Name: adeno-associated virus-mediated delivery of crispr for cardiac gene editing in mice
Uploaded: 2018-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice at JoVE.com

R.H. est pris en charge par le U.S. National Institutes of subventions de santé (R01HL116546 et AR064241 R01).

Les animaux utilisés dans le présent protocole sont gardés à l’Ohio State University laboratoire Animal ressources conformément aux directives d’utilisation des animaux. Toutes les études animales ont été autorisés par l’animalier institutionnel, utilisation et Comité d’examen de l’Ohio State University.
1. conception et clonage de gRNAs dans le vecteur CRISPR
<ol><li>Sélectionnez 2 gRNAs ciblant la dystrophine intron 20 et intron 23 (i20 et i23) pour SaCas9 : i20 : 5'...

<ol>
	<li>Makarova, K. S., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annotation+and+Classification+of+CRISPR-Cas+Systems.">Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems.</a> Methods Mol Biol. 1311, 47-75 (2015).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163, 759-771 (2015).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li><li>Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+double-strand+DNA+break+repair+by+the+nonhomologous+DNA+end-joining+pathway.">The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway.</a> Annual review of biochemistry. 79, 181-211 (2010).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature protocols. 8, 2281-2308 (2013).</li><li>Zhang, X., Wang, J., Cheng, Q., Zheng, X., Zhao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+gene+regulation+by+CRISPR-ddCpf1.">Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1.</a> Cell discovery. 3, 17018 (2017).</li><li>Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+Effects+in+CRISPR/Cas9-mediated+Genome+Engineering.">Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering.</a> Molecular therapy. Nucleic acids. 4, e264 (2015).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+genome+editing+restores+dystrophin+expression+and+function+in+mdx+mice.">CRISPR-mediated genome editing restores dystrophin expression and function in mdx mice.</a> Mol Ther. 24, 564-569 (2015).</li><li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+genome+editing+partially+restores+dystrophin+expression+in+a+mouse+model+of+muscular+dystrophy.">Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy.</a> Science. 351, 400-403 (2016).</li><li>Long, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+muscular+dystrophy+in+mice+by+CRISPR/Cas9-mediated+editing+of+germline+DNA.">Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA.</a> Science. 345, 1184-1188 (2014).</li><li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+improves+muscle+function+in+a+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 351, 403-407 (2016).</li><li>Ousterout, D. G. K., Thakore, A. M., Majoros, P. I., Reddy, T. E. W. H., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+CRISPR/Cas9-based+genome+editing+for+correction+of+dystrophin+mutations+that+cause+Duchenne+muscular+dystrophy.">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy.</a> Nat Commun. 6, 6244 (2015).</li><li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+editing+in+dystrophic+mouse+muscle+and+muscle+stem+cells.">In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells.</a> Science. 351, 407-411 (2016).</li><li>Bengtsson, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle-specific+CRISPR/Cas9+dystrophin+gene+editing+ameliorates+pathophysiology+in+a+mouse+model+for+Duchenne+muscular+dystrophy.">Muscle-specific CRISPR/Cas9 dystrophin gene editing ameliorates pathophysiology in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy.</a> Nat Commun. 8, 14454 (2017).</li><li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin:+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus.">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51, 919-928 (1987).</li><li>Nowak, K. J., Davies, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy+and+dystrophin:+pathogenesis+and+opportunities+for+treatment.">Duchenne muscular dystrophy and dystrophin: pathogenesis and opportunities for treatment.</a> EMBO reports. 5, 872-876 (2004).</li><li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy.">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of neurology. 71, 304-313 (2012).</li><li>Mendell, J. R., Lloyd-Puryear, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+of+MDA+muscle+disease+symposium+on+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy.">Report of MDA muscle disease symposium on newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Muscle Nerve. 48, 21-26 (2013).</li><li>Spurney, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyopathy+of+Duchenne+muscular+dystrophy:+current+understanding+and+future+directions.">Cardiomyopathy of Duchenne muscular dystrophy: current understanding and future directions.</a> Muscle Nerve. 44, 8-19 (2011).</li><li>Moriuchi, T., Kagawa, N., Mukoyama, M., Hizawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autopsy+analyses+of+the+muscular+dystrophies.">Autopsy analyses of the muscular dystrophies.</a> Tokushima J Exp Med. 40, 83-93 (1993).</li><li>McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+in+the+therapy+of+cardiomyopathy+in+muscular+dystrophy.">New approaches in the therapy of cardiomyopathy in muscular dystrophy.</a> Annual review of medicine. 58, 75-88 (2007).</li><li>Baker, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approvals,+Submission,+and+Important+Labeling+Changes+for+US+Marketed+Pharmaceuticals.">Approvals, Submission, and Important Labeling Changes for US Marketed Pharmaceuticals.</a> Hosp Pharm. 52, 306-307 (2013).</li><li>Baker, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eteplirsen.">Eteplirsen.</a> Hosp Pharm. 52, 302-305 (2017).</li><li>Sicinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+muscular+dystrophy+in+the+mdx+mouse:+a+point+mutation.">The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation.</a> Science. 244, 1578-1580 (1989).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+Genome+Editing+Restores+Dystrophin+Expression+and+Function+in+mdx+Mice.">CRISPR-mediated Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Function in mdx Mice.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 24, 564-569 (2016).</li><li>El Refaey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Genome+Editing+Restores+Dystrophin+Expression+and+Cardiac+Function+in+Dystrophic+Mice.">In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice.</a> Circ Res. 121, 923-929 (2017).</li><li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+editing+in+dystrophic+mouse+muscle+and+muscle+stem+cells.">In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells.</a> Science. 351, 407-411 (2016).</li><li>Pozsgai, E. R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Sarcoglycan+gene+transfer+decreases+fibrosis+and+restores+force+in+LGMD2E+mice.">beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice.</a> Gene therapy. 23, 57-66 (2016).</li><li>Chicoine, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmapheresis+eliminates+the+negative+impact+of+AAV+antibodies+on+microdystrophin+gene+expression+following+vascular+delivery.">Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery.</a> Mol Ther. 22, 338-347 (2014).</li><li>Chicoine, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+delivery+of+rAAVrh74.MCK.GALGT2+to+the+gastrocnemius+muscle+of+the+rhesus+macaque+stimulates+the+expression+of+dystrophin+and+laminin+alpha2+surrogates.">Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates.</a> Mol Ther. 22, 713-724 (2014).</li><li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases.">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5, 407-415 (2015).</li><li>Tsai, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GUIDE-seq+enables+genome-wide+profiling+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas+nucleases.">GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.</a> Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).</li></ol>

Dans ce protocole, nous détaillons toutes les étapes nécessaires à la réalisation en vivo gène cardiaque édition chez les souris post-natal utilisant livraison induite par le rAAVrh.74 de SaCas9 et deux gRNAs. Comme mentionné plus haut, cette approche peut être utilisée pour restaurer l’expression de la dystrophine dans les souris dystrophiques tel que décrit dans notre travail27, mais il pourrait aussi permettre des études de génétique inverse rapide des gènes cardiaques...

La cluster, dois‑je régulièrement et brève palindromique répéter (CRISPR) technologie représente la plus récente avancée dans l’ingénierie du génome et a révolutionné la pratique actuelle de la génétique dans les cellules et des organismes. Axée sur les CRISPR génome édition utilise un seul guide RNA (gRNA) pour diriger une endonucléase CRISPR associés tels que les protéines associées aux CRISPR 9 (Cas9) et Cpf1 à une cible d’ADN génomique complémentaire dans l’ordre à le protospacer codée par le gRNA avec un protospacer spécifiques motif adjacent (PAM)1,2. La PAM varie en fonction de l’espèce bactérienne du gène Cas9 ou Cpf1. La nucléase Cas9 plus couramment utilisée, dérivée de Streptococcus pyogenes (SpCas9) reconnaît une séquence de PAM de NGG qui se trouve directement en aval de la séquence cible dans l’ADN génomique, sur le brin non ciblés. Sur le site de la cible, les protéines Cas9 et Cpf1 de générer une interruption de double-brin (DSB), qui est alors réparée via intrinsèques mécanismes de réparation ADN cellulaires y compris la fin non homologue rejoindre (NHEJ) et axés sur l’homologie réparation (HDR) voies3, 4. En l’absence d’une matrice d’ADN de recombinaison homologue, l’ORD est principalement réparé par la voie NHEJ erreurs, ce qui peut entraîner dans les insertions ou les suppressions (indels) des nucléotides, causant des mutations de déphasage si l’ORD ont été créé dans le codage région d’un gène5,6. Ainsi, le système CRISPR a été employé couramment à l’ingénieur mutations perte de fonction différents modèles cellulaires et des organismes entiers, afin d’étudier la fonction d’un gène. En outre, le catalytiquement inactif Cas9 et Cpf1 ont été développés pour transcription et épigénétiquement modulent l’expression des gènes de cible7,8.
Plus récemment, les SpCas9 et les SaCas9 (dérivé de Staphylococcus aureus) ont été emballés dans des vecteurs recombinants virus adeno-associé (rAAV) pour la correction de gène postnatal dans les modèles animaux de maladies humaines, en particulier, de Duchenne musculaire de Duchenne (DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD est une maladie récessive liée à le X mortelle causée par des mutations dans le gène DMD , qui encode la dystrophine protéine16,17, affectant environ un dans 3500 naissances de garçons selon dépistage néonatal18 , 19. il est caractérisé par une faiblesse musculaire progressive et gaspiller. Les patients DMD perdent généralement la capacité de marcher entre 10 et 12 ans et meurent d’insuffisance respiratoire et/ou cardiaque à l’âge de 20-30 ans20. Notamment, la cardiomyopathie se développe à > 90 % des patients DMD et représente la principale cause de décès chez les patients DMD21,22. Bien que déflazacort (un médicament anti-inflammatoire) et Eteplirsen (un exon skipping médecine pour ignorer l’exon 51) ont récemment été approuvés pour DMD par la Food and Drug Administration (FDA)23,24, aucun de ces traitements corriger l’anomalie génétique dans l’ADN génomique. La souris mdx, qui porte une mutation ponctuelle au exon 23 du gène de la dystrophine, a été largement utilisée comme un modèle DMD25. En outre, nous avons démontré précédemment que l’expression de la dystrophine fonctionnelle a été restaurée par la suppression dans le cadre de l’ADN génomique couvrant les exons, 21, 22 et 23 dans les muscles squelettiques des souris mdx à l’aide d’intramusculaire Ad-SpCas9/gRNA livraison9 et dans les muscles du cœur de mdx/utrophine+/- souris à l’aide de livraison de rAAVrh.74-SaCas9/gRNA par voie intraveineuse et intrapéritonéale26.
Dans ce protocole, nous décrivons en détail toutes les étapes dans l’édition de gène cardiaque postnatale pour restaurer la dystrophine dans mdx/utrophine+/- souris à l’aide de vecteurs de rAAVrh.74-SaCas9/gRNA, de gRNA conception à l’analyse de la dystrophine dans les sections de muscle de coeur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio Safety Cabinets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1347</td>
			<td>1300 Series A2 Class II, Type A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI</td>
			<td>New England BioLabs Inc</td>
			<td>RO535S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Competent cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes, 150mm</td>
			<td>Nest Scientific USA</td>
			<td>715001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Leica CM3050S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT10017CV</td>
			<td>Corning cellgro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dystrophin antibody</td>
			<td>Spring Bioscience</td>
			<td>E2660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast-Ion Midi Plasmdi Kits</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26-140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Unit, 0.45&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>166-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Master Mixes</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed plasmid mini kit</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab139501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp 2239 Water Bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-460-11Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Heat Block</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy, LLC</td>
			<td></td>
			<td>LSM 780</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015243001</td>
			<td>LightCycler 480 Instrument II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Capacity Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-910</td>
			<td>Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002445</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td>NanoDrop&#8482; 2000/2000c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos for i20-F</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>CACCgGGCGTTGAAATTCTCATTAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos for i20-R</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos for i23-F</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>CACCgCACCGATGAGAGGGAAAGGTC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos for i23-R</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89510-1kg-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Seal centrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter Inc</td>
			<td>342414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>QS2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Inc</td>
			<td>337922</td>
			<td>Type 70Ti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England BioLabs Inc</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter Inc</td>
			<td>8043-30-1192</td>
			<td>Optima le-80k</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifugal filter unit</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC510096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories, Inc</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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adeno-associated virus-mediated delivery of crispr for cardiac gene editing in mice

Le système (CRISPR) répéter en cluster, régulièrement dois‑je, court palindrome a grandement facilité le génie du génome dans les cellules cultivées et les organismes vivants d’une grande variété d’espèces. La technologie CRISPR a aussi été utilisée comme thérapeutiques novatrices pour un certain nombre de maladies humaines. Validation des données sont très encourageantes, comme exemplifié par des études récentes qui démontrent la faisabilité et l’efficacité du gène modification thérapeutique approche pour la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) à l’aide d’un modèle murin. En particulier, injection intraveineuse et intrapéritonéale de la rh.74 de sérotype recombinant virus adeno-associé (rAAV) (rAAVrh.74) a permis une prestation cardiaque efficace des Staphylococcus aureus protéine associée à la CRISPR 9 (SaCas9) et deux Guide de RNAs (gRNA) pour supprimer une région génomique avec un codon mutant dans l’exon 23 du gène Dmd de souris. La même approche peut également servir d’assommer le gène d’intérêt et d’étudier leur fonction cardiaque chez les souris après la naissance lorsque le gRNA est conçu pour cibler la région codante du gène. Dans ce protocole, nous montrent en détail comment l’ingénieur vecteur rAAVrh.74-CRISPR et l’accouchement cardiaque très efficace chez les souris néonatales.

L’efficacité de la gRNAs pour induire la suppression de la région de l’ADN génomique cible doit être évaluée dans des cultures cellulaires avant l’emballage dans le rAAV pour études in vivo. À cette fin, le gRNAs et les constructions exprimant le SaCas9 étaient électroporation C2C12 cellules et l’ADN génomique a été analysée par PCR avec des amorces bordant les sites cibles (Figure 1). Un produit PCR de ~ 500 bp indique la suppression r?...

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Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour réaliser en vivo gène cardiaque édition chez la souris à l’aide de Virus recombinant de Adeno-Associated (rAAV)-mediated livraison de CRISPR. Ce protocole propose une stratégie thérapeutique prometteuse pour traiter la cardiomyopathie dystrophique dans la dystrophie musculaire de Duchenne et peut être utilisé pour générer des knockout spécifique cardiaque chez les souris après la naissance.

Adéno-associés de livraison induite par le Virus de CRISPR gène cardiaque édition chez la souris

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Research

JoVE Journal

Medicine

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

Haute-efficacité de la transduction des cellules cancéreuses du foie par recombinants sérotype virus adéno-associé 3 Vecteurs

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Recherche

Médecine

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Création et propagation des tumeurs de l&#39;homme en rétinoblastome immunitaire chez les souris déficientes

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Production et détection d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) dans les cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

Test de stress cardiaque induite par la dobutamine et surveillé par cathétérisme cardiaque chez la souris

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Un modèle de cancer de la vessie orthotopique d&#39;études livraison Gene

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Bile ligature du canal chez la souris: induction de inflammatoire lésions hépatiques et les fibrose par obstructive cholestase

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

Utilisant le virus adéno-associé comme un outil pour étudier les obstacles dans la maladie de la rétine

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

Élaboration d&#39;un modèle de rat à base alpha-synucléine pour la maladie de Parkinson par injection stéréotaxique d&#39;un vecteur viral adéno-associé recombinant

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Infarctus du myocarde chez les souris néonatales, Un modèle de régénération cardiaque

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Approche postérieure Canal semicirculaire pour la livraison de gène oreille interne chez les souris néonatales

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...