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501217</td>
			<td>12.5 cm, straight, serrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504478</td>
			<td>10.2 cm, full curve, serrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeBakey Tissue Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501996</td>
			<td>15 cm, 45&#176; angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbran Microspatula with rounded ends</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>21-401-5</td>
			<td>You will need 2 of these.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond scientific</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 60, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td>60-mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1800</td>
			<td>35-mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Wax</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>S17432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes&#160;</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>170-CTB700-212</td>
			<td>3 mL, small bulb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td>In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro Square Porator</td>
			<td>BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>ECM 830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm</td>
			<td>BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 1 1/2</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Co</td>
			<td>305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1000S Vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEM, Single edge razor blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71952-10</td>
			<td>Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td>Pack of 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell cell culture insert</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td>30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 &#181;m pore, pack of 50.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi6000 microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk confocal head Ultraview Vox</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.0 acquisition software</td>
			<td>Improvision/Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiveCell Stage top incubation system</td>
			<td>Pathology devices</td>
			<td>LC30030</td>
			<td>Provides Temperature, CO2 and humidity control.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-Lifeact-7</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>54491</td>
			<td>Gift from Michael Davidson</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>25G bottle, certified by the Biological Stain Commission</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and organotypic slice cultures of embryonic mouse brains for live-imaging of migrating gabaergic interneurons

Gabaérgica interneurônios (INs) são componentes críticos de redes neuronais que orientam o comportamento e cognição. INs, destinado a preencher o córtex tangencialmente migrar do seu local de origem no telencéfalo ventral (incluindo das Eminências medial e caudais ganglionar (MGE, CGE)) para a placa cortical dorsal em resposta a uma variedade de intrínsecos e extrínsecos sugestões. Diferentes metodologias foram desenvolvidas ao longo dos anos geneticamente manipular percursos específicos e investigar como eles regulam as alterações do citoesqueleto dinâmicas necessárias para adequado em migração. No utero electroporation tem sido extensivamente usado para estudar o efeito da repressão do gene ou superexpressão no específico em subtipos durante a avaliação do impacto sobre a morfologia e a posição final. No entanto, enquanto essa abordagem é facilmente usada para modificar radialmente migração células piramidais, é mais tecnicamente desafiador quando direcionamento ins no utero electroporation gera um baixo rendimento, tendo em conta as taxas de sobrevivência diminuída dos filhotes quando eletroporação é realizada antes de e14.5, como é habitual quando estudando MGE-derivado INs. Em uma abordagem alternativa, MGE explantes proporcionam fácil acesso para o MGE em facilitam a imagem de INs geneticamente modificados. No entanto, nesses explantes, INs migrar para uma matriz artificial, desprovida de pistas de orientação endógena e entradas talâmicos. Isto nos levou a otimizar um método onde INs pode migrar em um ambiente mais naturalista, ao contornar os desafios técnicos das abordagens no útero . Neste trabalho, descrevemos a combinação de ex utero electroporation do cérebro embrionário do mouse seguido de culturas de fatia organotypic facilmente rastrear, imagem e reconstruir geneticamente modificados INs migrando ao longo de seus caminhos naturais em resposta a cues endógenas. Esta abordagem permite tanto a quantificação dos aspectos dinâmicos na migração com imagem latente confocal lapso de tempo, bem como a análise pormenorizada dos vários parâmetros morfológicos usando reconstruções neuronais no tecido fixo immunolabeled.

Nesta seção, nós fornecemos resultados representativos obtidos seguindo o electroporation ex utero de um plasmídeo de controle, ou um plasmídeo experimental visando um gene de interesse, a MGE de embriões de rato e13.5 seguido por organotypic fatia de culturas incubadas a 37 ° C por 48 h (para a imagem latente de lapso de tempo) ou 72 h (para fixação e rotulação de imuno-histoquímica) (ver figura 1B para protocolo esquemático). Exemplos ...

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Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex Utero Eletroporação e culturas Organotypic fatia do cérebro embrionário Mouse para imagens ao vivo de migração gabaérgica interneurônios

Aqui, nós fornecemos um método confiável e de baixo custo para gerar electroporated culturas do cérebro organotypic fatia de embriões do rato apropriados para microscopia confocal e técnicas de geração de imagens ao vivo.

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