Name: adeno-associated virus-mediated delivery of crispr for cardiac gene editing in mice
Uploaded: 2018-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice at JoVE.com

H.R. es apoyado por los E.E.U.U. institutos nacionales de salud subvenciones (R01HL116546 R01 AR064241).

Los animales utilizados en el presente Protocolo se mantuvieron en recursos de animales de laboratorio de estado de Ohio la Universidad conforme a las directrices de uso de animales. Todos los estudios en animales fueron autorizados por el institucional Animal cuidado, uso y Comité de revisión de la Universidad Estatal de Ohio.
1. diseño y reproducción de gRNAs en el Vector CRISPR
<ol><li>Seleccione 2 gRNAs a distrofina intrón 20 y del intrón 23 (i20 y i23) para SaCas9: i20: 5'-GGGCGTT...

<ol>
	<li>Makarova, K. S., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annotation+and+Classification+of+CRISPR-Cas+Systems.">Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems.</a> Methods Mol Biol. 1311, 47-75 (2015).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163, 759-771 (2015).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339, 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li><li>Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+double-strand+DNA+break+repair+by+the+nonhomologous+DNA+end-joining+pathway.">The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway.</a> Annual review of biochemistry. 79, 181-211 (2010).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature protocols. 8, 2281-2308 (2013).</li><li>Zhang, X., Wang, J., Cheng, Q., Zheng, X., Zhao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+gene+regulation+by+CRISPR-ddCpf1.">Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1.</a> Cell discovery. 3, 17018 (2017).</li><li>Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+Effects+in+CRISPR/Cas9-mediated+Genome+Engineering.">Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering.</a> Molecular therapy. Nucleic acids. 4, e264 (2015).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+genome+editing+restores+dystrophin+expression+and+function+in+mdx+mice.">CRISPR-mediated genome editing restores dystrophin expression and function in mdx mice.</a> Mol Ther. 24, 564-569 (2015).</li><li>Long, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+genome+editing+partially+restores+dystrophin+expression+in+a+mouse+model+of+muscular+dystrophy.">Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy.</a> Science. 351, 400-403 (2016).</li><li>Long, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+muscular+dystrophy+in+mice+by+CRISPR/Cas9-mediated+editing+of+germline+DNA.">Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA.</a> Science. 345, 1184-1188 (2014).</li><li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+improves+muscle+function+in+a+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Science. 351, 403-407 (2016).</li><li>Ousterout, D. G. K., Thakore, A. M., Majoros, P. I., Reddy, T. E. W. H., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+CRISPR/Cas9-based+genome+editing+for+correction+of+dystrophin+mutations+that+cause+Duchenne+muscular+dystrophy.">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy.</a> Nat Commun. 6, 6244 (2015).</li><li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+editing+in+dystrophic+mouse+muscle+and+muscle+stem+cells.">In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells.</a> Science. 351, 407-411 (2016).</li><li>Bengtsson, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle-specific+CRISPR/Cas9+dystrophin+gene+editing+ameliorates+pathophysiology+in+a+mouse+model+for+Duchenne+muscular+dystrophy.">Muscle-specific CRISPR/Cas9 dystrophin gene editing ameliorates pathophysiology in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy.</a> Nat Commun. 8, 14454 (2017).</li><li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin:+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus.">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51, 919-928 (1987).</li><li>Nowak, K. J., Davies, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy+and+dystrophin:+pathogenesis+and+opportunities+for+treatment.">Duchenne muscular dystrophy and dystrophin: pathogenesis and opportunities for treatment.</a> EMBO reports. 5, 872-876 (2004).</li><li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy.">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of neurology. 71, 304-313 (2012).</li><li>Mendell, J. R., Lloyd-Puryear, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+of+MDA+muscle+disease+symposium+on+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy.">Report of MDA muscle disease symposium on newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Muscle Nerve. 48, 21-26 (2013).</li><li>Spurney, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyopathy+of+Duchenne+muscular+dystrophy:+current+understanding+and+future+directions.">Cardiomyopathy of Duchenne muscular dystrophy: current understanding and future directions.</a> Muscle Nerve. 44, 8-19 (2011).</li><li>Moriuchi, T., Kagawa, N., Mukoyama, M., Hizawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autopsy+analyses+of+the+muscular+dystrophies.">Autopsy analyses of the muscular dystrophies.</a> Tokushima J Exp Med. 40, 83-93 (1993).</li><li>McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+in+the+therapy+of+cardiomyopathy+in+muscular+dystrophy.">New approaches in the therapy of cardiomyopathy in muscular dystrophy.</a> Annual review of medicine. 58, 75-88 (2007).</li><li>Baker, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approvals,+Submission,+and+Important+Labeling+Changes+for+US+Marketed+Pharmaceuticals.">Approvals, Submission, and Important Labeling Changes for US Marketed Pharmaceuticals.</a> Hosp Pharm. 52, 306-307 (2013).</li><li>Baker, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eteplirsen.">Eteplirsen.</a> Hosp Pharm. 52, 302-305 (2017).</li><li>Sicinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+muscular+dystrophy+in+the+mdx+mouse:+a+point+mutation.">The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation.</a> Science. 244, 1578-1580 (1989).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+Genome+Editing+Restores+Dystrophin+Expression+and+Function+in+mdx+Mice.">CRISPR-mediated Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Function in mdx Mice.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 24, 564-569 (2016).</li><li>El Refaey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Genome+Editing+Restores+Dystrophin+Expression+and+Cardiac+Function+in+Dystrophic+Mice.">In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice.</a> Circ Res. 121, 923-929 (2017).</li><li>Tabebordbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+editing+in+dystrophic+mouse+muscle+and+muscle+stem+cells.">In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells.</a> Science. 351, 407-411 (2016).</li><li>Pozsgai, E. R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Sarcoglycan+gene+transfer+decreases+fibrosis+and+restores+force+in+LGMD2E+mice.">beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice.</a> Gene therapy. 23, 57-66 (2016).</li><li>Chicoine, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmapheresis+eliminates+the+negative+impact+of+AAV+antibodies+on+microdystrophin+gene+expression+following+vascular+delivery.">Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery.</a> Mol Ther. 22, 338-347 (2014).</li><li>Chicoine, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+delivery+of+rAAVrh74.MCK.GALGT2+to+the+gastrocnemius+muscle+of+the+rhesus+macaque+stimulates+the+expression+of+dystrophin+and+laminin+alpha2+surrogates.">Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates.</a> Mol Ther. 22, 713-724 (2014).</li><li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases.">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5, 407-415 (2015).</li><li>Tsai, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GUIDE-seq+enables+genome-wide+profiling+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas+nucleases.">GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.</a> Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).</li></ol>

En este protocolo, detallamos todos los pasos necesarios para lograr en vivo gene cardiaco edición en ratones postnatales con entrega mediada por el rAAVrh.74 de SaCas9 y dos gRNAs. Como se señaló anteriormente, este enfoque puede utilizarse para restaurar la expresión de distrofina en ratones distróficos como se describe en nuestro trabajo27, pero también podría permitir estudios de genética reversa rápida de genes relacionados con cardiaco en ratones sin el largo proceso de la ...

El cluster regularmente otro corto palindrómico repetición (CRISPR) tecnología, representa el avance más reciente en la ingeniería del genoma y ha revolucionado la práctica actual de la genética en las células y organismos. La edición del genoma basado en CRISPR utiliza una guía única RNA (gRNA) para dirigir una endonucleasa asociada a CRISPR como proteína CRISPR 9 (Cas9) y Cpf1 con un objetivo de ADN genómico que es complementario en orden a la protospacer codificada por el gRNA con un protospacer específico motivo adyacente (PAM)1,2. El PAM varía dependiendo de la especie bacteriana del gen Cas9 o Cpf1. El más comúnmente utilizado nucleasa Cas9 derivado de Streptococcus pyogenes (SpCas9) reconoce una secuencia de PAM de NGG que en el ADN genómico, en la cadena de destino no se encuentra directamente aguas abajo de la secuencia de destino. En el sitio de destino, las proteínas Cas9 y Cpf1 generan una rotura de doble cadena (DSB), que entonces se repara vía intrínseca celular ADN mecanismos de reparación incluyendo final no homólogo a (NHEJ) y vías de reparación dirigido por homología (HDR)3, 4. En ausencia de una plantilla de ADN por recombinación homóloga, el OSD se repara sobre todo por la vía NHEJ propenso, que puede resultar en inserciones o deleciones (indels) de nucleótidos causando mutaciones del mutágeno ' frameshift ' si el OSD se crearon en la codificación región de un gen5,6. Así, el sistema CRISPR ha sido ampliamente utilizado para las mutaciones de pérdida de función en varios modelos de celulares y organismos enteros, con el fin de investigar la función de un gen. Por otra parte, el catalítico inactivo Cas9 Cpf1 transcripcionalmente se han desarrollado para y epigenéticamente modulan la expresión de genes de destino7,8.
Más recientemente, SpCas9 y SaCas9 (derivado de estafilococo áureo) han sido empaquetados en vectores de virus adeno-asociado recombinante (rAAV) para la corrección del gen postnatal en modelos animales de enfermedades humanas, en particular, Duchenne distrofia muscular (DMD)9,10,11,12,13,14,la15. DMD es una enfermedad recesiva x-ligada fatal causada por mutaciones en el gen DMD , que codifica la distrofina proteína16,17, que afecta a aproximadamente uno en 3500 nacimientos masculinos según evaluación del recién nacido18 , 19. se caracteriza por debilidad muscular progresiva y pérdida. Los pacientes DMD suelen perder la habilidad de caminar entre 10 y 12 años de edad y mueren de insuficiencia respiratoria o cardiaca a la edad de 20-30 años20. En particular, la miocardiopatía se convierte en > 90% de los pacientes DMD y representa la causa principal de muerte en pacientes DMD21,22. Aunque Deflazacort (una droga antiinflamatoria) y Eteplirsen (un exón que salta medicina para salto de exón 51) se han aprobado recientemente para DMD por alimentos y drogas (FDA)23,24, ninguno de estos tratamientos corregir el defecto genético en el nivel genomic de la DNA. El ratón mdx, que lleva una mutación de punto en el exón 23 del gene del dystrophin, ha sido ampliamente utilizado como un modelo DMD25. Además, previamente demostramos que la expresión de distrofina funcional fue restablecida por la eliminación en el marco de la DNA genomic que abarca exones 21, 22 y 23 en los músculos esqueléticos de ratones mdx con entrega de Ad-SpCas9/gRNA intramuscular9 y en los músculos del corazón de mdx/utrophin+- ratones con entrega rAAVrh.74-SaCas9/gRNA intravenosa e intraperitoneales26.
En este protocolo, describimos en detalle cada paso en la edición de postnatal gen cardiaca para restaurar distrofina en mdx/utrophin+- ratones utilizando vectores de rAAVrh.74-SaCas9/gRNA, de gRNA diseño análisis de distrofina en las secciones de músculo de corazón.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio Safety Cabinets</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1347</td>
			<td>1300 Series A2 Class II, Type A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI</td>
			<td>New England BioLabs Inc</td>
			<td>RO535S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Competent cells</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes, 150mm</td>
			<td>Nest Scientific USA</td>
			<td>715001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Leica CM3050S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MT10017CV</td>
			<td>Corning cellgro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dystrophin antibody</td>
			<td>Spring Bioscience</td>
			<td>E2660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast-Ion Midi Plasmdi Kits</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26-140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Unit, 0.45&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>166-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Master Mixes</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed plasmid mini kit</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab139501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp 2239 Water Bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-460-11Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Heat Block</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy, LLC</td>
			<td></td>
			<td>LSM 780</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015243001</td>
			<td>LightCycler 480 Instrument II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Capacity Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>46-910</td>
			<td>Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002445</td>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td>NanoDrop&#8482; 2000/2000c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos for i20-F</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>CACCgGGCGTTGAAATTCTCATTAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos for i20-R</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos for i23-F</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>CACCgCACCGATGAGAGGGAAAGGTC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos for i23-R</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89510-1kg-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-Seal centrifuge tube</td>
			<td>Beckman Coulter Inc</td>
			<td>342414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits</td>
			<td>Alkali Scientific</td>
			<td>QS2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Inc</td>
			<td>337922</td>
			<td>Type 70Ti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England BioLabs Inc</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter Inc</td>
			<td>8043-30-1192</td>
			<td>Optima le-80k</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifugal filter unit</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC510096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories, Inc</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adeno-associated virus-mediated delivery of crispr for cardiac gene editing in mice

Agrupado, regularmente otro, corto, palindrómico repetición (CRISPR) sistema ha facilitado enormemente ingeniería del genoma en células cultivadas y los organismos vivos de una gran variedad de especies. La tecnología CRISPR también se ha explorado como novela terapéutica para un número de enfermedades humanas. Datos de prueba de concepto son altamente alentadores ejemplificado por estudios recientes que demuestran la viabilidad y la eficacia del enfoque terapéutico basado en la edición de gene para la distrofia muscular de Duchenne (DMD) utilizando un modelo murino. En particular, intravenosa e intraperitoneal inyección de la rh.74 del serotipo del virus adeno-asociado recombinante (rAAV) (rAAVrh.74) ha permitido la entrega eficiente cardiaca de Staphylococcus aureus proteína CRISPR 9 (SaCas9) y dos Guía RNAs (gRNA) para eliminar una región genómica con un codón mutante en el exón 23 del gen Dmd de ratón. Este mismo método puede utilizarse también para noquear el gen de interés y estudiar su función cardiaca en ratones postnatales cuando el gRNA está diseñado para atacar la región codificante del gen. En este protocolo, se muestra en detalle cómo Ingeniero vector rAAVrh.74 CRISPR y cómo lograr el parto alta eficiencia cardiaca en ratones neonatales.

Debe evaluarse la eficacia de los gRNAs para inducir la supresión de la región Diana de ADN genómica en cultivos celulares antes de empaquetar a rAAV para estudios in vivo. Con este fin, los gRNAs y construcciones expresando SaCas9 eran electroporated en las células C2C12 y el ADN genómico se analizó por PCR con los cebadores que flanquean los sitios de destino (figura 1). Un producto PCR de ~ 500 bp indica eliminación exitosa de la DNA genomic de dest...

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Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

Aquí proporcionamos un protocolo detallado para llevar a cabo en vivo gene cardiaco edición en ratones usando Virus de Adeno-Associated recombinante (rAAV)-mediado entrega de CRISPR. Este protocolo ofrece una estrategia terapéutica prometedora para tratar cardiomiopatía distrófica en distrofia muscular de Duchenne y puede utilizarse para generar nocaut cardiaco específico en los ratones postnatales.

Entrega de mediada por Virus adeno-asociado de CRISPR para Gene cardiaco en ratones

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Research

JoVE Journal

Medicine

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

De alta eficiencia de transducción de las células de cáncer de hígado por recombinante serotipo del virus adeno-asociado 3 Vectores

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Investigación

Medicina

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Establecimiento y propagación de los tumores del retinoblastoma humanos en ratones con deficiencia inmune

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Producción y la detección de especies reactivas del oxígeno (ROS) en los cánceres

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

Prueba de esfuerzo cardíaco inducida por dobutamina y supervisado por cateterismo cardíaco en ratones

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Un modelo ortotópico de cáncer de vejiga de Estudios de liberación de genes

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Ligadura del conducto biliar en los ratones: Inducción de la injuria hepática inflamatoria y fibrosis por colestasis obstructiva

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

Utilizando adeno-asociado virus como una herramienta para estudiar las barreras de retina en la enfermedad

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

Desarrollo de un modelo basado en la rata alfa-sinucleína para la enfermedad de Parkinson mediante inyección estereotáctica de un vector viral adeno-asociado recombinante

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

El infarto de miocardio en ratones recién nacidos, un modelo de regeneración cardiaca

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Enfoque del Canal Semicircular posterior para la entrega del Gene de oído interno en ratón Neonatal

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...